金黃色葡萄球菌耐藥性分布特征及分子流行病學(xué)研究

叢萌倩

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，青海西寧 810001)

金黃色葡萄球菌(SA)是環(huán)境中廣泛分布的一種革蘭陽性菌，通常定植于鼻黏膜、皮膚組織等皮膚表面，從而引起包括皮膚和軟組織在內(nèi)的局部化膿性感染，嚴(yán)重時(shí)也可引起心內(nèi)膜炎、腦膜炎、敗血癥、膿毒癥等全身感染，是導(dǎo)致院內(nèi)感染的重要致病菌[1]。伴隨著抗菌藥物的廣泛使用，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)迅速擴(kuò)散到世界各地。早期發(fā)現(xiàn)的MRSA菌株由于來源于住院患者，一般被稱為醫(yī)院獲得性MRSA(HA-MRSA)，其耐藥性是由于SA攜帶了可水平移動(dòng)的耐藥元件葡萄球菌染色體mec基因盒(SCCmec)，隨著SCCmec的傳播，又出現(xiàn)了社區(qū)獲得性MRSA(CA-MRSA)[2]。根據(jù)中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(CHINET)的監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，2017年我國綜合性醫(yī)院檢出的MRSA在所有SA中的占比約為35.30%，且對青霉素、苯唑西林、紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星等臨床常見抗菌藥的耐藥性均在50.00%以上[3]。由于MRSA對多種抗菌藥物存在耐藥性，并且存在耐藥性從醫(yī)院向社區(qū)擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)，控制MRSA醫(yī)院內(nèi)感染的形勢十分嚴(yán)峻。本研究對2015年1月至2017年12月本院臨床科室送檢樣本進(jìn)行SA的檢測，并對其進(jìn)行MRSA的判定及耐藥性分析，同時(shí)通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法檢測殺白細(xì)胞素(pvl)基因攜帶情況，以明確本院SA菌株中MRSA的流行情況和耐藥情況，從而為臨床合理使用抗菌藥物并有效控制MRSA傳播提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來源

1.1.1臨床分離株 按照原衛(wèi)生部頒發(fā)的《醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)(試行)》[4]，收集本院2015年1月至2017年12月所有臨床送檢樣本(包括住院患者和門診患者)中分離并進(jìn)行鑒定的SA菌株，剔除重復(fù)菌株，同一患者只選取一株分離株進(jìn)行分析。

1.1.2標(biāo)準(zhǔn)菌株 ATCC25923為SA標(biāo)準(zhǔn)株，ATCC43300為MRSA標(biāo)準(zhǔn)株，購自上海北諾生物科技有限公司，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2研究方法

1.2.1菌株鑒定 SA的鑒定根據(jù)《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第4版)的流程進(jìn)行[5]；MRSA的鑒定采用美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2016版推薦的紙片擴(kuò)散法(K-B法),篩選30 μg頭孢西丁藥片抑菌環(huán)直徑≤21 mm的菌株[6]，然后通過PCR擴(kuò)增mecA基因，K-B法耐藥和mecA基因陽性的菌株判定為MRSA。

1.2.2藥敏試驗(yàn) 根據(jù)CLSI 2016的K-B法[6]，檢測SA菌株對臨床常見10種抗菌藥物的藥物敏感性，檢測的抗菌藥物包括：青霉素、紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星、阿莫西林、慶大霉素、利福平、頭孢唑啉、復(fù)方磺胺甲噁唑、萬古霉素。

1.2.3DNA提取及基因檢測 總DNA提取采用煮沸法，挑取血平板上生長良好的SA單克隆，接種到200 μL TE緩沖液(pH 8.0，含15 U/mL溶葡球菌酶)配制為菌懸液，35 ℃水浴30 min后，沸水浴10 min，12 000 g離心5 min，收集含有細(xì)菌DNA的上清液，-20 ℃凍存?zhèn)溆?；采用PCR檢測菌株攜帶pvl基因情況。PCR反應(yīng)體系及引物參見徐銀海等[7]文獻(xiàn)報(bào)道。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件和Microsoft Office Excel2000進(jìn)行分析處理。分類資料采用構(gòu)成比表示，分類資料組間比較采用χ2檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1SA菌株分布情況 2015年1月至2017年12月本院實(shí)驗(yàn)室共收集SA臨床分離株441株，其中406株來源于住院患者，35株來源于門診患者。通過K-B法結(jié)合mecA基因擴(kuò)增，結(jié)果見圖1。共檢出MRSA 147株，總檢出率為33.33%，其中住院患者樣本檢出145株，占住院患者樣本的35.71%，門診患者樣本檢出2株，占門診樣本的5.71%，住院患者的MRSA檢出率顯著高于門診患者的檢出率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.05，P<0.001)。MRSA檢出情況按年分布結(jié)果見圖2，各組別各年份MRSA的檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2015年MRSA總檢出率為36.69%，其中住院患者樣本MRSA檢出率為39.84%，門診患者為0；2016年MRSA總檢出率為32.89%，住院患者樣本MRSA檢出率為35.25%，門診患者樣本MRSA檢出率為7.69%；2017年MRSA總檢出率為30.67%，住院患者樣本MRSA檢出率為32.37%，門診患者樣本MRSA檢出率為9.09%。

注：M為DNA標(biāo)志物；N為陰性對照；P為陽性對照(310 bp)；1～4為檢測樣本，其中2為mecA陰性，其余為陽性。

圖1 mecA基因擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 2015-2017年MRSA菌株的檢出率

2.2SA菌株對抗菌藥的敏感率 對SA菌株進(jìn)行常見10種抗菌藥物的敏感試驗(yàn)，結(jié)果見表1。除萬古霉素以外，住院患者來源的SA菌株耐藥率普遍高于門診患者來源的SA菌株。無論是住院患者還是門診患者，分離到的SA菌株對青霉素都呈現(xiàn)普遍耐藥，耐藥率分別為100.00%和88.57%。住院患者來源的SA菌株對紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星、阿莫西林、慶大霉素、頭孢唑啉的耐藥率均大于50.00%，而門診患者來源的SA菌株對以上藥物的耐藥率均未超過50.00%。所有SA菌株對利福平和復(fù)方磺胺甲噁唑的耐藥率均比較低，總體耐藥率分別為7.26%和12.02%，未發(fā)現(xiàn)對萬古霉素有耐藥性的SA菌株。

表1 不同樣本來源SA菌株對常見抗菌藥的耐藥率[n(%)]

2.3SA菌株的毒力基因pvl攜帶情況及與耐藥的關(guān)系 應(yīng)用PCR擴(kuò)增pvl基因，共檢出28株SA攜帶pvl基因，總體攜帶率為6.35%(結(jié)果見圖3和表2)，其中21株來自于住院患者樣本(5.17%)，另外7株來自于門診患者樣本(20.00%)，門診患者來源的樣本pvl基因攜帶率明顯高于住院患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.91，P=0.001)。

注：M為DNA標(biāo)志物；N為陰性對照；P為陽性對照(430 bp)；1～5為檢測樣本，其中2和3為pvl陽性，其余為陰性。

圖3 pvl基因擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

表2 不同樣本來源SA菌株的pvl基因攜帶情況

注：a住院患者數(shù)據(jù)和門診患者數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。

SA菌株按照是否攜帶pvl基因，進(jìn)一步分層分析其與抗菌藥耐藥的關(guān)系，結(jié)果見表3。pvl攜帶情況僅與復(fù)方磺胺甲噁唑的耐藥性相關(guān)，pvl“-”菌株的耐藥性略高(χ2=4.08，P=0.043)，pvl是否陽性與其他檢測抗菌藥藥物的耐藥性沒有顯著關(guān)聯(lián)。

表3 pvl基因攜帶與常見抗菌藥耐藥的關(guān)系[n(%)]

注：-表示未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 討 論

以MRSA為代表的耐藥SA感染，在使用抗菌藥物治療時(shí)極易取代敏感株變成流行株從而導(dǎo)致治療失敗，已經(jīng)成為臨床治療需要重視的問題。本研究對臨床樣本中SA菌株進(jìn)行耐藥性檢驗(yàn)，可以了解MRSA等耐藥菌株的流行趨勢，同時(shí),為臨床的合理用藥、提高治療效率提供依據(jù)。

徐小玲等[8]對2012年1月至2012年12月國內(nèi)醫(yī)院MRSA感染率文獻(xiàn)進(jìn)行薈萃分析，發(fā)現(xiàn)MRSA感染率為33.50%～92.61%。最近5年CHINET的監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，MRSA的檢出率出現(xiàn)了持續(xù)下降，2017年34所醫(yī)院MRSA的檢出率在10.30%～62.10%[3,9-10]。本院MRSA檢出率從2014年的36.69%下降到30.67%，處于中間水平，雖然各年份之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是總體趨勢出現(xiàn)了下降，提示最近幾年醫(yī)院的MRSA防控工作有一定效果。本研究還發(fā)現(xiàn)MRSA檢出率與樣本來源有關(guān)，住院患者樣本的MRSA檢出率顯著高于門診患者樣本的MRSA檢出率，這應(yīng)該與住院患者往往需長期使用抗菌藥物,且治療期間有侵入性操作相關(guān)，同時(shí),住院時(shí)間較長和輾轉(zhuǎn)科室較多也是MRSA檢出率高的危險(xiǎn)因素[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，住院患者樣本的SA菌株耐藥率普遍高于門診患者樣本，這與國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道一致[12-14]。住院患者樣本的SA耐藥株呈現(xiàn)出對青霉素的普遍耐藥，住院患者的SA菌株對阿莫西林和頭孢唑啉的耐藥率也高于50.00%，提示在臨床治療時(shí)對于住院患者出現(xiàn)SA感染，選擇β-內(nèi)酰胺類藥物的效果可能會(huì)很差，但是對于門診患者，還是可以選擇青霉素類之外的其他β-內(nèi)酰胺類藥物。研究中的SA菌株，對于紅霉素和克林霉素的耐藥率也比較高，所以臨床治療也應(yīng)盡量不選擇大環(huán)內(nèi)酯類和林可酰胺類藥物。對于門診患者，其他抗菌藥的耐藥率均比較低，所以臨床治療的選擇比較多，但是住院患者的SA菌株還對左氧氟沙星和慶大霉素有較高的耐藥率，只對利福平、復(fù)方磺胺甲噁唑、萬古霉素普遍敏感。所以，對于住院患者SA感染的治療可選擇的藥物種類明顯減少。萬古霉素等糖肽類抗菌藥物是目前應(yīng)對細(xì)菌感染的最后一道防線，雖然本研究未檢出對萬古霉素耐藥的SA菌株，但是研究發(fā)現(xiàn)MRSA比一般敏感菌株對萬古霉素的敏感性降低[15]，因此，臨床上更需重視菌株耐藥性的監(jiān)測。

pvl是SA菌株分泌的一種溶細(xì)胞毒素，可以作用于巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞，造成大量白細(xì)胞的損傷，從而導(dǎo)致死亡等嚴(yán)重的感染結(jié)局，是SA菌株毒力的重要來源[16]。目前研究表明，pvl基因與CA-MRSA感染存在相關(guān)性，通常認(rèn)為攜帶pvl基因是CA-MRSA的重要特征[17]。本研究pvl攜帶率為6.35%，比葉千紅等[18]和楊穎等[19]報(bào)道的檢出率要低，而與曾云祥等[20]報(bào)道的檢出率接近，比國內(nèi)研究報(bào)道的檢出率要高[7,13,21]，這可能與地區(qū)差異有關(guān)。門診患者來源的SA菌株其pvl基因分離率顯著高于住院患者樣本的分離率，說明pvl基因主要來源為社區(qū)獲得，與目前已有[18]的報(bào)道一致。pvl+與pvl-的SA菌株對除復(fù)方磺胺甲噁唑以外的常見抗菌藥耐藥率沒有顯著差異，這與楊穎等的報(bào)道一致[19]。pvl-的SA菌株對復(fù)方磺胺甲噁唑的耐藥性略高，但是考慮到SA菌株對復(fù)方磺胺甲噁唑普遍敏感，且對復(fù)方磺胺甲噁唑耐藥的菌株總體數(shù)量較少，所以，臨床治療使用復(fù)方磺胺甲噁唑依然能取得較高的治療效果。值得注意的是，pvl攜帶情況雖然與抗菌藥耐藥沒有明顯關(guān)聯(lián)，但是因?yàn)閜vl毒素與壞死性肺炎存在顯著相關(guān)，近年來關(guān)于pvl+的SA菌株感染導(dǎo)致死亡病例逐漸增加，因此，臨床還是需要重視對此類SA菌株的治療[22-23]。

4 討 論

本院臨床分離的SA菌株中MRSA檢出率在2015-2017年未見明顯變化，且pvl基因攜帶率較低，但對多種常見抗菌藥物有較高耐藥率，住院患者樣本的MRSA檢出率和耐藥率均高于門診患者，今后需要注意臨床合理用藥并加強(qiáng)對SA感染的監(jiān)測，有效控制耐藥株的產(chǎn)生和流行。