冠狀病毒復(fù)制分子生物學(xué)與防控措施研發(fā)進(jìn)展

張蕾，謝建平

(西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院現(xiàn)代生物醫(yī)藥研究所，重慶 400715)

新發(fā)和再現(xiàn)病原導(dǎo)致疾病爆發(fā)是全球性的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)。全球化、人口增加、生境丟失，接觸新宿主等因素疊加，動(dòng)物病毒跨種傳播對(duì)公共衛(wèi)生的威脅尤其突出。其中，冠狀病毒(Coronavirus,CoV)因?yàn)閷?dǎo)致嚴(yán)重新型冠狀病毒肺炎(Novel coronavirus pneumonia,NCP)的新型冠狀病毒2019-nCoV、導(dǎo)致嚴(yán)重急性呼吸綜合征相關(guān)冠狀病毒SARS-CoV(severe acute respiratory syndrome CoV)和中東呼吸綜合征相關(guān)冠狀病毒MERS-CoV(Middle East respiratory syndrome CoV)等備受關(guān)注。

冠狀病毒1937年最初從雞的感染組織中發(fā)現(xiàn)。冠狀病毒高度流行、分布廣泛，其基因組遺傳多樣性巨大(表1)、重組頻繁，加之人-動(dòng)物界面接觸增加，尤其是食用野生動(dòng)物，頻繁的跨物種感染和偶爾的溢出事件，新冠狀病毒有可能在人群中周期性出現(xiàn)。已知有七種冠狀病毒會(huì)引起人類疾病。除上述三種，另外四種冠狀病毒-人冠狀病毒(Human coronaviruses，HCoVs)-229E、HCoVOC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1，在免疫功能正常的個(gè)體中普遍存在，一般呈現(xiàn)普通感冒癥狀。其中HCoV-NL63、HCoV-229E和HCoV-OC43來自蝙蝠。冠狀病毒家族中鼻病毒是普通感冒的主要原因(約10%～30%)。有些冠狀病毒是家禽和家畜的重要致病菌，可引起呼吸道、腸道、肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。如鳥支氣管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Virus，AIBV)，豬腸胃炎病毒(Transmissible Gastro-Enteritis Virus,TGEV)，豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus)變異株，γ屬的禽傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)，豬急性腹瀉綜合征(SADS)等，這些病毒多次給世界畜牧業(yè)造成巨大損失。

表1 部分冠狀病毒及其宿主細(xì)胞受體

冠狀病毒也成為研究病毒-宿主相互作用的模式病毒。一般發(fā)生不明原因肺炎時(shí)，如果懷疑是冠狀病毒，首選需要通過測(cè)序、細(xì)胞培養(yǎng)分離等方法確定病原，為后續(xù)病毒溯源、病毒致病機(jī)理、動(dòng)物模型建立、疾病發(fā)生、發(fā)展和傳播規(guī)律及臨床診治、傳播力大小、快速檢測(cè)技術(shù)和產(chǎn)品研發(fā)、抗病毒應(yīng)急藥物和抗體類藥物、疫苗研發(fā)等相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。目前的測(cè)序技術(shù)和大數(shù)據(jù)可以快速鎖定病原。比如新冠肺炎致病菌的鎖定只用了一周左右。但是，因?yàn)槿狈?dòng)物模型，目前很難確定冠狀病毒感染致病的關(guān)鍵因子。

關(guān)于冠狀病毒的研究較多。截至2020年2月7日下午7點(diǎn)，本文研究利用coronavirus在NCBI genome中檢索到40個(gè)冠狀病毒基因組。其中最早的為1993年。截止2020年2月7日，用coronavirus檢索NCBI PubMed發(fā)現(xiàn)收錄文獻(xiàn)14673篇。用“冠狀病毒”檢索中國(guó)CNKI期刊庫(kù)發(fā)現(xiàn)4546篇，其中綜述195篇。2003年是世界上冠狀病毒研究的分水嶺。2003年以前，每年最多發(fā)表文章89篇，2003年以后，每年一般發(fā)表130篇以上。主要原因是2003年的非典型肺炎(SARS)和2012年的中東呼吸綜合征(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)，以及導(dǎo)致最近“新冠狀病毒肺炎”的2019新冠狀病毒(2019 novel coronavirus，2019-nCoV)疾病高度流行。研究中比較重要的進(jìn)展有：以SARS-CoV作為模式，綜合系統(tǒng)生物學(xué)和反向遺傳學(xué)技術(shù)，構(gòu)建動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)(Dynamic transcriptional network)，尋找疾病相關(guān)表型的宿主或病毒遺傳因子，以及探索人群水平的致病機(jī)理。

1 冠狀病毒基因組特征和主要宿主

冠狀病毒(圖1)屬于巢病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、正冠狀病毒亞科(Orthocoronavirinae)、冠狀病毒屬(Coronavirus)，是自然界廣泛存在、物種多樣的一大類有包膜、不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)27～32kb，螺旋狀核衣殼結(jié)構(gòu)外面包裹有脂雙層，可以感染人、牛、鼠、豬、貓、犬、雪貂、駱駝、兔子、蝙蝠與禽類等宿主。目前有α、β、γ和δ四個(gè)屬。β冠狀病毒是包膜性病毒。新型肺炎病毒2019-nCoV就屬于冠狀病毒科β冠狀病毒屬，與一種來自蝙蝠的冠狀病毒的序列一致性高達(dá)96%。該病毒經(jīng)飛沫、氣溶膠、接觸等途徑傳播，潛伏期感染者也具傳播性。目前數(shù)據(jù)表明：2019-nCoV比SARS-CoV毒力弱，但傳播力強(qiáng)?？赡?019-nCoV與SARS冠狀病毒使用相同的受體-血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)進(jìn)入宿主細(xì)胞。病毒S蛋白結(jié)合宿主細(xì)胞受體的能力是CoV在新物種中存活的關(guān)鍵，但不是唯一因素。

圖1 冠狀病毒形態(tài)示意圖(2019-nCoV)

一般RNA病毒的基因組都盡可能小，以避免錯(cuò)誤災(zāi)難(Error catastrophe)。CoV作為巢病毒目中基因組最大的成員，克服錯(cuò)誤災(zāi)難的方法是產(chǎn)生一個(gè)大的復(fù)制復(fù)合體(Replication complex)。該復(fù)合體包括非結(jié)構(gòu)蛋白(Nonstructural protein,nsp)nsp14的3'-5'核酸外切酶(Exoribonuclease)活性介導(dǎo)的校讀功能，具有RNA合成和修飾活性。這個(gè)巨大、復(fù)雜的RNA復(fù)制機(jī)器允許CoV基因組達(dá)到32kb，還能夠存活。冠狀病毒依賴RNA的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase，RdRp)的忠實(shí)性降低，突變更快，尤其是群體大，代時(shí)短，因此突變率高，遺傳變異大，與宿主細(xì)胞表面受體如二肽基肽酶4(Dipeptidyl peptidase 4，DPP4)相互作用的病毒S蛋白的突變、重組、高突變子位點(diǎn)(Mutator alleles)，突變穩(wěn)健性(Mutational robustness)等因素疊加使得冠狀病毒的宿主范圍不斷擴(kuò)大。根據(jù)選擇壓力，CoV蛋白可以分為三組：刺突蛋白、保守性蛋白和可變蛋白。新CoV出現(xiàn)，這三組蛋白的功能必需協(xié)調(diào)，既維持病毒關(guān)鍵功能，也克服種障礙。

以2019-nCoV為例(圖2)，透射電子顯微鏡下，負(fù)染色的2019-nCoV粒子通常是球形，具有多形性。直徑60～140nm。人氣道上皮超薄切片可見胞外游離病毒顆粒和胞質(zhì)膜結(jié)合小泡內(nèi)充滿病毒顆粒的包涵體[1]。

冠狀病毒的宿主很廣泛[2]。目前發(fā)現(xiàn)與人類肺炎關(guān)系密切的宿主都涉及蝙蝠。蝙蝠是包括冠狀病毒在內(nèi)的多種病毒重要宿主。人類聚居區(qū)附近攜帶病毒的蝙蝠容易將病毒傳播給人類和牲畜。這主要是蝙蝠進(jìn)化歷史悠久、地理多樣性強(qiáng)，季節(jié)性遷徙，物種多樣性和豐度高(大約占哺乳動(dòng)物多樣性的20%)、種群密度大、具有獨(dú)特免疫、生理等特征。蝙蝠攜帶多種CoV。目前，關(guān)于蝙蝠不發(fā)病的假說主要有以下幾種：(1)蝙蝠飛行產(chǎn)生大量活性氧(Reactive oxygen species,ROS)，活性氧調(diào)控基因表達(dá)，限制氧化脅迫，抑制病毒復(fù)制和致病。(2)蝙蝠多樣性的病毒庫(kù)可能與其獨(dú)特的先天免疫有關(guān)。蝙蝠因?yàn)槿狈ρ装Y體途徑的Pythin(PYRIN and HIN domain-containing)和天然殺傷免疫球蛋白樣受體KIR(natural killer immunoglobulin-like receptors)基因，或者極低的表達(dá)，病毒感染導(dǎo)致的疾病和損傷有限。蝙蝠組成性表達(dá)某些亞型的干擾素，既可以限制發(fā)病，也允許病毒低劑量存在。(3)病毒和蝙蝠可能是共生關(guān)系。病毒可能是蝙蝠微生物組中激發(fā)免疫的關(guān)鍵，類似人的皰疹病毒。另外，就疾病和適應(yīng)性免疫而言，腸道感染和呼吸道感染還是不同。病毒嗜性因物種和組織而異，這可能也是蝙蝠不發(fā)病的原因[3]。蝙蝠具有完整的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，腸道的病毒導(dǎo)致適應(yīng)性免疫強(qiáng)度較低，病毒可以維持在類似人微生物組成員滴度的水平。(4)蝙蝠有些因素可以維持病毒的存在，也促進(jìn)了CoV準(zhǔn)種(quasispecies)庫(kù)的多樣性。蝙蝠飛行過程中，可能短期積累ROS。ROS的突變效應(yīng)可以超過病毒聚合酶的校讀修復(fù)能力，改變病毒聚合酶忠實(shí)性，提高病毒物種多樣性，為跨種傳播提供基礎(chǔ)。蝙蝠連續(xù)產(chǎn)生I型干擾素可能選擇有利于突變的病毒物種，增強(qiáng)病毒對(duì)新宿主天然免疫的抗性，跨種傳播后復(fù)制更有優(yōu)勢(shì)。蝙蝠缺乏關(guān)鍵的炎癥介導(dǎo)因子，沒有降低這些免疫應(yīng)答的選擇壓力。病毒感染新宿主后，新宿主產(chǎn)生大量病理性炎癥應(yīng)答，這與在MERS-CoV和SARS-CoV感染人后觀察到的現(xiàn)象吻合。蝙蝠中大量病毒準(zhǔn)種存在的因素，也使得病毒具有多樣性，在新物種中出現(xiàn)。

2 冠狀病毒復(fù)制、包裝和與宿主相互作用的過程與關(guān)鍵分子[4-7]

圖2 冠狀病毒基因組結(jié)構(gòu)示意圖(以SARS-CoV為例)

認(rèn)識(shí)病毒復(fù)制、病毒-宿主相互作用是解決冠狀病毒防控措施的關(guān)鍵。冠狀病毒比其他正鏈RNA病毒的基因組大，基因表達(dá)策略復(fù)雜，蛋白質(zhì)組也大，與宿主相互作用復(fù)雜。病毒在宿主細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)，一方面用于病毒復(fù)制或者組裝，另一方面與宿主相互作用。為病毒復(fù)制提供更佳環(huán)境、改變宿主基因表達(dá)、拮抗宿主抗病毒策略。冠狀病毒蛋白質(zhì)組復(fù)雜，復(fù)制過程復(fù)雜。對(duì)于宿主因子在冠狀病毒復(fù)制中的作用、細(xì)胞中病毒RNA合成機(jī)器的組裝與功能，逃避宿主細(xì)胞先天免疫應(yīng)答的相關(guān)研究較少。

2.1 核酸合成酶

冠狀病毒基因組編碼兩個(gè)具有RNA依賴的RNA合成酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)活性的蛋白，即nsp12與nsp8，前者主要是利用引物合成長(zhǎng)鏈的基因組或者mRNA，后者利用RdRp活性合成短鏈RNA，作為引物供前者合成長(zhǎng)的RNA鏈，nsp8是冠狀病毒基因組合成起始階段的關(guān)鍵。

nsp14，ExoN與nsp10(在冠狀病毒中相對(duì)保守)形成復(fù)合體，介導(dǎo)3′-5′核酸外切酶(Exoribonuclease)活性，類似DNA聚合酶的校讀活性，具有DEDD 超家族。nsp14 DEDD突變后，突變率提高15～20倍。nsp10-nsp14復(fù)合體提高復(fù)制忠實(shí)性。基因重組、基因重復(fù)、旁系基因進(jìn)化、利用重疊讀框從頭產(chǎn)生等都可以獲得基因。尚待明確基因組擴(kuò)增、附屬基因是否有利于冠狀病毒擴(kuò)大宿主。

RNA病毒進(jìn)行基因組選擇性包裝。這是病毒侵入和破壞宿主先天免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵。許多包裝方式都涉及基因組包裝信號(hào)。對(duì)冠狀病毒基因組包裝的認(rèn)識(shí)主要來自兩個(gè)病毒：小鼠肝炎病毒(Mouse hepatitis virus)和傳染性腸胃炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus)。冠狀病毒第一個(gè)包裝信號(hào)發(fā)現(xiàn)了30多年，但對(duì)其功能認(rèn)識(shí)仍然不足。目前關(guān)于包裝信號(hào)研究的結(jié)論尚無(wú)一致意見。爭(zhēng)議主要體現(xiàn)在包裝信號(hào)識(shí)別過程中病毒核衣殼蛋白或膜蛋白是否發(fā)揮主要作用。

冠狀病毒具有獨(dú)特的非連續(xù)轉(zhuǎn)錄模式。基因組RNA 5′末端包括一個(gè)末端帽子結(jié)構(gòu)，其后是65～98個(gè)核苷酸大小的前導(dǎo)序列以及200～400個(gè)核苷酸大小的不譯區(qū)，3′末端則包括200～500個(gè)核苷酸大小的不譯區(qū)和poly(A)尾。冠狀病毒基因組RNA具有mRNA功能，有感染性。冠狀病毒是正鏈RNA病毒(Positivestranded RNA(正鏈RNA)viruses)，特殊之處是基因組大，約30kb。其基因組結(jié)構(gòu)為多順反子，利用獨(dú)特機(jī)制產(chǎn)生嵌套的亞基因組(Subgenomic,sg)mRNAs，用于表達(dá)位于復(fù)制酶(Replicase)ORFs 1a和1b下游的編碼結(jié)構(gòu)蛋白和輔助蛋白可讀框(Open reading frames,ORFs)(圖3)。sg mRNAs結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是共3′末端，也含有共同的5′前導(dǎo)序列。sg RNAs的前導(dǎo)序列和結(jié)構(gòu)序列在不連續(xù)的負(fù)鏈RNA合成中連接，提供每個(gè)sg mRNAs的亞基因組長(zhǎng)度的模板。

圖3 冠狀病毒復(fù)制和感染示意圖(以SARS-CoV為例)。

冠狀病毒復(fù)制酶基因轉(zhuǎn)錄的非結(jié)構(gòu)蛋白具有多種功能，如多聚蛋白加工、復(fù)制酶復(fù)合體的形成、病毒缺陷復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白合成、加工和修飾、感染宿主、結(jié)合宿主蛋白質(zhì)、調(diào)控毒力和疾病輕重等。深入研究非結(jié)構(gòu)蛋白有助于了解病毒的致病機(jī)制，為開發(fā)新型抗病毒藥物和研究病毒檢測(cè)和防控方法提供靶點(diǎn)。SARS-CoV、IBV、HCoV229E等冠狀病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白高度保守，研究SARS-Cov或IBV非結(jié)構(gòu)蛋白將有助于了解冠狀病毒。

復(fù)制與細(xì)胞膜組分密切相關(guān)，尤其是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic reticulum，ER)。被其感染的細(xì)胞呈現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫，誘導(dǎo)未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答(Unfolded protein response，UPR)，關(guān)閉全局性翻譯，增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊能力，試圖恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫過長(zhǎng)，UPR會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。冠狀病毒-宿主相互作用涉及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫和UPR。UPR涉及三條途徑，任何一條途徑被激活，如絲裂原活化蛋白激酶(Mitogenactivated protein(MAP) kinase)、自噬或者先天免疫應(yīng)答。病毒復(fù)制和致病可能得益于ER脅迫和UPR。不同凋亡途徑之間相互作用。

病毒粒子組裝和出芽：包膜病毒中，冠狀病毒特殊之處在于病毒包膜組裝發(fā)生在ERGIC。病毒粒子自此出芽進(jìn)入腔，再進(jìn)入宿主分泌途徑，最后出胞。M蛋白協(xié)調(diào)病毒組裝，病毒樣顆粒(svirus-like particle,VLP)的產(chǎn)生和釋放需要M和E。缺乏E蛋白編碼基因(ΔE)的重組冠狀病毒(Recombinant CoVs，rCoVs)形態(tài)異常。MHV E蛋白C-端殘基變?yōu)楸彼岷?，病毒粒子變得?duì)溫度敏感，更長(zhǎng)，而不是典型的球狀。病毒斑形態(tài)異常，小且不規(guī)則，邊緣鋸齒狀。重組SARS-CoV-ΔE(Recombinant SARS-CoVΔE，rSARS-CoVΔE)成熟病毒粒子減少，含致密顆粒物質(zhì)的小泡增多。這可能是病毒組裝失敗，病毒粒子不成熟。CoV E viroporin具有陽(yáng)離子選擇性，優(yōu)先通過單價(jià)的Na+和K+。合成SARS-CoV E類似viroporin，能夠運(yùn)輸Na+、K+和Cl-，對(duì)此顯示對(duì)Na+比K+選擇性強(qiáng)，對(duì)Cl-選擇性很弱。

核酸內(nèi)切酶(Endoribonuclease，EndoU)[8-10]：由非結(jié)構(gòu)蛋白(Nonstructural protein，nsp)nsp15編碼，nsp15具有尿苷酸特異性核酸內(nèi)切酶(U-specific endoribonuclease，NendoU)活性，327～375個(gè)氨基酸，38～42kDa，其N端參與蛋白之間的工作，C端包含酶活性區(qū)域，其活性區(qū)域在所有冠狀病毒中均保守。nsp15發(fā)揮活性依賴與Mn2+結(jié)合。它可作用于單鏈和雙鏈RNA，切除3'端GUU或GU序列的尿苷酸， 形成2'-3'三磷酸二酯環(huán)末端。Mn2+可激發(fā)酶活性，nsp15-Mn2+結(jié)合作用較弱，但這種結(jié)合可使蛋白構(gòu)象發(fā)生顯著變化。最早認(rèn)為是巢病毒目病毒復(fù)制復(fù)合體的組分。后來發(fā)現(xiàn)，nsp15缺陷的冠狀病毒在成纖維細(xì)胞中，也可以復(fù)制和存活，滴度甚至與野生型無(wú)異。EndoU介導(dǎo)病毒雙聯(lián)RNA逃避宿主巨噬細(xì)胞中傳感器的識(shí)別。病毒nsp15/EndoU在致病中的作用，以及作為藥物和疫苗設(shè)計(jì)的靶標(biāo)。

CoV E蛋白(Envelope，E)：76～109個(gè)氨基酸，分子量8.4～12kDa，膜整合蛋白，參與冠狀病毒生活史如病毒組裝、出芽、包膜形成和致病。對(duì)其結(jié)構(gòu)模體、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、離子通道(viroporin)，與病毒及宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的研究較多。冠狀病毒E蛋白經(jīng)歷多種蛋白質(zhì)翻譯后修飾。其中IBV、SARS-CoV、MHV和CoV E蛋白被棕櫚?；?。而棕櫚?；陌袠?biāo)是TMDs附近的半胱氨酸殘基。即MHVA59 E蛋白半胱氨酸雙突變或者三突變?yōu)楸彼岷?，形成VLP的能力降低。驗(yàn)證MHVE蛋白三突變后不穩(wěn)定，容易降解，突變菌株的產(chǎn)量降低，說明E蛋白在MHV病毒組裝中必不可少。提示IBV E蛋白棕櫚?；挥绊懚ㄎ坏礁郀柣w，因?yàn)榘腚装彼嵬蛔兊腅蛋白與野生型蛋白，在定位方面無(wú)差異。證明SARS-CoV E可以被泛素化，但是功能未知。SARS-CoV nsp3與E共定位，nsp3 N-端泛素樣功能域-1介導(dǎo)其相互作用。E蛋白可以被泛素化，而且泛素化狀態(tài)與穩(wěn)定性和半衰期負(fù)相關(guān)。SARS-CoV輔助蛋白8b表達(dá)較晚，可能下調(diào)E蛋白產(chǎn)生，調(diào)控病毒的產(chǎn)生，維持病毒滴度。IBV E蛋白腔N-端有一個(gè)糖基化位點(diǎn)，SARSCoV E預(yù)測(cè)有兩個(gè)糖基化位點(diǎn)。寡糖與保守序列Asn-X-Ser/Thr上的天冬酰胺殘基連接(N-連接糖基化)。糖基化修飾有利于招募宿主分子伴侶如鈣連蛋白和鈣網(wǎng)蛋白，幫助病毒或者宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)正確折疊和運(yùn)輸。S蛋白和E蛋白具有三半胱氨酸模體[11]。即E蛋白氨基末端后(NH2- … L-Cys-A-Y-Cys-Cys-N …-COOH)以及S蛋白C-端(NH2- … S-CysG-S-Cys-Cys-K … -COOH)。這些模體可能是E和S相互作用的基礎(chǔ)，形成二硫鍵。CoV結(jié)構(gòu)蛋白中，M和E蛋白相互作用的研究比較透徹。共表達(dá)M和E足以形成和釋放VLP。介導(dǎo)相互作用的是兩者的C-端，相互作用位于ERGIC細(xì)胞漿一側(cè)。如果耗盡這些功能域，VLPs產(chǎn)量迅速降低。

CoV E蛋白可以相互作用，寡聚化，形成病毒離子通道-病毒孔蛋白。這與TMD有關(guān)。合成對(duì)應(yīng)SARS-CoV E TMD的肽段，可以形成二聚體、三聚體、五聚體。與此相關(guān)的殘基為天冬酰胺15(N15)、纈氨酸25(V25)。缺乏E的CoV可望作為疫苗。

有些CoVs形成完整、有感染性的病毒粒子，不需要全部結(jié)構(gòu)蛋白。這也提示有些結(jié)構(gòu)蛋白的功能可能冗余，或者具有結(jié)構(gòu)蛋白之外的功能，比如參與病毒復(fù)制。S蛋白介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞表面受體黏附、病毒和宿主細(xì)胞膜融合，有利于病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。同時(shí)，也可能介導(dǎo)與鄰近未感染細(xì)胞融合。病毒在細(xì)胞之間擴(kuò)散可能與形成巨大的多核合胞體(syncytia)有關(guān)，破壞中和病毒的抗體。N蛋白主要結(jié)合CoV RNA基因組，形成核衣殼。N定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體(Endoplasmic reticulum (ER)-Golgi region)與其組裝和出芽有關(guān)。瞬間表達(dá)N蛋白可以大量增加有些CoVs產(chǎn)生病毒樣顆粒(Virus-like particles，VLPs)，提示N蛋白在包膜形成中的功能，但與完整病毒粒子形成的相關(guān)性不大。SARS-CoV核衣殼蛋白N干擾宿主RIG-I泛素化。MERS-CoV和SARS-CoV蛋白N特異性表位誘導(dǎo)呼吸道記憶CD4+T細(xì)胞，具有免疫保護(hù)功能。M蛋白豐度最高，但是負(fù)責(zé)確定病毒包膜的形狀，是CoV組裝的核心組織者，與冠狀病毒的其他結(jié)構(gòu)蛋白相互作用。S蛋白與M蛋白相互作用，是將S蛋白滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體過渡空間/高爾基復(fù)合體(ER-Golgi intermediate compartment，ERGIC)/Golgi complex，以及摻入病毒粒子所需，但S蛋白不是病毒粒子組裝所必需。M與N結(jié)合，穩(wěn)定病毒粒子核衣殼，以及病毒粒子內(nèi)部核心，最后完成病毒組裝。病毒的多數(shù)蛋白位于胞內(nèi)運(yùn)輸途徑即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和ERGIC，參與CoV組裝和出芽。E在病毒繁殖和組裝中發(fā)揮作用。缺乏E的重組CoVs病毒滴度明顯減少，病毒成熟受損，子代不完全。

冠狀病毒可以利用宿主的泛素化與去泛素化修飾系統(tǒng)，甚至編碼自己的泛素/去泛素酶，調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯后修飾，驅(qū)動(dòng)病毒生活史。MERS-CoV nsp3去泛素酶抑制宿主免疫應(yīng)答。nsp3本來防止ADP核糖基化的大功能域突變后，病毒的毒性降低。S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methioline,SAM)與nsp16(2-O-甲基轉(zhuǎn)移酶)結(jié)合，促進(jìn)MERS-CoV復(fù)制，招募來更多別構(gòu)激活因子在冠狀病毒中相對(duì)保守的nsp10。

2.2 與冠狀病毒基因組復(fù)制或者基因表達(dá)相互作用的宿主因子

相對(duì)于其他正鏈RNA病毒，參與冠狀病毒復(fù)制的宿主因子的研究甚少。與冠狀病毒進(jìn)入細(xì)胞有關(guān)的宿主受體研究提示冠狀病毒復(fù)制循環(huán)的第一步是進(jìn)入靶細(xì)胞，如氣管上皮細(xì)胞，特別是纖毛上皮細(xì)胞和肺泡II型肺細(xì)胞。其他與致病有關(guān)的包括浸潤(rùn)免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell,DC)。其中DC還可以進(jìn)一步分為髓型DC(Myeloid-type DC，mDC)和漿型DC(pDC)。兩種DC都是清除病毒的關(guān)鍵。激活的pDC產(chǎn)生大量I型IFN，提示附近細(xì)胞有感染。mDC產(chǎn)生I型IFN量不如pDC，可以分泌激活B細(xì)胞和T細(xì)胞需要的趨化因子，在適應(yīng)性免疫中非常關(guān)鍵。感染冠狀病毒S糖蛋白與宿主細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)受體識(shí)別并結(jié)合。其中冠狀病毒S蛋白是1型糖蛋白，1160～1400個(gè)氨基酸，由S1和S2亞基組成，在病毒粒子表面是三聚體，furlin蛋白負(fù)責(zé)在裂解位點(diǎn)RRXRR處切開S1和S2。S1區(qū)參與受體結(jié)合，含有可以作為受體結(jié)合功能域(Receptor-binding domain，RBD)的N-和C-端功能域(S1-NTD和S1-CTD)，提示決定細(xì)胞嗜性(Cell tropism)的主要功能在S1-CTD。S2區(qū)形成刺突三聚體的莖，激發(fā)病毒包膜和靶細(xì)胞膜融合。S1-NTD與宿主細(xì)胞表面聚糖(Glycan)相互作用，有利于病毒結(jié)合和進(jìn)入?；赽etacoronavirus S1-NTD晶體結(jié)構(gòu)，以及其他冠狀病毒S1-NTDs的序列保守性，所有冠狀病毒S1-NTDs具有半乳糖凝集素折疊，介導(dǎo)結(jié)合唾液酸如N-糖基神經(jīng)氨酸(N-glycolylneuraminic acid，Neu5Gc)，N-乙酰神經(jīng)氨酸(N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac)和/或5-N-乙酰-9-O-乙酰神經(jīng)氨酸 (5-N-acetyl-9-Oacetylneuraminic acid、Neu5、9Ac2) 。例外是小鼠肝炎病毒(Murine hepatitis virus，MHV)S1-NTD，結(jié)合癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子1(Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1，CEACAM1)的N-端D1功能域，免疫球蛋白超家族的I型膜蛋白。進(jìn)入細(xì)胞，大多數(shù)alphacoronavirus的S1-CTDu氨肽酶N(Aminopeptidase N，APN，也稱為CD13)相互作用。但alphacoronavirus HCoV-NL63利用另一個(gè)I型糖蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(Angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)。ACE2是金屬蛋白酶，屬于I型跨膜糖蛋白，具有羧肽酶活性，在調(diào)節(jié)心、腎功能以及控制血壓中起關(guān)鍵作用。人類ACE2的細(xì)胞外區(qū)域由2個(gè)亞基組成，其中鋅金屬肽酶區(qū)域可以進(jìn)一步分成2個(gè)亞域(I和II)，形成一個(gè)長(zhǎng)而深的裂縫，ACE2的N-端細(xì)胞外功能域有兩個(gè)alpha-helical。ACE2也是動(dòng)物betacoronavirus SARS-CoV的受體。人、哺乳動(dòng)物與鳥類ACE2分子僅少數(shù)位置氨基酸有差異，研究這些細(xì)微差別是冠狀病毒宿主特異性以及種間跳躍突變的重要線索。SARS-CoV RBD中Asn479、Thr487位的氨基酸對(duì)RBD-ACE2的親和力至關(guān)重要，其突變能夠調(diào)控RBD與不同宿主ACE2的結(jié)合力。betacoronaviruses MERS-CoV和蝙蝠HKU4利用另外一個(gè)二肽基肽酶4(屬于絲氨酸蛋白酶家族，Dipeptidyl peptidase 4，DPP4，也稱CD26)作為受體。DPP4廣泛分布于上皮組織和內(nèi)皮組織內(nèi)部，通常通過裂解激素和趨化因子的N末端肽鍵而改變其活性，改變機(jī)體或細(xì)胞的葡萄糖代謝、免疫應(yīng)答、黏附和凋亡等過程。MERS-CoV S蛋白對(duì)人DPP4親和力高，HKU4 S蛋白結(jié)合DPP4親和力更高。肽酶抑制劑不影響病毒進(jìn)入，提示SARS-CoV和MERSCoV受體和進(jìn)入不依賴受體的肽酶活性，只依賴結(jié)合特定宿主受體。DC-SIGN(Dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin)是巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞表達(dá)的C型凝集素，也稱CD209，可以識(shí)別常見的病毒及細(xì)菌的高度甘露糖糖基化分子。冠狀病毒的S蛋白高度糖基化，可以結(jié)合DC-SIGN。貓傳染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis virus，F(xiàn)IPV)也屬于冠狀病毒，感染單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞后導(dǎo)致全身擴(kuò)散。表達(dá)外源性DCSIGN的非易感細(xì)胞可能變得易感。I型和II型FIPV都能以DC-SIGN為共受體或替代受體，且不依賴唾液酸。

胞外細(xì)胞表面結(jié)合和/或溶酶體蛋白酶在冠狀病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞中發(fā)揮作用，因?yàn)槠浼せ頢蛋白的融合活性。細(xì)胞表面結(jié)合的跨膜絲氨酸蛋白酶2(Cell surface-associated transmembrane protease,serine 2，TMPRSS2)切割S蛋白，激發(fā)SARS-CoV與細(xì)胞膜融合。TMPRSS2也是切割和激活HCoV-229E和MERSCoV S蛋白所需條件。內(nèi)吞過程，早期內(nèi)吞體(Early endosome)中的SARS-CoV S蛋白被溶酶體組織蛋白酶L和P切割，病毒包膜與內(nèi)吞體膜融合，病毒RNA釋放到被感染細(xì)胞的細(xì)胞漿。過程與MERS-CoV進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)理類似。抑制細(xì)胞蛋白酶furin后，MERS-CoV不能進(jìn)入細(xì)胞，但是SARS-CoV能夠進(jìn)入，提示furin介導(dǎo)的切割是MERS-CoV有效進(jìn)入的關(guān)鍵。MHV A59與晚期溶酶體融合，切割S蛋白依賴晚期溶酶體中較低的pH。不同冠狀病毒為何分別與早期或者晚期溶酶體融合，以及宿主嗜性和致病性的關(guān)系，目前尚不清楚。S蛋白切割機(jī)理也比較復(fù)雜。MERS-CoV進(jìn)入依賴產(chǎn)病毒細(xì)胞中furin介導(dǎo)的切割，切割后的MERS-CoV S蛋白被受體細(xì)胞的蛋白酶加工，病毒粒子經(jīng)內(nèi)吞體進(jìn)入細(xì)胞，或者與細(xì)胞漿膜融合。含有未切割S蛋白的MERS-CoV病毒粒子則與晚期溶酶體融合。

宿主蛋白酶是多種B型病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的重要屏障。繞過該屏障可使B型病毒通過未知受體進(jìn)入人類細(xì)胞。冠狀病毒S蛋白與宿主細(xì)胞表面受體的結(jié)合是宿主嗜性的關(guān)鍵決定因素。SARS-CoV S蛋白的RBD的少數(shù)突變(N479L和T487S)足以影響與人ACE2的親和力。MERS-CoV S蛋白較蝙蝠HKU4 S有兩個(gè)突變，則可以結(jié)合人DPP4受體，但不能介導(dǎo)進(jìn)入，因?yàn)椴荒鼙蝗说鞍酌讣せ?。MERS-CoV S蛋白的兩個(gè)突變(S746R和N762A)可以被人蛋白酶切割，病毒可以進(jìn)入人細(xì)胞，這可能與動(dòng)物轉(zhuǎn)移MERS-CoV有關(guān)。

幾個(gè)株系的乙型冠狀病毒表面攜帶血凝素-酯酶(Hemagglutinin-esterase，HE)。HE蛋白含有凝集素結(jié)合功能域，介導(dǎo)與O-乙?；僖核峤Y(jié)合，也具有唾液酸-O-乙酰酯酶受體破壞酶活性，防止黏附到非許可細(xì)胞，HE也有利于結(jié)合主要受體后進(jìn)入靶標(biāo)細(xì)胞。

2.3 冠狀病毒復(fù)制需要修飾宿主細(xì)胞膜

正鏈RNA病毒的RNA合成發(fā)生在細(xì)胞漿，結(jié)合病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)膜派生結(jié)構(gòu)。已知正鏈RNA病毒誘導(dǎo)的膜復(fù)制相關(guān)結(jié)構(gòu)有兩種。一種是單層膜結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞器如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過氧化物酶體、內(nèi)吞體的膜上形成一個(gè)向內(nèi)彎曲的小球，具體是哪種細(xì)胞器，視病毒類型不同而異。病毒復(fù)制機(jī)器位于這些小球內(nèi)，RNA產(chǎn)物通過連通小球內(nèi)側(cè)和細(xì)胞漿的通道向外輸送，參與翻譯或者組裝病毒顆粒組裝。黃病毒和甲病毒誘導(dǎo)形成這種單層膜的復(fù)制細(xì)胞器。另一種是雙層膜小泡(Double-membrane vesicles，DMVs)，一般伴隨其他結(jié)構(gòu)如小管、折疊的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或者卷曲的膜，一起在細(xì)胞漿形成網(wǎng)狀管系統(tǒng)。小RNA病毒、動(dòng)脈炎病毒和黃病毒樣丙肝病毒誘導(dǎo)類似結(jié)構(gòu)。病毒nsps具有跨膜區(qū)，或者以其他方式錨定到膜上，驅(qū)動(dòng)形成這些結(jié)構(gòu)。冠狀病毒的nsp3、nsp4和nsp6參與形成這些結(jié)構(gòu)。

關(guān)于參與冠狀病毒復(fù)制細(xì)胞器形成的宿主因子和途徑的假說和數(shù)據(jù)很多，但尚無(wú)定論。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜參與是目前普遍接受的。病毒誘導(dǎo)的雙層膜結(jié)構(gòu)表面或者內(nèi)部具有核糖體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記分子如sec61α和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(Protein disulphide isomerase，PDI)也支持這個(gè)觀點(diǎn)，冠狀病毒誘導(dǎo)的DMV外膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池(ER cisternae)是一個(gè)連續(xù)體。鑒于與ER的聯(lián)系，有人提出包括依賴外被體蛋白(Coatomer protein，COP)及相關(guān)因子如GBF-1途徑的分泌途徑在復(fù)制中發(fā)揮重要作用。目前尚未找到冠狀病毒誘導(dǎo)的膜結(jié)構(gòu)的標(biāo)記分子nsp4和分泌途徑標(biāo)記分子的共定位證據(jù)。siRNA沉默篩選發(fā)現(xiàn)COPB2(β′-COP)抑制SARS-CoV復(fù)制。同一機(jī)器的組分COPB1和GBF1也嚴(yán)重影響SARS-CoV復(fù)制，證實(shí)分泌途徑的完整性對(duì)于病毒復(fù)制非常關(guān)鍵。磷脂酰肌醇4-激酶(Phosphatidylinositol 4-kinases，PI4K)對(duì)于正鏈RNA病毒復(fù)制非常重要。PI4K等激酶被招募到膜修飾位點(diǎn)，刺激產(chǎn)生PI4P脂類，支持形成病毒復(fù)制結(jié)構(gòu)和功能發(fā)揮。PI4K異構(gòu)體PI4KIIIbeta對(duì)SARS-CoV復(fù)制非常重要。其發(fā)揮功能主要是在病毒入侵細(xì)胞，而不是復(fù)制的后期。病毒的脂類囊膜可能與宿主細(xì)胞膜通過相溶性進(jìn)行擴(kuò)散。自噬體(Autophagosome)為雙層結(jié)構(gòu)。冠狀病毒誘導(dǎo)形成雙層結(jié)構(gòu)，提示自噬可能被冠狀病毒劫持來進(jìn)行復(fù)制。但是，有實(shí)驗(yàn)表明自噬因子Atg5并非冠狀病毒在原代細(xì)胞中復(fù)制所需。ERED，膜運(yùn)輸和自噬等可能都參與冠狀病毒復(fù)制。

2.4 冠狀病毒調(diào)控被感染細(xì)胞的翻譯和未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答[12]

真核細(xì)胞翻譯起始源于形成異三聚體eIF2復(fù)合體。該復(fù)合體包括α-亞基，結(jié)合tRNA的β-亞基和結(jié)合GTP的γ-亞基。eIF2復(fù)合體負(fù)責(zé)在40S亞基上裝載Met-tRNAi。結(jié)合mRNA后，43S復(fù)合體作為骨架，招募其他幾個(gè)蛋白質(zhì)，包括eIF3，到5′加帽的mRNA。隨后，結(jié)合了帽子的真核翻譯起始因子4F(eukaryotic translation initiation factor 4F，eIF4F)也添加到48S起始前復(fù)合體(pre-initiation complex)，從5′到3′到掃描mRNA，定位翻譯起始密碼子(Translation initiation codon)。此后，60S核糖體亞基加入，蛋白質(zhì)合成起始。結(jié)合到mRNA poly(A)尾部的多聚腺苷結(jié)合蛋白(Polyadenine-binding protein，PABP)也參與激發(fā)蛋白質(zhì)合成。外界不同刺激可以分別激發(fā)哺乳動(dòng)物4個(gè)激酶，磷酸化alpha亞基(eIF2α)，失活eIF2復(fù)合體。這四個(gè)激酶是：eIF2α激酶4(eIF2α kinase 4，也稱GCN2)，血紅素調(diào)控的抑制分子(Heme-regulated inhibitor，HRI)，ER脅迫時(shí)被激活的PKR樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PKR-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)和雙鏈RNA激活的蛋白激酶(Double-stranded (ds) RNAactivated protein kinase，PKR)。

宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)翻譯機(jī)器既是病毒復(fù)制所需，也是宿主抗病毒應(yīng)答的關(guān)鍵。正鏈RNA病毒需要限制宿主合成mRNAs，有利于病毒蛋白質(zhì)合成。冠狀病毒復(fù)制周期的多個(gè)階段都與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合。因此，冠狀病毒感染時(shí)，可能導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫。表達(dá)冠狀病毒的幾個(gè)蛋白質(zhì)如S蛋白，可以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫，與冠狀病毒感染的細(xì)胞的表型一樣。隨后誘導(dǎo)未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答(Unfolded protein response，UPR)，減輕PERK誘導(dǎo)的eIF2α磷酸化造成的翻譯抑制，刺激蛋白質(zhì)折疊，激發(fā)凋亡。冠狀病毒控制UPR的機(jī)理遠(yuǎn)沒HCV的研究透徹。冠狀病毒感染可能以控制PERK活性為主來調(diào)控翻譯水平。PKR是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Serine/threonine protein kinase)，被RNA病毒感染的標(biāo)志物dsRNA激活，是針對(duì)RNA病毒感染的先天免疫的重要分子，上調(diào)抗病毒基因表達(dá)，包括產(chǎn)生干擾素(Interferons，IFNs)。冠狀病毒以各種方式抵消PKR介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)，防止因?yàn)閑IF2α磷酸化而關(guān)閉翻譯。雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)通過激活PKR，以及誘導(dǎo)生長(zhǎng)阻斷和DNA損傷誘導(dǎo)的34蛋白(Growth arrest and DNA-damage-inducible 34 protein，GADD34)弱拮抗PKR，降低IBV-感染細(xì)胞中eIF2α磷酸化。MHV感染時(shí)，持續(xù)eIF2α磷酸化和阻遏GADD34表達(dá)導(dǎo)致抑制細(xì)胞mRNA的翻譯，有利于MHV感染。MERS-CoV ORF4a可能與病毒dsRNA結(jié)合，防止被PKR檢測(cè)到，拮抗PKR-誘導(dǎo)的形成脅迫顆粒(Stress granule)，防止翻譯抑制。傳染性腸胃炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)調(diào)控宿主細(xì)胞翻譯。其蛋白7與蛋白磷酸酶1相互作用，促進(jìn)eIF2α去磷酸化。PP1是宿主抗病毒應(yīng)答的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。SARS-CoV和IBV的S蛋白與eIF3F相互作用，調(diào)控宿主翻譯，包括后期促炎癥細(xì)胞因子白細(xì)胞介素6和8的表達(dá)。這種相互作用可能在冠狀病毒致病機(jī)理中發(fā)揮重要調(diào)控功能。

除調(diào)控eIF2α磷酸化，冠狀病毒也通過其他方式調(diào)控宿主的翻譯機(jī)器。alpha-和betacoronaviruses病毒的nsp1蛋白抑制翻譯起始的多個(gè)步驟。SARSCoV nsp1抑制48S起始復(fù)合體形成，干擾其轉(zhuǎn)變?yōu)?0S起始復(fù)合體。SARS-CoV nsp1多功能，可以直接結(jié)合40S核糖體亞基并抑制其在翻譯中的功能。nsp1-40S亞基復(fù)合體誘導(dǎo)切割宿主細(xì)胞mRNA如IFN-β mRNA，更大范圍地阻遏細(xì)胞翻譯，但是也有報(bào)道誘導(dǎo)大量IFN-β。MERS-CoV nsp1選擇性抑制細(xì)胞核產(chǎn)生的mRNAs的翻譯，但是不影響細(xì)胞漿中產(chǎn)生的病毒mRNAs的翻譯。MERS-CoV nsp1不與40S核糖體亞基結(jié)合。病毒的翻譯調(diào)節(jié)因子(translation modulator)與致病有關(guān)。

宿主環(huán)孢親和素(Cyclophilin)：環(huán)孢菌素A(Cyclosporin A，CsA)是免疫抑制劑，結(jié)合細(xì)胞環(huán)孢親和素(cyclophilins，Cyps)，形成Cyp-CsA復(fù)合體，抑制鈣調(diào)磷酸酶活性。其阻止細(xì)胞核因子活化的T細(xì)胞(nuclear factor of activated T cells，NF-AT)去磷酸化，從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，阻止免疫基因如IL-2的轉(zhuǎn)錄。已經(jīng)鑒定的17個(gè)Cyps中，9個(gè)是CsA靶標(biāo)。Cyps也是肽?；滨；悩?gòu)酶(peptidylprolyl isomerases，PPIases)，許多還具有分子伴侶和折疊酶活性，有利于蛋白質(zhì)折疊。Cyps參與各種信號(hào)途徑，凋亡、RNA剪切。環(huán)孢親和素，尤其是細(xì)胞漿CypA和結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的CypB，是許多RNA病毒復(fù)制周期組分，也是必需的宿主組分。(1) Cyps是重塑細(xì)胞膜為HCV復(fù)制細(xì)胞器必需；(2) CypA幫助HCV多聚蛋白加工；(3) 低水平CypA穩(wěn)定HIV-1衣殼，確保進(jìn)入細(xì)胞核，以免病毒粒子在細(xì)胞漿中變得不穩(wěn)定。Alisporivir(DEB-025;Debio-025) 是環(huán)孢親和素CsA類似物，具有高效的抗丙型肝炎病毒(HCV)活性，但沒有母核的免疫抑制活性。這說明環(huán)孢親和素在HCV復(fù)制中的作用，以及成靶性。微摩爾濃度CsA或Alisporivir可以抑制很多冠狀病毒如SARS-CoV、HCoV-229E、MHV、HCoVNL63和FCoV。線粒體CypD是線粒體通透性孔(permeabilization transition pore)的一部分，參與豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)和HCoV-NL63誘導(dǎo)的半胱天冬酰胺酶非依賴性凋亡，CsA可以抑制該過程。質(zhì)譜和酵母雙雜交都證實(shí)CypA與SARS-CoV N 蛋白相互作用。酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)多個(gè)Cyps(CypA、CypB、CypH和CypG)及相關(guān)PPIases(FK506-binding protein 1A和1B)可能結(jié)合SARS-CoV nsp1。Caco-2或Huh7細(xì)胞中，shRNA-介導(dǎo)敲除CypA，表達(dá)降低到正常水平的3%，幾乎可以完全阻斷HCoV-NL63復(fù)制，降低HCoV-229E 復(fù)制＞1log。影響CypA穩(wěn)定性和功能的單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotide polymorphisms)可以降低不同HCoV-229E復(fù)制。Cyps主要作用在NF-AT信號(hào)途徑。Cyp抑制劑可以作為工具藥物，探索宿主因子在冠狀病毒復(fù)制中的作用，但是作為宿主靶向治療(host-directed therapeutics)冠狀病毒感染尚缺乏證據(jù)。

冠狀病毒RNAs 5′-和3′-近端區(qū)域含有其RNA合成的關(guān)鍵調(diào)控元件。RNA-結(jié)合蛋白?？梢宰鳛楣跔畈《净蚪M復(fù)制的增強(qiáng)子。冠狀病毒基因組兩端折疊為高階RNA結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定該分子，參與分子內(nèi)部和分子間相互作用，有利于病毒復(fù)制。病毒和宿主的蛋白質(zhì)結(jié)合這些結(jié)構(gòu)，驅(qū)動(dòng)或者調(diào)控翻譯、復(fù)制和亞基因組RNA合成(表2)。

宿主細(xì)胞蛋白polypyrimidine tract-binding protein(PTB;or heterogeneous ribonucleoprotein protein(hnRNP) I)結(jié)合TGEV和MHV基因組的5′前導(dǎo)序列(leader sequence)。PTB結(jié)合MHV 5′-五核苷酸UCUAA重復(fù)序列UCUAA，是RNA合成的關(guān)鍵。HnRNP Q或SYNCRIP也結(jié)合MHV基因組的5′-端，如果敲除，MHV RNA合成和病毒復(fù)制減少。鋅指 CCHC-型和RNA-結(jié)合模體(zinc finger CCHCtype and RNA- binding motif 1，MADP1)結(jié)合SARSCoV和IBV基因組的5′端。MAPD1沉默也干擾病毒RNA合成，減少IBV復(fù)制。除了結(jié)合冠狀病毒RNA 5′- UTR(5′-untranslated region)的蛋白質(zhì)。5′-UTR約310 nucleotides(nts)，含前導(dǎo)序列(leader sequence)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(transcription regulatory sequence，TRS)，具有巢病毒目都保守的核心TRS模體(core-TRS motif)5′-CUAAAC-3′。也有蛋白質(zhì)結(jié)合3′UTR和/或poly(A)-尾。比如線粒體順烏頭酸酶(mitochondrial aconitase)，被heat-shock protein (hsp)40、hsp60和mitochondrial hsp70復(fù)合體所穩(wěn)定，結(jié)合MHV 3′ UTR 位于poly(A)尾上游3′-端42核苷酸。P100輔助激活因子(p100 coactivator)結(jié)合TGEV′UTR和/或poly(A) 尾。PABPs與TGEV、BCoV和IBV基因組相互作用，促進(jìn)其有效復(fù)制。PABPs結(jié)合病毒RNA確保有效翻譯和mRNA穩(wěn)定。RNA-親和純化和質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)幾個(gè)hnRNPs結(jié)合TGEV基因組3′-端約500核苷酸。RNA結(jié)合蛋白可能在復(fù)制酶基因翻譯時(shí)，調(diào)控冠狀病毒ORF1a/1b移碼。annexin A2結(jié)合IBV滑動(dòng)序列(slippery sequence)。該滑動(dòng)序列是核糖體停滯和參與ORF1b表達(dá)所需。宿主蛋白也可能間接影響病毒RTC活性。

2.5 冠狀病毒復(fù)制需要的宿主因子的系統(tǒng)生物學(xué)研究[13]

包括轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和功能基因組學(xué)等在內(nèi)的系統(tǒng)生物學(xué)方法將感染系統(tǒng)作為整體考慮，優(yōu)點(diǎn)是無(wú)偏好，可以鑒定冠狀病毒復(fù)制需要的蛋白質(zhì)、細(xì)胞途徑。芯片研究SARS-CoV-感染的外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell)，上調(diào)的細(xì)胞因子有IL-8、IL-17，激活巨噬細(xì)胞和凝血途徑。肺部組織尸檢也提供了SARS-CoV感染的病理，尤其是炎癥和細(xì)胞因子應(yīng)答。MHV-JHM感染培養(yǎng)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中，126個(gè)基因差異表達(dá)。其中大多數(shù)是調(diào)控胞內(nèi)先天免疫如NF-κB信號(hào)通路和IFN信號(hào)傳導(dǎo)。MHV-A59-感染的L細(xì)胞中，趨化因子、RNA和蛋白質(zhì)代謝、凋亡等途徑差異表達(dá)。芯片分析發(fā)現(xiàn)MHV感染的LR7細(xì)胞下調(diào)包括蛋白質(zhì)翻譯相關(guān)許多基因的轉(zhuǎn)錄，提示感染時(shí)，因?yàn)槊{迫應(yīng)答和mRNA降解(mRNA decay)，宿主關(guān)閉了蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng)。mRNA水平和蛋白質(zhì)豐度未必直接相關(guān)。轉(zhuǎn)錄水平的結(jié)果還需要用其他實(shí)驗(yàn)，如細(xì)胞蛋白質(zhì)水平進(jìn)行驗(yàn)證。

相互作用組酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)冠狀病毒RNA聚合酶復(fù)合體的亞基BTF3和ATF5、細(xì)胞色素氧化酶II(NADH 4L)與SARS-CoV nsp10相互作用。當(dāng)然，這個(gè)結(jié)果還需要在SARS-CoV-感染細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證。SARS-CoV helicase (nsp13)與DDX5相互作用，DDX1與SARS-CoV和IBV nsp14相互作用，促進(jìn)IBV復(fù)制。DDX1調(diào)控sg mRNA合成。該過程受GSK-3-介導(dǎo)的N 蛋白磷酸化調(diào)控。分析14 個(gè)SARS-CoV ORFs 及片段與宿主相互作用發(fā)現(xiàn)：nsp1與包括CypA在內(nèi)的免疫親和素家族相互作用。細(xì)胞E3泛素連接酶RCHY1與SARS-CoV nsp3 SUD(SARS unique domain)功能域相互作用，可能參與下調(diào)抗病毒因子p53。SUD蛋白能夠特異結(jié)合宿主mRNA 3′-不譯區(qū)廣泛具有的GGGG序列，提示SUD可能參與調(diào)控宿主mRNA代謝[14-18]。

表2 與不同冠狀病毒RNA相互作用的RNA結(jié)合蛋白

穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸細(xì)胞培養(yǎng)(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)是一種基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，可以確定兩種實(shí)驗(yàn)條件下樣品中蛋白質(zhì)豐度，比如感染和未感染細(xì)胞。SILAC研究發(fā)現(xiàn)IBV感染上調(diào)NF-κB和AP-1依賴性途徑。SILAC結(jié)合pull-down和質(zhì)譜技術(shù)，研究表達(dá)IBV N蛋白的293T相互作用組，得到142個(gè)細(xì)胞蛋白質(zhì)。其中許多蛋白質(zhì)與RNA相互作用，如核糖體和核仁蛋白質(zhì)，螺旋酶，以及hnRNP。

基于SILAC的定量蛋白質(zhì)組學(xué)(SILAC-based quantitative proteomics)比較表達(dá)SARS-CoV復(fù)制子的BHK-21細(xì)胞，找到宿主蛋白質(zhì)43個(gè)上調(diào)，31個(gè)下調(diào)。許多細(xì)胞過程的多功能調(diào)控因子BAG3也被上調(diào)。敲除實(shí)驗(yàn)證明，SARS-CoV和其他病毒有效復(fù)制需要BAG3。下調(diào)的有參與蛋白質(zhì)翻譯和信號(hào)傳遞的蛋白質(zhì)Cdc42和RhoA?；赟ILAC的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究高爾基體富集的亞細(xì)胞組分發(fā)現(xiàn)MHV感染耗盡幾個(gè)分泌途徑的蛋白質(zhì)，富集核糖體蛋白質(zhì)。SiRNA-介導(dǎo)敲降其中3個(gè)蛋白質(zhì)：C11orf59、GLG1和sec22b后，感染性子代病毒的復(fù)制或釋放增加，過量表達(dá)這些蛋白質(zhì)則具有相反效應(yīng)。宿主細(xì)胞分泌途徑對(duì)于冠狀病毒復(fù)制很關(guān)鍵。蛋白質(zhì)組分析純化的SARS-CoV病毒粒子發(fā)現(xiàn)，除nsp2(各冠狀病毒中變異較大)，nsp3(各冠狀病毒中變異較大)和nsp5等病毒蛋白外，病毒粒子還結(jié)合有172個(gè)宿主蛋白質(zhì)。其中有幾個(gè)是COPI途徑的蛋白質(zhì)，與病毒粒子形成途徑(ERGIC)吻合。SARS-CoV nsp2可與宿主蛋白抑制素1(prohibitin 1，PHB1)和抑制素2(prohibitin 2，PHB2)相互作用。在病毒感染過程中，可能破壞宿主細(xì)胞信號(hào)通路。

系統(tǒng)遺傳學(xué)方法：利用一組雜交小鼠，篩選影響SARS-CoV感染結(jié)局的宿主位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)E3泛素連接酶Trim55是重要決定因子。Trim55在血管套和炎癥中發(fā)揮重要作用。MERS患者免疫和炎癥應(yīng)答相關(guān)的遺傳背景與病毒毒株共同決定了感染結(jié)局。比較不同MERS-CoV分離株對(duì)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組影響發(fā)現(xiàn)，病毒PLpro和ORF4a參與免疫逃避，影響宿主STAT3途徑，對(duì)肺部炎癥和細(xì)胞修復(fù)有影響。這些效應(yīng)主要出現(xiàn)在感染后期。

蛋白激酶是信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)控因子，控制許多細(xì)胞過程，在許多正鏈RNA病毒的復(fù)制周期中發(fā)揮作用。激酶組siRNA(kinome-wide siRNA)篩選發(fā)現(xiàn)許多宿主細(xì)胞激酶影響SARS-CoV復(fù)制，其中包括40個(gè)有效促進(jìn)病毒復(fù)制的"proviral"蛋白質(zhì)。如復(fù)雜脂類代謝和早期分泌途徑(COPI-coated vesicles)?？共《拘?yīng)的蛋白質(zhì)包括PKR和CDK6。相比其他病毒，更多蛋白質(zhì)參與SARS-CoV復(fù)制，這也說明宿主細(xì)胞對(duì)SARS-CoV復(fù)制的影響大。p38 MAPK途徑調(diào)控IL-6，IL-8和IL-10介導(dǎo)的促炎癥細(xì)胞因子信號(hào)傳遞。網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞和運(yùn)輸?shù)饺苊阁w對(duì)于MHV融合、進(jìn)入很關(guān)鍵，溶酶體蛋白酶是該過程所需條件。綜合利用CRISPR/Cas9-介導(dǎo)的基因組編輯(genome editing)或單倍體遺傳篩選(haploid genetic screen)等技術(shù)，與系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)結(jié)合，可以鑒定更多冠狀病毒復(fù)制所需的宿主細(xì)胞因子。

2.6 冠狀病毒誘導(dǎo)宿主細(xì)胞周期失控

負(fù)責(zé)細(xì)胞分裂的細(xì)胞周期被嚴(yán)格調(diào)控，分為G1，S，G2和M。細(xì)胞存活、防止不受控制的細(xì)胞分裂都需要調(diào)控細(xì)胞周期。周期蛋白依賴的蛋白激酶(cyclin-dependent protein kinases，CDKs)有序控制細(xì)胞周期。細(xì)胞周期進(jìn)行需要周期蛋白調(diào)控亞基激活不同CDK。進(jìn)入DNA復(fù)制，CDK/cyclin復(fù)合體磷酸化，激活或失活其靶蛋白，協(xié)調(diào)進(jìn)入下一輪周期。類似其他病毒，冠狀病毒大量調(diào)控、阻遏細(xì)胞周期進(jìn)行，受益于被阻斷的生理狀態(tài)。IBV-感染細(xì)胞阻遏在S期，激活細(xì)胞DNA損傷應(yīng)答，對(duì)病毒復(fù)制有利。因?yàn)镾期上調(diào)DNA復(fù)制所需蛋白質(zhì)，病毒可以招募到細(xì)胞漿。例如與冠狀病毒nsp14相互作用的細(xì)胞DExD/H家族的RNA螺旋酶(RNA helicase)DDX1被冠狀病毒劫持，用來增強(qiáng)其復(fù)制。SARS-CoV nsp14近C端區(qū)域有鳥嘌呤-N7-甲基轉(zhuǎn)移酶活性，在RNA加帽過程中起重要作用，其活性依賴nsp14近N端核酸外切酶活性區(qū)域。DDX1也與IBV N蛋白相互作用，與MHV-JHM N蛋白的磷酸化形成復(fù)合體，有利于平衡合成sg mRNA和基因組RNA。冠狀病毒nsp15相互作用并抑制抑癌蛋白視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(retinoblastoma protein，pRb)，平時(shí)被pRb阻遏的蛋白質(zhì)的表達(dá)增加，進(jìn)入S期的細(xì)胞增多。類似效應(yīng)在MHV感染細(xì)胞中也存在，G1期進(jìn)入S期所需要的的pRb低度磷酸化被降低。過量表達(dá)SARS-CoV 3a蛋白導(dǎo)致G1阻斷，抑制細(xì)胞增殖。

MHV感染下調(diào)cyclin-dependent kinase 6(CDK6) ，在病毒誘導(dǎo)的促進(jìn)病毒復(fù)制的細(xì)胞周期阻遏在G0/G1期發(fā)揮作用。SARS-CoV類似效應(yīng)，過量表達(dá)N 蛋白，降低CDK4CDK6激酶活性，限制細(xì)胞周期推進(jìn)。CDK6激酶參與細(xì)胞周期從G1推進(jìn)到S期，耗盡CDK6導(dǎo)致細(xì)胞周期阻斷在G1期。

部分冠狀病毒誘導(dǎo)p53，將細(xì)胞周期阻斷在S或G2/M期。TGEV N 蛋白激活p53，積累細(xì)胞周期相關(guān)激酶如cdc-2和cyclin B1。同步在S或G2/M期的細(xì)胞有利于TGEV RNA和病毒產(chǎn)生，以及IBV復(fù)制。MHV nsp1也具有類似機(jī)制。nsp1激活p53，提高p21水平，降低CDK2-cyclin E水平。pRb滴度磷酸化和G1細(xì)胞周期阻斷。SARS-CoV感染導(dǎo)致減少p53表達(dá)水平。為了抵消p53的抑制效應(yīng)，SARS-CoV nsp3(分子量＞200kDa，具有poly(ADP-ribose)結(jié)合功能域，蛋白酶、去泛素酶和de-ISGylase功能域)穩(wěn)定E3連接酶RCHY1，降低其表達(dá)。RCHY1介導(dǎo)p53泛素化并降解。但是，調(diào)控細(xì)胞周期、病毒復(fù)制和/或致病的具體機(jī)理仍然不清楚。缺乏p53表達(dá)的細(xì)胞，SARS-CoV復(fù)制被明顯增強(qiáng)。SARS-CoV或HCoV-NL63 PL2pro降解p53，抵消p53的作用。PL2pro去泛素化，促進(jìn)降解p53，降低p53-介導(dǎo)的抗病毒免疫應(yīng)答。

2.7 宿主對(duì)冠狀病毒的先天免疫應(yīng)答以及病毒的對(duì)抗策略

宿主先天免疫試圖遏制病毒復(fù)制。病毒采用多種策略逃避宿主免疫應(yīng)答。宿主細(xì)胞漿中正鏈RNA病毒復(fù)制中間體dsRNA 和5′-三磷酸RNA分子可以激發(fā)免疫。幾乎所有細(xì)胞的細(xì)胞漿中都存在Rig-Ilike receptor(RLR)家族感受器如retinoic acid-inducible gene 1(RIG-I)、病毒感染時(shí)合成2′,5′-寡腺苷酸的2′,5′-寡腺苷酸合成酶(2′,5′-oligoadenylate(2～5A) synthetases，OAS)和黑色素瘤分化相關(guān)蛋白質(zhì)5 (melanoma differentiation-associated protein 5，MDA-5)負(fù)責(zé)識(shí)別dsRNA和5′-三磷酸RNA分子。2～5A結(jié)合和激活RNase L。RNase L是宿主核糖核酸酶，負(fù)責(zé)全局降解宿主和病毒的RNA。細(xì)胞表面的TLR或者免疫細(xì)胞內(nèi)吞體中的TLR如TLR3、TLR4也可以識(shí)別病毒核酸或者蛋白質(zhì)。SARS-CoV M 蛋白被TLRlike途徑識(shí)別，與標(biāo)準(zhǔn)的TRAF3-介導(dǎo)的信號(hào)途徑獨(dú)立，隨后激活轉(zhuǎn)錄因子IRF3，IRF7(IFN-regulatory factor 3 and 7)和NF-κB，表達(dá)并分泌I型IFN和促炎癥細(xì)胞因子，后者反饋激活JAK-STAT信號(hào)通路，誘導(dǎo)表達(dá)諸多具有抗病毒功能的干擾素刺激基因(interferon-stimulated genes，ISGs)，被感染細(xì)胞進(jìn)入抗病毒狀態(tài)。ISGs靶向病毒復(fù)制周期的幾乎所有步驟，限制病毒復(fù)制。p38絲裂原活化的蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases，MAPKs)參與誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子IL-6和IL-8，參與抗病毒感染。IBV誘導(dǎo)p38 MAPK的負(fù)調(diào)控因子-雙特異性磷酸酶1(dualspecificity phosphatase 1，DUSP1)，拮抗IL-6和IL-8表達(dá)。尚不知曉IBV病毒具體哪個(gè)(些)分子導(dǎo)致上述效應(yīng)。整個(gè)信號(hào)通路的多個(gè)節(jié)點(diǎn)如RIG-I、TANK結(jié)合激酶(TANK-binding kinase 1，TBK1)和TNF受體相關(guān)因子(TNF receptor-associated factor 3，TRAF3)都可能受到磷酸化、泛素化等翻譯后修飾的調(diào)控，如Lys63-泛素化。

先天免疫涉及包括細(xì)胞因子、趨化因子、補(bǔ)體、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，旨在阻止病毒進(jìn)入和繁殖。但病毒也共進(jìn)化出逃避/阻斷宿主先天免疫的組分。這些組分用來避開宿主免疫監(jiān)視，操縱宿主先天免疫應(yīng)答。

冠狀病毒感染中，先天免疫的作用體現(xiàn)在至少3個(gè)方面：重癥SARS患者伴隨先天免疫信號(hào)傳遞異?；蛘哌^度活化，肺部產(chǎn)生更多干擾素和促炎癥細(xì)胞因子如L-1、IL-6、IL-8、CXCL-10和TNF-α。不同MERS-CoV 分離株(MERS-CoV Eng 1 vs.SA 1) 感染人培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)，病毒序列差異和先天免疫逃避有關(guān)，導(dǎo)致的免疫應(yīng)答不同。隨后，STAT3差異激活導(dǎo)致IFN、NF-κB和IRF的活化或者抑制。冠狀病毒利用復(fù)雜機(jī)制使病毒復(fù)制機(jī)器(viral replication machinery)避開宿主細(xì)胞漿中先天免疫感受器的監(jiān)視。除復(fù)制細(xì)胞器對(duì)病毒PAMPs的保護(hù)外，冠狀病毒也主動(dòng)進(jìn)攻或者躲避宿主的先天免疫應(yīng)答。

病毒采用多種因子、多種途徑壓制宿主的先天免疫應(yīng)答。除抑制細(xì)胞mRNA翻譯外，SARS-CoV nsp1降低被感染細(xì)胞中磷酸化STAT1(phosphorylated STAT1，p-STAT1)的量，以及IRF3二聚化，阻斷產(chǎn)生IFN相關(guān)的信號(hào)傳遞，影響細(xì)胞周期，但不誘導(dǎo)凋亡。其他alpha-和betacoronaviruses的nsp1蛋白(相對(duì)變化大)也抑制I型IFN信號(hào)傳遞，大多數(shù)冠狀病毒復(fù)制酶多聚蛋白N端亞基具有關(guān)閉宿主免疫應(yīng)答的活性。Nsp1缺陷病毒對(duì)IFN更敏感，這也提示nsp1是IFN拮抗劑。但Nsp1拮抗先天免疫、選擇性降解宿主mRNA則還需要證據(jù)。生化證據(jù)表明，pp1a多聚蛋白更下游，許多冠狀病毒的papain-like protease 2 domain(PL2pro)和TGEV nsp3的PL1pro功能域，具有去泛素化酶(deubiquitination，DUB)活性。DUB活性可以除去先天免疫信號(hào)傳遞因子的泛素，阻止抗病毒狀態(tài)的產(chǎn)生，生化實(shí)驗(yàn)證明SARS-CoV和MERSCoV PL2pro過量表達(dá)可以降低干擾素信號(hào)傳遞。MHV PL2pro去泛素化并結(jié)合TBK1，以及IRF3。

除了保守的復(fù)制酶，冠狀病毒其他輔助蛋白也可以壓制宿主先天免疫。這些蛋白質(zhì)可能是不同病毒株系為此而從不同來源獲得的。細(xì)胞培養(yǎng)中，這些輔助蛋白并非必需。MHV ORF2a編碼的磷酸二酯酶(phosphodiesterase)ns2拮抗宿主RNAse L激活。這對(duì)于在天然宿主中復(fù)制非常重要。SARSCoV ORF3b和ORF6阻斷干擾素產(chǎn)生和信號(hào)傳遞。MERS-CoV ORFs 4a,4b和5也阻斷干擾素信號(hào)傳遞。SARS-CoV E蛋白是病毒編碼的離子通道-病毒孔蛋白(viroporin)，具有促進(jìn)NLRP3炎癥體活性，影響炎癥進(jìn)程，導(dǎo)致大量產(chǎn)生IL-1β，導(dǎo)致宿主免疫病理性變化。

ORF6是病毒-宿主相互作用的關(guān)鍵，調(diào)控胞內(nèi)環(huán)境。調(diào)控感染過程中的進(jìn)入細(xì)胞核的動(dòng)力學(xué)(圖4)，病毒可以控制先天免疫、適應(yīng)性免疫、凋亡和細(xì)胞脅迫應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)。ORF6是63aa的ER/Golgi膜蛋白，C-端尾部面向細(xì)胞漿，N-端位于ER腔或者ER膜。用IFN-β或IFN-γ處理，ORF6能夠阻斷STAT1/STAT2/IRF9和STAT1/STAT1復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核。ORF6減少可以抑制STAT1依賴的基因表達(dá)，這需要C-端10aa。ORF6招募細(xì)胞核進(jìn)入因子到ER/Golgi膜。KPNA2特異性結(jié)合ORF6的C-端，將KPNA2滯留在ER/Golgi膜上，隨后，招募KPNB1到膜復(fù)合體，限制STAT1復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核必需的KPNB1的可利用度，結(jié)果是ORF6阻止STAT1復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核。KPNB1是經(jīng)典的進(jìn)入細(xì)胞核途徑的共同組分。ORF6因此可以影響其他信號(hào)途徑。ORF6阻斷含有經(jīng)典入核信號(hào)的蛋白，但是對(duì)于不含這些經(jīng)典入核信號(hào)的蛋白則無(wú)效。ORF6可以使一般無(wú)毒的MHV-A59毒性增加。MHV/ORF6病毒數(shù)量比野生型病毒多。MHV的輔助蛋白可能與逃避免疫監(jiān)視有關(guān)。細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平隨細(xì)胞類型、年齡而不同，其可利用度與感染密切程度相關(guān)。

免疫應(yīng)答是保護(hù)還是致病？宿主免疫系統(tǒng)涉及多個(gè)組織、細(xì)胞和分子，通過有效識(shí)別和去除致病菌，保護(hù)宿主應(yīng)對(duì)感染。SARS-CoV感染嚴(yán)重程度與病毒特異性免疫應(yīng)答相關(guān)，抑制肺泡巨噬細(xì)胞和不能有效激活樹突狀細(xì)胞，可以延緩病毒特異性免疫應(yīng)答，加劇疾病。如果I型干擾素應(yīng)答和炎癥性單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞應(yīng)答失控，SARS-CoV感染小鼠產(chǎn)生致死性肺炎。如果抑制NF-κB介導(dǎo)的炎癥，SARS-CoV感染小鼠存活率則提高。IAV破壞宿主組織與過度激活NLRP3(NACHT,LRR and PYD domains-containing protein 3)，HMGB-1(highmobility group box 1 protein)，IL-1β有關(guān)。TNFSF10,HDAC4(histone deacetylase 4)，HDAC5表達(dá)與TNFα，NF-κB，cox-2(cyclooxygenase 2)水平負(fù)相關(guān)，其表達(dá)增加與預(yù)后良好相關(guān)。

2.8 細(xì)胞因子風(fēng)暴和免疫病理的關(guān)系

圖4 產(chǎn)干擾素細(xì)胞(左)和含干擾素受體細(xì)胞(右)的信號(hào)通路。

如細(xì)胞因子和趨化因子應(yīng)答迅速且協(xié)調(diào)，則可以作為先天免疫一線防御病毒感染。如果失控或者過量產(chǎn)生，則導(dǎo)致病理變化，稱為細(xì)胞因子風(fēng)暴(cytokine storm)[19]。目前尚無(wú)SARS和MERS感染過程中，促炎癥細(xì)胞因子和趨化因子參與肺部病理的直接證據(jù)。患者的相關(guān)性證據(jù)提示炎癥應(yīng)答增加，與冠狀病毒致病有關(guān)。

SARS-CoV感染過程中的細(xì)胞因子和趨化因子應(yīng)答，SARS-CoV主要大量感染呼吸道和肺泡上皮細(xì)胞，一般不易成功感染血液細(xì)胞如樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞和其他PBMC衍生的細(xì)胞。SARSCoV感染后DCs產(chǎn)生低水平的抗病毒細(xì)胞因子IFNαβ，中等程度上調(diào)促炎癥細(xì)胞因子TNF和IL-6，明顯上調(diào)炎癥趨化因子CCL3、CCL5、CCL2和CXCL10。SARS-CoV-感染的巨噬細(xì)胞IFN和其他促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生延遲但增加。SARS-CoV-感染的呼吸道上皮細(xì)胞(airway epithelial cells，AECs)也大量產(chǎn)生CCL3、CCL5、CCL2和CXCL10。延遲但大量產(chǎn)生這些細(xì)胞因子和趨化因子導(dǎo)致針對(duì)SARS-CoV的先天免疫失控。與無(wú)并發(fā)癥的SARS患者比較，SARS重癥患者血清促炎癥細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-1、IL-6、IL-12和TGFβ)和趨化因子(CCL2、CXCL10、CXCL9和IL-8)水平高。重癥SARS患者的抗炎癥細(xì)胞因子如IL-10水平很低。與健康人和中等程度患者比較，除了促炎癥細(xì)胞因子和趨化因子，致死性SARS患者水平增加的有IFN(IFN-α和IFN-γ)和IFN刺激基因(IFN-stimulated genes，ISGs)(CXCL10和CCL-2)。IFNs和ISGs可能參與SARS免疫病理。SARSCoV-感染的AECs，DCs和巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子、趨化因子應(yīng)答失控或者增加，可能具有病理作用。SARS感染者血清中促炎細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6、IL-12、IFN-γ、IP-10和MCP-1)的增加與SARS感染者肺部炎癥和廣泛的肺損傷有關(guān)。年齡影響感染結(jié)局，適應(yīng)性免疫隨著年齡增加而降低。但是，先天免疫還需要研究，尤其是年輕人和老年人的病毒易感性相關(guān)SNP。SARS-CoV康復(fù)者才增加IFN-γ、IL-4、IL-10。SARS-CoV患者大幅上調(diào)IL-6。IL-6，IL-8和MCP-1(monocyte chemoattractant protein 1)和IP-10與疾病嚴(yán)重程度和死亡相關(guān)。芯片定量研究外周血單核細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)發(fā)現(xiàn)：所有感染者都提高促炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，但是幾乎未見IFN-α或β表達(dá)增加。這可能是后兩者在被感染細(xì)胞中穩(wěn)定，或者IFN拮抗差異(SARS-CoV編碼大量誘導(dǎo)IFN的dsRNA，但是未見IFN產(chǎn)生)。SARS-CoV感染如何誘導(dǎo)細(xì)胞因子？與病毒致病機(jī)理有何相關(guān)？與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)的標(biāo)記分子目前包括人白細(xì)胞抗原I(human leukocyte antigen class I，HLA-I) (B*0703),HLA- II (DRB1*0301)，甘露糖結(jié)合蛋白(mannose binding protein)，OAS1，MxA。但是，樣本小且不容易獲得，所以較難重復(fù)。IL-12RB1，IFN-γ，rantes等多態(tài)性與SARS疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。這些現(xiàn)象的機(jī)理，目前尚不清楚?？赡苡幸韵聨讉€(gè)方面：病毒編碼的蛋白直接拮抗IFN產(chǎn)生途徑，而且，病毒可能編碼多個(gè)干擾素拮抗分子。病毒可能在某個(gè)隱秘的部位復(fù)制，宿主無(wú)法檢測(cè)其RNA存在，比如雙層膜結(jié)構(gòu)中。MHV或者SARS-CoV干擾的細(xì)胞，確實(shí)不產(chǎn)生IFN-β。但是在病毒感染后，加入Sendai病毒或者poly(I:C)，細(xì)胞產(chǎn)生大量IFN-β。MHV感染的DC細(xì)胞產(chǎn)生很低水平I型IFN。SARS-CoV感染的Caco-2和HEK293細(xì)胞，幾乎不產(chǎn)IFN-α，IFN-β，IFN-λ。Caco-2細(xì)胞而不是HEK293細(xì)胞誘導(dǎo)IP-10和IL-8。但是，產(chǎn)生差異的原因未知。這可能對(duì)解釋人和小鼠差異有關(guān)。冠狀病毒抑制的途徑可以被其他誘導(dǎo)因素激活，細(xì)胞培養(yǎng)模型中，IFN信號(hào)傳遞途徑未被完全抑制。連續(xù)研究病毒RNA的定位、復(fù)制動(dòng)力學(xué)和翻譯，有助于理解該現(xiàn)象。

MERS-CoV感染中的細(xì)胞因子和趨化因子，類似SARS，MERS-CoV也感染人呼吸道上皮細(xì)胞，誘導(dǎo)大量但延遲的IFN和促炎癥細(xì)胞因子(IL-1β,IL-6和IL-8)。MERS-CoV可以在未激活和激活的人單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞、DCs中存活，但MERS-CoV只在激活的T細(xì)胞中復(fù)制。這點(diǎn)不同于SARS-CoV。SARSCoV不能有效感染單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞、DCs和T細(xì)胞。MERS-CoV感染單核細(xì)胞來源的細(xì)胞株THP-1，人外周血單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞(peripheral blood monocyte-derived macrophages)和DC，誘導(dǎo)遲緩但高水平的促炎癥細(xì)胞因子和趨化因子如CCL-2、CCL-3、CCL-5、IL-2和IL-8。但是，除了漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(plasmacytoid dendritic cells，pDC)在感染時(shí)產(chǎn)生大量IFN，單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞和DC都不大量產(chǎn)生IFN-α/β。與輕癥比較，重癥MERS患者的血清促炎癥細(xì)胞因子(IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17、IL-15和IFN-α)和趨化因子(IL-8，CXCL10和CCL5)高。與其正相關(guān)的是肺部和外周血中嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞數(shù)量增加。這提示這些細(xì)胞可能參與肺部病理。

2019-nCov和MERS，SARS都屬于冠狀病毒，但是其細(xì)胞因子風(fēng)暴特點(diǎn)不同。初期：IL1B、IL1RA、IL7、IL8、IL9、IL10、堿性FGF、GCSF、 GMCSF、IFNγ、IP10、MCP-1、MIP1A、MIP1B、PDGF、TNFα和VEGF均升高。IL5、IL12p70、IL15、Eotaxin和RANTES無(wú)改變。ICU(重癥)和非-ICU病人(輕癥)比較：IL2、IL7、IL10、GCSF、IP10、MCP-1、MIP1A和TNFα升高。猜測(cè)的機(jī)制為：IL1B、IFNγ、IP10、MCP-1激活Th1。GCSF、IP10、MCP-1、MIP1A和TNFα與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。與SARS-Cov不同，抑制免疫的Th2細(xì)胞因子IL-4，IL-10在2019-nCov也升高。

細(xì)胞因子風(fēng)暴與冠狀病毒感染大量炎癥的原因，以及驅(qū)動(dòng)肺部病理?yè)p傷的宿主因素總體不清楚。但是，在炎癥起始和進(jìn)展過程中發(fā)揮作用的因素正被逐步闡明。(1)病毒快速、大量復(fù)制：體內(nèi)外感染的情形都是SARS-CoV和MERS-CoV很快大量復(fù)制，細(xì)胞毒性效應(yīng)增強(qiáng)，被感染的上皮細(xì)胞產(chǎn)生大量促炎癥細(xì)胞因子和趨化因子。后者反饋協(xié)調(diào)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)肺部。SARS-CoV和MERSCoV病毒數(shù)量與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。(2)hCoV感染呼吸道和/或肺泡上皮細(xì)胞：來自小鼠等動(dòng)物模型的研究都提示病毒主要感染呼吸道上皮細(xì)胞，以及肺泡上皮細(xì)胞(I型和II型肺細(xì)胞pneumocyte)。(3)IFN應(yīng)答延遲： SARS-CoV和MERS-CoV編碼大量結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，拮抗IFN應(yīng)答。感染不久，hCoV就大量復(fù)制，產(chǎn)生大量抑制IFN應(yīng)答的蛋白質(zhì)，提示IFN應(yīng)答早期拮抗可能滯后或者逃避先天免疫應(yīng)答。延遲的IFN 信號(hào)傳遞進(jìn)一步協(xié)調(diào)IMM應(yīng)答，致敏T細(xì)胞凋亡，炎癥應(yīng)答失控。(4)單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞積累：冠狀病毒感染后，人體肺部積累這些炎癥細(xì)胞。與疾病致死性相關(guān)的細(xì)胞因子和趨化因子主要來自這些細(xì)胞。病毒復(fù)制迅速、大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、促炎癥細(xì)胞因子/趨化因子增多，導(dǎo)致急性肺損傷(acute lung injury，ALI)和急性呼吸窘迫癥(acute respiratory distress syndrome，ARDS)。免疫應(yīng)答失控導(dǎo)致肺部免疫病理，有害臨床癥狀。

3 冠狀病毒防控措施研發(fā)

抗冠狀病毒藥物研發(fā)面臨的挑戰(zhàn)既有RNA病毒共性問題，也有冠狀病毒特有問題。抗病毒靶標(biāo)有蛋白酶、解旋酶和聚合酶抑制劑。主要靶標(biāo)是病毒感染必需的宿主細(xì)胞機(jī)器，或者干擾病毒致病必需的宿主先天免疫應(yīng)答。新藥研發(fā)比較漫長(zhǎng)，為了提高治愈率，降低死亡率，老藥新用是省時(shí)、成本效益好的開發(fā)高效抗病毒藥物方法。冠狀病毒感染的治療方法包括康復(fù)者血清(convalescent sera)、皮質(zhì)激素(corticosteroids)，抗病毒藥物(antiviral therapeutics)如干擾素(interferons)、廣譜抗病毒的核苷類似物如利巴韋林(ribavirin)、蛋白酶抑制劑(protease inhibitor)，見表3、圖5。

3.1 治療方法

康復(fù)者血清：將MERS-CoV免疫過的駱駝的血清輸給感染小鼠，小鼠肺部病理減輕、體重降低也變緩。康復(fù)者的MERS-CoV-特異性抗體滴度變化幅度大，不容易獲得大量血漿供體，相關(guān)的臨床研究后來撤銷(NCT02190799)。因此，目前缺乏安全性和有效性的證據(jù)。

疫苗：針對(duì)冠狀病毒的疫苗研發(fā)目標(biāo)是誘導(dǎo)廣譜抗體。這需要精準(zhǔn)界定病毒保守的保護(hù)性抗原表位。宿主差異的T細(xì)胞應(yīng)答特征，以及可能基于DC的疫苗設(shè)計(jì)。目前研究發(fā)現(xiàn)靶向嗜中性粒細(xì)胞和Th1，幫助建立組織駐留記憶(tissue-resident memory,TRM)和對(duì)不同亞型病毒具有交叉保護(hù)作用的免疫(heterosubtypic immunity)對(duì)于疫苗研發(fā)非常重要。通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組等確定外周的組織駐留細(xì)胞亞群及其功能非常關(guān)鍵。綜合利用測(cè)序、晶體結(jié)構(gòu)，分子進(jìn)化，預(yù)測(cè)病毒演化，選擇動(dòng)力學(xué)，宿主內(nèi)動(dòng)態(tài)，基于測(cè)序的流行病學(xué)、基因組分化與適應(yīng)，建立預(yù)測(cè)模型，現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)操作流程標(biāo)準(zhǔn)化，數(shù)據(jù)歸一化，全面分析免疫各方面很必要。

訂書肽(Stapled Peptide)：蛋白-蛋白相互作用(PPI)在許多生物過程中發(fā)揮重要作用，例如病毒的自組裝。訂書肽可能抑制病毒與宿主相互作用，或者病毒不同蛋白之間相互作用。具有α螺旋結(jié)構(gòu)和富含正電荷的多肽可以穿過細(xì)胞膜。2000年，Verdine等發(fā)展了一種用碳碳鍵作為支架來穩(wěn)定多肽α螺旋結(jié)構(gòu)的方法。由該方法得到的多肽稱為訂書肽( stapled peptides) 。訂書肽有更高的α螺旋程度，與靶標(biāo)的結(jié)合能力增加5～5000倍。此外，訂書肽能透過細(xì)胞膜，難被蛋白酶水解，在生物體內(nèi)的半衰期較長(zhǎng)。Aileron Therapeutics的兩種訂書肽ALRN-5281和ATSP-7041有一定功能。

氯喹(Chloroquine)具有直接的抗病毒作用，抑制包括黃病毒(flaviviruses)，逆轉(zhuǎn)錄病毒(retroviruses)和冠狀病毒(coronaviruses)在內(nèi)的幾種病毒的依賴pH的復(fù)制步驟。氯喹抗病毒作用的主要機(jī)制可能是抑制糖基化。氯喹可能與人細(xì)胞內(nèi)糖修飾酶或糖基轉(zhuǎn)移酶特異性相互作用。氯喹從1944年開始用來治療瘧疾，以后用途逐漸擴(kuò)大。1951年，用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。磷酸氯喹及其他4-氨基喹啉類抗瘧藥(如哌喹，氨酚喹等)可能干擾了瘧原蟲裂殖體DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄過程或阻礙了其內(nèi)吞作用，從而使蟲體由于缺乏氨基酸而死亡，主要對(duì)瘧原蟲的紅內(nèi)期起作用。

核苷(酸)類似物抑制劑(nucleotide and nucleoside analogue inhibitor，NI)是雜環(huán)或者糖成分被修飾的嘌呤或者嘧啶的類似物，是病毒聚合酶(Polymerase)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑(Competitive Inhibitor)，也是最大、最重要的一類抗病毒藥物。攜帶一個(gè)磷酸基團(tuán)，代謝后就是核苷酸的NI前體藥物稱為核苷酸類似物(Nucleotide Analogue)。不含磷酸的NI藥物稱為核苷類似物(Nucleoside Analogue)。核酸合成沿著核酸的5'-3'進(jìn)行。作為原料的核苷酸，首先被三磷酸化(Triphosphorylation)，變成三磷酸核苷(NTP)。除了ATP，其它的NTP都是細(xì)胞中的激酶(kinase)合成的。進(jìn)入細(xì)胞后，宿主或者病毒的激酶將這些前體或者前藥代謝為活性三磷酸。RNA病毒復(fù)制所需的RNA復(fù)制過程在人體細(xì)胞中不會(huì)發(fā)生。病毒復(fù)制必須用自己的聚合酶，如RNA病毒的RNA復(fù)制酶(RdRp)。RNA病毒維持需要不間斷地復(fù)制，因?yàn)镽NA在宿主細(xì)胞中會(huì)被不斷分解。而核苷(酸)類似物通過選擇性的抑制病毒的聚合酶、錯(cuò)配或者替代，破壞RNA合成、結(jié)構(gòu)、RNA-蛋白質(zhì)相互作用或者蛋白質(zhì)功能，阻止RNA病毒的復(fù)制。突變積累，病毒不能存活，造成致死性突變(lethal mutagenesis)或者錯(cuò)誤災(zāi)難(error catastrophe)。添加NI后，病毒每復(fù)制一次，適合度都降低，最后，NI會(huì)耗盡核苷酸庫(kù)[20]。

正鏈RNA病毒基因組復(fù)制的代時(shí)短，同源和非同源重組多，錯(cuò)誤率高，病毒產(chǎn)量高，子代是一堆適合度各異的突變病毒。適合度高的耐藥病毒株容易出現(xiàn)，抗病毒藥物容易失效。因?yàn)镹sp14-exoN依賴RNA的RNA 3'-5'外切核酸酶校讀活性，冠狀病毒的復(fù)制忠實(shí)性比其他RNA病毒高20倍。

利巴韋林(也稱病毒唑，結(jié)構(gòu)式1-β-DRibofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide)是鳥苷類似物，抑制冠狀病毒mRNA合成，具有廣譜抗病毒活性。單磷酸形式的利巴韋林與宿主合成核苷酸的關(guān)鍵酶-次黃苷酸脫氫酶(inosine monophosphate dehydrogenase,IMPDH)相互作用，減少核苷酸產(chǎn)生，耗盡細(xì)胞GTP庫(kù)，抑制病毒RNA合成。病毒聚合酶摻入利巴韋林的三磷酸形式則導(dǎo)致致死性突變。體外，高劑量利巴韋林可以部分抑制MERSCoV和SARS-CoV復(fù)制。體內(nèi)，利巴韋林則提高了病毒載量，加劇了SARS-CoV感染小鼠的病情。但是，對(duì)于SARS-CoV患者，利巴韋林沒有效果，反而毒性很大。冠狀病毒天然耐受5-氟尿苷和利巴韋林與nsp14有關(guān)。ExoN的校讀活性可以使對(duì)其他病毒有效的利巴韋林失效。如何使得NI逃避Nsp14-exoN識(shí)別或者RNA延伸速度超過Nsp14-exoN外切速度，都是克服Nsp14-exoN挑戰(zhàn)的有利方法。

低劑量利巴韋林和IFN-α2b具有協(xié)同效果，體外和在恒河猴中的效果都較好，但是對(duì)危重MERSCoV感染者的臨床結(jié)局無(wú)改善。MERS-CoV感染14d使用利巴韋林和IFN-α2a可以提高生存率，但28d時(shí)施用則沒有效果。但是也有研究發(fā)現(xiàn)利巴韋林和IFN-α2a或者IFN-β1聯(lián)用未提高M(jìn)ERS患者生存率。IFN-α2b和IFN-β1b也用于MERS-CoV確診患者治療。IFN-β1a和利巴韋林聯(lián)用對(duì)確診者生存率無(wú)改善。并發(fā)癥和治療起始時(shí)間，可能影響個(gè)體療效。有利的治療時(shí)間窗口一般是感染后48h。HIV天冬氨酸蛋白酶抑制劑lopinavir/ritonavir和利巴韋林可以降低醫(yī)療人員MERS-CoV感染率約40%。lopinavir/ritonavir和IFN-β1b聯(lián)合治療，可以改善感染MERSCoV的小長(zhǎng)尾猴的癥狀和病理。2016年啟動(dòng)了lopinavir/ritonavir和IFN-β1b聯(lián)合治療MERS-CoV感染患者的2/3期 臨床試驗(yàn)(NCT02845843)，評(píng)估其安全性、有效性和可能性。但結(jié)果未知。

Beta-D-N4-hydroxycytidine(NHC)是胞嘧啶類似物。其機(jī)理主要是導(dǎo)致病毒突變，但是對(duì)冠狀病毒抑制機(jī)理尚不清楚。腺苷酸類似物(Adenosine analogue)BCX4430，gemcitabine hydrochloride是脫氧胞嘧啶類似物，抑制MERS-CoV和SARS-CoV。尿苷類似物(Uridine analogue)6-azauridine抑制HCoVNL63。鳥苷類似物阿昔洛韋抑制HCoV-NL63和MERS-CoV。

免疫抑制劑咪唑核苷類抗代謝藥咪唑立賓(Mizoribine)可抑制嘌呤合成途徑中的次黃苷酸脫氫酶(IMPDH)和單磷酸鳥嘌呤核苷合成酶(cMP)，使鳥苷酸合成減少，細(xì)胞內(nèi)RNA和DNA合成減少，抑制SARS-CoV，但是也阻止增殖的淋巴細(xì)胞由G0期進(jìn)展為S期，抑制抗體的產(chǎn)生及記憶性B淋巴細(xì)胞和記憶輔助性T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生。

抗體：?jiǎn)慰寺】贵w(monoclonal antibodies，mAbs)領(lǐng)域正在飛速前進(jìn)。單克隆抗體亞型包括IgG1，IgG1κ mAb等。目前主要開發(fā)靶向病毒保守結(jié)構(gòu)或者膜蛋白的廣譜中和單克隆抗體。但是，單克隆抗體的逃逸突變體也很常見。單克隆抗體需要考慮的方面包括：抗體亞型、半衰期、活性、組織滯留時(shí)間、不同部位的藥代動(dòng)力學(xué)、劑量、給藥途徑(口服、注射等)、與其他藥物的聯(lián)合使用、患者耐受性、抗原性等。單價(jià)、三價(jià)或多價(jià)納米抗體也需要考慮。

轉(zhuǎn)基因牛生產(chǎn)人多克隆IgG抗體：靶標(biāo)是MERSCoV刺突蛋白(spike protein)(SAB-301)。體外，該多克隆抗體可以有效中和病毒，降低被感染小鼠肺部的病毒滴度。I期臨床(NCT02788188)結(jié)果發(fā)現(xiàn)SAB-301安全性和耐受性較好。針對(duì)這個(gè)靶標(biāo)的單克隆抗體，也在進(jìn)行單藥劑量增加的靜脈注射的安全性、耐受性、藥代動(dòng)力學(xué)和免疫原性評(píng)估(NCT03301090)。

3.2 其他藥物

IFN-αβ抑制劑和IFN-λIFN-αβ誘導(dǎo)ISGs，限制病毒復(fù)制。IFN-αβ招募更多IMM和其他免疫細(xì)胞發(fā)揮功能，也會(huì)加劇病情。SARS-CoV-感染小鼠中，早期干擾素應(yīng)答有保護(hù)作用，滯后IFN-αβ信號(hào)傳遞使得抗SARS-CoV免疫應(yīng)答失控。IFN治療的時(shí)機(jī)很重要。治療時(shí)機(jī)正確才可能有效。IFN-αβ受體阻斷劑或者拮抗劑可防止晚期重癥患者的過度炎癥。IFNαβ主要通過單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞介導(dǎo)促炎癥活性。與IFN-αβ不同，IFN-λ主要激活上皮細(xì)胞的抗病毒基因，又不過分刺激免疫系統(tǒng)，阻止招募嗜中性粒細(xì)胞到炎癥部位。 SARS-CoV和MERS-CoV主要感染肺泡上皮細(xì)胞，因此IFN-λ可能用作治療。

抑制氧化磷脂(oxidized phospholipid，OxPL)[21]：甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)感染的小鼠中，氧化磷脂經(jīng)TLR4-TRIF信號(hào)通路，增加肺部巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子/趨化因子產(chǎn)生，促進(jìn)急性肺損傷(acute lung injury，ALI)。TLR4拮抗劑Eritoran(分子式C66H126N2O19P2)降低OxPL、炎癥性細(xì)胞因子和趨化因子水平，保護(hù)小鼠免受IAV致死性感染。Eritoran免疫調(diào)控活性強(qiáng)，但無(wú)直接抗病毒活性，可以降低炎癥應(yīng)答。Eritoran或其他類似化合物抑制OxPL，抑制hCoV誘導(dǎo)的炎癥。

表3 冠狀病毒感染防控措施

圖5 部分化合物結(jié)構(gòu)

鞘氨醇-1-磷酸受體1(Sphingosine-1-phosphate receptor 1，S1P1)拮抗劑：感染IAV的小鼠，內(nèi)皮細(xì)胞鞘氨醇-1-磷酸受體1信號(hào)傳遞可以協(xié)調(diào)病理性炎癥應(yīng)答。靶向S1P1激活可以限制過度招募炎癥細(xì)胞，抑制促炎癥細(xì)胞因子和趨化因子，降低IAV誘導(dǎo)的發(fā)病率和死亡率。SARS-CoV感染人和非人靈長(zhǎng)類的肺部上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，驅(qū)動(dòng)S1P1-介導(dǎo)的炎癥性細(xì)胞因子/趨化因子應(yīng)答，積累嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。激活S1P1可能治療hCoV患者，降低病理性細(xì)胞因子/趨化因子應(yīng)答。

3.2.1 抑制單核細(xì)胞招募和功能的分子

IMMs在致死性hCoV感染中發(fā)揮功能。小鼠心肌炎癥模型中，脂類納米顆粒遞送含有干擾CCR2的RNA(short interfering RNA，siRNA)可以降低CCR2 mRNA，破壞招募IMM到炎癥部位的功能，改善預(yù)后。hCoVs是單鏈RNA(single-stranded RNA，ssRNA)病毒，TLR7激活劑R837 (合成的ssRNA模擬分子)刺激IMMs，誘導(dǎo)很強(qiáng)的炎癥應(yīng)答。這提示hCoV感染時(shí)，可能是IMM特異性TLR-7信號(hào)傳遞促進(jìn)過度炎癥。TLR7拮抗劑可能減輕炎癥，改善治療。

3.2.2 其他免疫調(diào)節(jié)分子

hCoV感染后，可能減輕炎癥應(yīng)答的免疫調(diào)節(jié)分子包括細(xì)胞因子/趨化因子抑制劑，危險(xiǎn)相關(guān)分子模式(danger-associated molecular pattern，DAMP)拮抗劑。SARS-CoV感染小鼠中，TNFα是急性肺損傷的重要因素，破壞T細(xì)胞應(yīng)答。體外中和TNFα活性或者感染缺乏TNFR的小鼠，都可以預(yù)防SARS-CoV-誘導(dǎo)的發(fā)病和死亡。但是，TNFα只在SARS感染者后期血清中檢測(cè)到。

炎癥是有效免疫應(yīng)答必不可少的，否則很難清除致病菌。首先是識(shí)別致病菌，然后招募免疫細(xì)胞，清除致病菌，最后修復(fù)組織，恢復(fù)穩(wěn)態(tài)。但是，高致病性冠狀病毒等誘導(dǎo)大量持久的細(xì)胞因子/趨化因子，稱為細(xì)胞因子風(fēng)暴，導(dǎo)致免疫病變和高死亡率。尸檢提示來自IMM和嗜中性粒細(xì)胞的細(xì)胞因子/趨化因子具有重要作用。干預(yù)細(xì)胞因子/趨化因子可能減輕病理性炎癥應(yīng)答。感染早期、晚期的高病毒載量與人疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，控制病毒載量、降低其炎癥應(yīng)答可能也有利于治療。這需要找出冠狀病毒感染患者或者動(dòng)物中，介導(dǎo)炎癥應(yīng)答的特異性信號(hào)途徑。

4 有待研究的問題

病毒顆粒相關(guān)的附屬蛋白在冠狀病毒生活周期中的作用？附屬蛋白抑制干擾素信號(hào)傳遞的機(jī)制？附屬蛋白與病毒結(jié)構(gòu)蛋白之間的相互作用？不同冠狀病毒入侵方式及主要功能受體差異？不同冠狀病毒S蛋白的裂解特點(diǎn)及誘導(dǎo)膜融合規(guī)律？病毒組織嗜性與致病性改變同S蛋白結(jié)構(gòu)的關(guān)系？CoV nsp15 EndoU的天然靶標(biāo)？EndoU活性對(duì)dsRNA命運(yùn)的影響？如何調(diào)控EndoU活性，避免誤切？EndoU如何逃避宿主dsRNA感受器的免疫識(shí)別？與nsp15相互作用的宿主細(xì)胞/病毒的分子如何調(diào)控EndoU活性？冠狀病毒等RNA病毒基因組復(fù)制的場(chǎng)所是所有地方還是局限在雙層膜復(fù)制體？與其復(fù)制有關(guān)的各種膜結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)成分與構(gòu)象，是否有差異？形成復(fù)制細(xì)胞器時(shí)，病毒和宿主的蛋白質(zhì)如何相互作用？雙層膜(DMV)中積累的RNA，有何變化？宿主控制免疫應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)的SNP及其在控制冠狀病毒感染中的作用。從表觀遺傳角度如甲基化、泛素化、磷酸化、糖基化、乙酰化、染色質(zhì)重塑和非編碼RNA等研究人體應(yīng)對(duì)CoV感染的調(diào)控，以及CoV逃避宿主的免疫反應(yīng)的表觀遺傳調(diào)控，從SARS-CoV等冠狀病毒感染細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組可否揭示病毒復(fù)制的信號(hào)通路和網(wǎng)絡(luò)？動(dòng)物模型與人體之間的差異，探索病毒侵入、感染機(jī)制、免疫機(jī)制、需要病毒免疫學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)、藥學(xué)和臨床治療學(xué)等領(lǐng)域協(xié)作。