外周血單個(gè)淋巴細(xì)胞遺傳分析及其在遺傳性疾病診斷中的應(yīng)用*

李 丹，邱 萍，嚴(yán)愛貞，林炎鴻，曾 健，王志紅，蘭風(fēng)華

(廈門大學(xué)附屬東方醫(yī)院全軍檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所臨床遺傳與實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，福建福州 350025)

單細(xì)胞研究于生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域有著重要的意義，其被列為未來最值得關(guān)注的研究領(lǐng)域之一。單細(xì)胞分離是實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞研究的基礎(chǔ)，現(xiàn)有的分離技術(shù)有熒光激活細(xì)胞分選法、激光捕獲顯微切割、免疫磁珠法、微流控技術(shù)、連續(xù)稀釋分離法、顯微操作分離法等[1-2]。熒光激活細(xì)胞分選法、激光捕獲顯微切割、微流控技術(shù)等需依賴特殊的儀器，分選費(fèi)用高，難以普及；連續(xù)稀釋分離法操作簡(jiǎn)單，但大量存在的空白孔和多細(xì)胞孔需要研究人員觀察排除，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。本研究結(jié)合稀釋法及體視鏡下可視化顯微操作，意在建立快速、簡(jiǎn)易、準(zhǔn)確的單細(xì)胞分離技術(shù)，并采用基于多重退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(MALBAC)[3]，旨在獲得高覆蓋度的單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增(WGA)產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)遺傳性疾病的診斷。

1 材料與方法

1.1材料 經(jīng)廈門大學(xué)附屬東方醫(yī)院門診收集11例體檢健康者，β-珠蛋白生成障礙性貧血(β41-42M/βN型雜合突變個(gè)體)、法布里病(GLA基因第601位堿基由T突變?yōu)镚，雜合突變個(gè)體)、先天性腎病綜合征(NPHS1基因第274位堿基由G突變?yōu)锳，雜合突變個(gè)體)攜帶者(各1例，每例后續(xù)均進(jìn)行3次單細(xì)胞WGA)乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝新鮮外周血。

1.2儀器與試劑 儀器：自制單細(xì)胞分離裝置；體視鏡(Leica)；細(xì)胞培養(yǎng)皿(BD Falcon)；PCR反應(yīng)儀(珠海黑馬)；凝膠電泳儀、凝膠成像分析儀(北京六一)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(珠海黑馬)。試劑:淋巴細(xì)胞分離液(Axi-shield)；單細(xì)胞WGA試劑盒(江蘇億康)；PCR-反向點(diǎn)雜交試劑盒(亞能生物)；rTaq DNA聚合酶(Takara)。

1.3方法

1.3.1外周血淋巴細(xì)胞分離 外周血、PBS緩沖液等體積(均約2 mL，實(shí)驗(yàn)所涉及的PBS不含Mg2+、Ca2+)混勻加入含3 mL淋巴細(xì)胞分離液于離心管內(nèi)，2 000 r/min 20 ℃水平離心20 min，吸取分離液與血漿間的白膜層；吸取液內(nèi)加入5 mL PBS緩沖液混勻，1 500 r/min 20 ℃水平離心10 min，棄上清液；加入2 mL紅細(xì)胞裂解液孵育5 min，500×g離心5 min，棄裂解液；加入5 mL PBS緩沖液，1 200 r/min 20 ℃離心10 min，棄上清液，重復(fù)操作1次；加入1 mL PBS緩沖液重懸，分離前后分別制備細(xì)胞涂片評(píng)估分離效果。

1.3.2單個(gè)淋巴細(xì)胞分離 細(xì)胞培養(yǎng)皿上加1 μL細(xì)胞重懸液，補(bǔ)PBS形成體積約7 μL的液滴。連于自制單細(xì)胞分離裝置的移液器，量程調(diào)至60 μL，在體視鏡下自液滴吸取100～200個(gè)細(xì)胞打至培養(yǎng)板空白位置，補(bǔ)PBS形成7 μL新液滴；自新液滴吸取10～50個(gè)細(xì)胞，打至新的位置并補(bǔ)加PBS，如此反復(fù)至每個(gè)體視鏡80倍視野僅可見2～3個(gè)細(xì)胞；將移液器量程調(diào)至30 μL，在鏡下緩慢吸取單個(gè)細(xì)胞，吸取到單個(gè)細(xì)胞后輕推可見單細(xì)胞從針口跳出，將單細(xì)胞吸回直接打入滅菌PCR反應(yīng)管。

1.3.3單細(xì)胞WGA 采用億康MALBAC單細(xì)胞WGA試劑盒，嚴(yán)格按照說明書步驟操作，產(chǎn)物初定量及瓊脂糖凝膠電泳后行后續(xù)擴(kuò)增。

1.3.4一代測(cè)序檢測(cè)目的基因 比較WGA產(chǎn)物及對(duì)應(yīng)外周血DNA目的基因一代測(cè)序結(jié)果，探討本研究對(duì)遺傳疾病診斷的價(jià)值。所涉及的引物見表1。

表1 目的基因擴(kuò)增所用引物序列

PCR體系如下：10×緩沖液2.5 μL，2.5 μmoL dNTP 0.8 μL，rTaq酶0.2 μL，模板1 μL，純水19.5 μL。反應(yīng)條件：(1)變性95 ℃ 3 min。(2)擴(kuò)增95 ℃ 30 s，相應(yīng)的退火溫度30 s，72 ℃ 1 min，擴(kuò)增重復(fù)35個(gè)循環(huán)(退火溫度：HBB 56 ℃；GLA 55 ℃；NPHS1 60 ℃)。HBB、GLA、NPHS1預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長度分別為519 bp、433 bp、318 bp，瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)清晰目的條帶的產(chǎn)物即送公司測(cè)序。

1.3.5PCR-反向點(diǎn)雜交法驗(yàn)證 HBB基因雜合突變個(gè)體單細(xì)胞WGA產(chǎn)物行PCR-反向點(diǎn)雜交法探討本研究對(duì)β-珠蛋白生成障礙性貧血臨床常規(guī)診斷的價(jià)值，操作嚴(yán)格按照PCR-反向點(diǎn)雜交試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1外周血單個(gè)淋巴細(xì)胞的分離 淋巴細(xì)胞分離液處理前外周血白細(xì)胞以分葉核中性粒細(xì)胞為主，平均占比63%，分離后淋巴細(xì)胞平均占比94%，如圖1所示，分離效果良好。經(jīng)紅細(xì)胞裂解液處理背景紅細(xì)胞未完全消失，但為了避免有核細(xì)胞的破壞，無需進(jìn)一步處理少量存在的背景紅細(xì)胞。

注： A為處理前，以分葉核中性粒細(xì)胞為主；B為處理后，鏡下主要為淋巴細(xì)胞。

圖1 淋巴細(xì)胞分離液處理前后高倍鏡視野下細(xì)胞組成(×400倍，吉姆薩染色)

2.2單細(xì)胞WGA產(chǎn)物 單細(xì)胞WGA產(chǎn)物的核酸濃度波動(dòng)于200～787 ng/μL，每個(gè)反應(yīng)體系約67.9 μL，總核酸量均大于13 μg，初步純度測(cè)定A260/A280約為1.4。瓊脂糖凝膠電泳示所有樣本均擴(kuò)增成功，產(chǎn)物的片段長度為250～2 000 bp，與說明書片段參考范圍基本一致。見圖2。

2.3目的基因的擴(kuò)增成功率 以單細(xì)胞WGA產(chǎn)物為模板分別擴(kuò)增目的基因HBB、GLA、NPHS1，瓊脂糖凝膠電泳示擴(kuò)增成功率為100%，但某些樣本擴(kuò)增時(shí)會(huì)出現(xiàn)非特異性條帶、目的條帶較淺的情況。見圖3、4。

注：M為DNA標(biāo)記物；1、2、3、4：?jiǎn)渭?xì)胞樣本；N為陰性對(duì)照；P為陽性對(duì)照。

圖2 部分樣本單細(xì)胞WGA電泳圖

2.4目的基因一代測(cè)序 健康者WGA產(chǎn)物目的基因測(cè)序結(jié)果與genebank登入的目的基因序列一致，攜帶者WGA產(chǎn)物目的基因測(cè)序則能夠準(zhǔn)確顯示發(fā)生突變的位點(diǎn)，但與外周血DNA目的基因測(cè)序相比，單細(xì)胞WGA產(chǎn)物目的基因測(cè)序干擾較大，易引入突變。

2.5β-珠蛋白生成障礙性貧血PCR-反向點(diǎn)雜交 HBB基因發(fā)生CD41/42雜合突變的個(gè)體單細(xì)胞WGA產(chǎn)物除了利用一代測(cè)序進(jìn)行珠蛋白生成障礙性貧血診斷準(zhǔn)確性研究外，還利用PCR-反向點(diǎn)雜交探討了其對(duì)于β-珠蛋白生成障礙性貧血臨床常規(guī)診斷的價(jià)值，結(jié)果顯示W(wǎng)GA產(chǎn)物可應(yīng)用于含CD41/42突變的β-珠蛋白生成障礙性貧血常規(guī)診斷。

注：M為DNA標(biāo)記物；A、B、C分別代表HBB、GLA、NPHS1基因擴(kuò)增情況；P為陽性對(duì)照；N為陰性對(duì)照；1～4為以WGA產(chǎn)物為模板的擴(kuò)增。

圖3 部分健康對(duì)照人群?jiǎn)渭?xì)胞WGA產(chǎn)物目的基因擴(kuò)增情況

注：M為DNA標(biāo)記物；A、B、C分別代表HBB、GLA、NPHS1基因擴(kuò)增情況；P為陽性對(duì)照；N為陰性對(duì)照；1～2為以WGA產(chǎn)物為模板的擴(kuò)增。

圖4 部分?jǐn)y帶者單細(xì)胞WGA產(chǎn)物目的基因擴(kuò)增情況

3 討 論

單細(xì)胞為生物體最基本的結(jié)構(gòu)和功能單位，單細(xì)胞分析可以研究生物體的生長、發(fā)育、成熟過程[4-5]；打破傳統(tǒng)細(xì)胞生物學(xué)研究的局限，使細(xì)胞研究從群體水平向個(gè)體水平發(fā)展，揭示各組織細(xì)胞間異質(zhì)性的存在[4,6-7]；單細(xì)胞WGA及高通量分析技術(shù)的發(fā)展則突顯了微量細(xì)胞如宮頸脫落滋養(yǎng)層細(xì)胞、母體循環(huán)胎兒細(xì)胞或者循環(huán)腫瘤細(xì)胞的臨床價(jià)值[8-11]；另外，單細(xì)胞分析在微生物研究中也發(fā)揮著重要作用[12]。

本研究利用單細(xì)胞分析實(shí)現(xiàn)了β-珠蛋白生成障礙性貧血、法布里病、先天性腎病綜合征的診斷。研究采用手工顯微操作分離單個(gè)淋巴細(xì)胞，該分離方法結(jié)合了連續(xù)稀釋法及顯微操作法，取材簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便、直觀可行，較連續(xù)稀釋法更能準(zhǔn)確地分離出單個(gè)核細(xì)胞,且不需要特殊的儀器，易于普及。分離的單個(gè)淋巴細(xì)胞采用改良的WGA方法MALBAC進(jìn)行擴(kuò)增，該法擴(kuò)增偏倚較傳統(tǒng)方法顯著降低，覆蓋度可達(dá)93%以上[3,13-14]。WGA產(chǎn)物目的基因的擴(kuò)增成功率為100%，經(jīng)測(cè)序鑒定可正確診斷疾病，還可用于β-珠蛋白生成障礙性貧血臨床常規(guī)診斷。

值得注意的是，某些WGA產(chǎn)物目的基因擴(kuò)增中會(huì)引入非特異性條帶，猜想與樣本間WGA擴(kuò)增質(zhì)量的差別、模板純度低、無法準(zhǔn)確統(tǒng)一模板量相關(guān)。另外，對(duì)目的基因測(cè)序中WGA產(chǎn)物的干擾要大于外周血DNA，且易于引入無關(guān)突變，可能與MALBAC所用的Taq聚合酶保真性不高相關(guān)[15]。為了提高對(duì)遺傳性疾病診斷的可靠性，研究中需進(jìn)行以下改進(jìn)：建立相應(yīng)的方法評(píng)估單細(xì)胞WGA產(chǎn)物擴(kuò)增質(zhì)量，純化擴(kuò)增產(chǎn)物保證模板質(zhì)與量，多個(gè)單細(xì)胞WGA結(jié)合分析克服擴(kuò)增方法固有缺陷，正反向測(cè)序分析相結(jié)合排除假突變。

4 結(jié) 論

本研究采用單細(xì)胞簡(jiǎn)易手工顯微操作分離技術(shù)與單細(xì)胞WGA技術(shù)對(duì)外周血單個(gè)淋巴細(xì)胞行遺傳分析實(shí)現(xiàn)了3種遺傳病的準(zhǔn)確診斷，為更多學(xué)者開展單細(xì)胞水平的遺傳研究如采用單個(gè)胎兒體細(xì)胞實(shí)現(xiàn)產(chǎn)前遺傳病診斷提供了思路，但研究還需改進(jìn)以保證診斷的準(zhǔn)確性。