PD-1在類風濕關(guān)節(jié)炎外周血T淋巴細胞亞群表達的臨床意義*

段厚全，葉小英，葛 彥，居頌光△

(1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院免疫學(xué)系，江蘇蘇州215123；2.江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院檢驗科，江蘇昆山215300)

近年來程序性死亡配體-1(PD-1)備受大家關(guān)注，研究者們探討了PD-1在各種疾病中的作用[1]，PD-1作為負性共刺激分子在自身免疫性疾病中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用[2-4]。類風濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種常見的自身免疫性疾病，其發(fā)病機制尙未明確，而PD-1可能在其發(fā)病機制中起重要作用。RA常見的臨床實驗室檢測指標有紅細胞沉降率(ESR)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(抗CCP抗體)、類風濕因子(RF)等，各項指標都有各自的優(yōu)點及不足之處。本研究探討PD-1在RA外周血T淋巴細胞的表達情況及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院2016年1-12月的RA患者78例，其中女68例、男10例；年齡19～77歲，平均(49.82±14.18)歲；其均已被江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院風濕免疫?？拼_診，并以類風濕關(guān)節(jié)炎患者評分(DAS28)[5]為標準將其分為活動期與緩解期(DAS28≥2.6為活動期，DAS28<2.6為緩解期)，其中活動期患者有44例，緩解期患者有34例，并追蹤觀察了其中的部分患者，2016年1-12月這些患者中有6例患者經(jīng)治療由活動期轉(zhuǎn)為緩解期。另選取同期江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院體檢中心的體檢健康者31例為對照組，其中男3例，女28例；年齡22～71歲，平均(49.42±12.11)歲。統(tǒng)計兩組年齡、性別等差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。排除感染、腫瘤、其他自身免疫性疾病和風濕免疫性疾病及其他骨關(guān)節(jié)疾病。

1.2儀器與試劑 主要試劑：FITC-標記小鼠同型對照、FITC-Mouse Anti-Human CD3、PE-Mouse Anti-Human CD4、PE-Mouse Anti-Human CD8、FITC-Mouse Anti-Human PD-1均由美國BD Biosciences 公司生產(chǎn)。主要儀器： BD FACSCalibur流式細胞儀(美國)。

1.3試驗方法 抽取對照組及RA患者靜脈血2 mL于EDTA-K2抗凝真空采血管中，其均在清晨空腹時采集。使用BD FACSCalibur流式細胞儀對樣本進行檢測，所有樣本均在6 h內(nèi)檢測完畢，其具體實驗步驟如下。

1.3.1加抗體 取8根BD FACSCalibur流式細胞儀專用配套試管，第 1 管不加任何試劑作為陰性對照，其余試管內(nèi)分別加入對應(yīng)的FITC-Mouse Anti-Human CD3 抗體、 PE-Mouse Anti-Human CD4抗體、PE-Mouse Anti-Human CD8抗體和FITC-Mouse Anti-Human PD-1抗體。

1.3.2加血及染色 取患者靜脈血50 μL加入每根試管中，充分震蕩混勻，室溫(25 ℃)避光染色15 min。

1.3.3溶血 在每根試管中加溶血素1 L，振蕩混勻后避光保存在室溫(25 ℃)下15 min，使其充分溶血。

1.3.4離心及上機檢測 以2 000 r/min離心3 min；棄上清液后每管加入500 μL緩沖液，充分混勻后用BD FACSCalibur流式細胞儀進行檢測。

2 結(jié) 果

2.13組外周血中PD-1的表達水平比較 PD-1在RA患者外周血中的表達水平活動組高于緩解組和對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)，緩解組高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見表1和圖1、圖2。

表1 3組外周血中PD-1的表達水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與緩解組比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.2RA活動期CD4+PD-1+T、CD8+PD-1+T與ESR、CRP、RF及抗CCP抗體的陽性率比較 在RA活動期CD4+PD-1+T細胞與CD8+PD-1+T細胞的陽性率高于ESR、CRP、RF，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而與抗CCP抗體陽性率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3、表4。

表2 RA活動期CD4+PD-1+T與ESR、CRP、RF及抗CCP抗體的陽性率比較[n(%),n=44]

注：與CD4+PD-1+T比較，*P<0.05，**P<0.01；-表示無數(shù)據(jù)。

2.3RA患者PD-1與ESR、CRP、抗CCP抗體的相關(guān)性 RA患者外周血PD-1的表達與ESR、CRP呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，與抗CCP抗體無相關(guān)(P>0.05)，結(jié)果見表2和圖3、圖4。

圖1 流式細胞術(shù)檢測3組外周血CD4+PD-1+T淋巴細胞

圖2 流式細胞術(shù)檢測3組外周血CD8+PD-1+T淋巴細胞

圖3 RA患者CD4+PD-1+T與ESR、CRP、抗CCP抗體的相關(guān)性比較

圖4 RA患者CD8+PD-1+T與ESR、CRP、抗CCP抗體的相關(guān)性比較

表3 RA患者中PD-1與ESR、CRP、抗-CCP的相關(guān)性

注：*P<0.05，**P<0.01。

表4 RA活動期CD8+PD-1+T與ESR、CRP、RF及抗CCP抗體的陽性率比較[n(%),n=44]

注：與CD8+PD-1+T比較，*P<0.05，**P<0.01；-表示無數(shù)據(jù)。

2.4RA緩解期CD4+PD-1+T、CD8+PD-1+T與ESR、CRP、RF及抗CCP抗體的陽性率比較 在RA緩解期CD4+PD-1+T細胞與CD8+PD-1+T細胞的陽性率高于ESR、CRP、RF，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而與抗CCP抗體陽性率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表5、表6。

2.5同1例RA患者活動期與緩解期外周血PD-1水平比較 同1例RA患者其外周血PD-1水平活動期明顯高于緩解期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表7。

表5 RA緩解期CD4+PD-1+T與ESR、CRP、RF及抗CCP抗體的陽性率比較[n(%)，n=34]

注：與CD4+PD-1+T比較，*P<0.05，**P<0.01；-表示無數(shù)據(jù)。

表6 RA緩解期CD8+PD-1+T與ESR、CRP、RF及抗CCP抗體的陽性率比較[n(%)，n=34]

注：與CD8+PD-1+T比較，*P<0.05，**P<0.01；-表示無數(shù)據(jù)。

表7 同1例RA患者活動期與緩解期外周血PD-1水平比較

注：與緩解組比較，*P<0.05。

3 討 論

至今RA的發(fā)病機制尚未完全明確，而眾多學(xué)者認為RA是T細胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，T細胞的活化在RA免疫病理過程中可發(fā)揮重要作用[4]。PD-1是重要的負性共刺激分子，其提供的負性共刺激信號在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[6-7]。有小鼠試驗也證實了PD-1的負性調(diào)控作用[8-9]。根據(jù)疾病活動度以DAS28評分[5]為依據(jù)可將RA患者分為活動期與緩解期，活動期DAS28≥2.6，緩解期DAS28<2.6。而本實驗探討PD-1在RA不同時期外周血T淋巴細胞的表達情況及其臨床意義。通過圖1及表1可看出，在RA外周血中CD4+PD-1+T%淋巴細胞活動期(38.83±10.30)明顯高于緩解期(25.36±4.51)高于健康對照組(21.60±4.27)(P<0.01)，緩解期高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，并且活動期增加得更明顯。這說明隨著RA病情的進展，疾病活動度越高病情越嚴重，則CD4+PD-1+T淋巴細胞的表達就越高。這一現(xiàn)象在其他學(xué)者的研究中也有體現(xiàn)[4，10]。從圖2和表1中可以看出，在RA中CD8+PD-1+T淋巴細胞與CD4+PD-1+T淋巴細胞有相同的表現(xiàn)，其在RA活動期(29.71±6.98)高于緩解期(21.19±4.51)和健康對照組(16.81±3.74)，其差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，這說明CD8+PD-1+T淋巴細胞隨著RA病情的進展也是逐漸增高的[4,11]。為了進一步證實這一結(jié)果，本研究追蹤了部分患者并發(fā)現(xiàn)同1例RA患者其CD4+PD-1+T細胞和CD8+PD-1+T細胞在疾病活動期明顯高于緩解期，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(表7)，這也更加說明PD-1在RA的發(fā)病病理機制中可能起重要作用。由以上數(shù)據(jù)分析可見在RA中其外周血PD-1的變化能很好地反映RA患者病情的變化情況[12]。

該研究統(tǒng)計了RA患者的CRP、ESR等指標，并與其外周血PD-1進行了比較。由表2及圖3可見，CD4+PD-1+T淋巴細胞與CRP、ESR等臨床檢測指標呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，而與抗CCP抗體無明顯相關(guān)性(P>0.05)；由表2及圖4可見，CD8+PD-1+T淋巴細胞與ESR、CRP呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，而與抗CCP抗體無明顯相關(guān)性(P>0.05)。ESR與CRP是計算RA疾病活動度(DAS28評分)的重要因子[5]，與疾病活動度密切相關(guān)，而PD-1也與疾病的嚴重程度密切相關(guān)[13-14]，所以PD-1與ESR和CRP呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)。PD-1與抗CCP抗體無明顯相關(guān),可能與其在RA中的作用特點有關(guān)，抗CCP抗體是由RA患者的B細胞分泌產(chǎn)生的一種特有的氨基酸肽，對RA具有較高的特異度，在RA的早期診斷中重要價值[15-16]，但PD-1是負性調(diào)控分子，為了抑制RA患者T細胞的大量活化，PD-1會高水平表達，并隨RA病情的進展呈逐漸上升趨勢，與疾病的嚴重程度密切相關(guān)[13-14]，其在RA發(fā)病機制中可能扮演有重要角色，故其在判斷病情變化方面比抗CCP抗體更有優(yōu)勢，所以抗CCP抗體可作為RA的早期診斷指標，而PD-1可考慮作為RA的病情分析指標。

通過觀察本文發(fā)現(xiàn)有一部分患者在其疾病活動期時其CRP、ESR、RF等檢測指標也為陰性，但實際上機體已受到免疫損傷，這時只檢測上述指標就會對病情判斷產(chǎn)生誤導(dǎo)，而PD-1能更好地反映患者的免疫狀況，檢測PD-1可以很好地彌補這一缺陷。因此,本研究對比分析了RA患者外周血PD-1的陽性表達率與RF、CRP、ESR和抗CCP抗體的陽性率。通過表3與表5可見,CD4+PD-1+T淋巴細胞在RA活動期與緩解期的陽性率均高于RF、CRP、ESR等指標；通過表4與表6可見,CD8+PD-1+T淋巴細胞在RA活動期與緩解期的陽性率也高于RF、CRP、ESR等指標。通過上述結(jié)果可見,PD-1在RA外周血中的陽性表達率高于RF、CRP、ESR等指標，所以檢測外周血PD-1有利于疾病的分析及病情判斷。分析其原因可能是由于PD-1是負性共刺激分子，能直接調(diào)控T細胞的活化程度和生存狀態(tài)[17]，是RA病理過程的直接和關(guān)鍵調(diào)控分子；而CRP等常用的臨床實驗室檢測指標是免疫細胞在免疫應(yīng)答過程中才產(chǎn)生的炎性因子或抗體，屬于體液免疫，從免疫病理過程角度考慮其屬于下游分子，因此PD-1能更精準地反映RA患者的病情變化[4]。

4 結(jié) 論

PD-1在RA患者外周血中高表達并與疾病嚴重程度密切相關(guān)，PD-1與CRP、ESR等檢測指標密切相關(guān)，并且其陽性表達率高，PD-1可能在RA的免疫病理機制中起重要作用，檢測患者外周血PD-1水平對RA的臨床診斷與治療、病情觀察等都有積極意義，故PD-1作為新的臨床檢測指標用于RA有一定的應(yīng)用前景。