基于未修飾的絲網(wǎng)印刷電極測定辣椒堿

李韋琴，江豐，曹偉偉，吳婷，潘思軼，徐曉云

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢，430070)

辣椒堿是一種含酚羥基的生物堿，分子式為C18H27O3N，化學(xué)名為反-8-甲基-N-香草基-6-壬烯酰胺，又名辣椒素或辣椒辣素，是辣椒中重要的辣椒素類物質(zhì)，約占辣椒素類物質(zhì)的69%[1-2]，是衡量辣椒品質(zhì)的重要指標(biāo)。具有抗氧化、抗菌消炎、鎮(zhèn)痛止癢、促進(jìn)脂肪代謝等多種生理活性[3-7]。

我國是辣椒生產(chǎn)、消費(fèi)大國[8]，我國的辣椒品種及辣椒制品種類繁多。辣椒堿含量已成為評價辣椒品種及其加工品品質(zhì)的重要指標(biāo)，在辣椒品種的選育方面、食品行業(yè)和制藥工業(yè)上有重要地位[9]。尤其是辣味鹵制品鹵煮過程中，需及時檢測鹵汁中的辣椒堿含量，確保添加適量的辣椒使辣椒堿含量維持在較高的水平，這就迫切需要建立辣椒堿的快速檢測方法。

目前，辣椒堿的測定方法主要有感官測定法、比色法、液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)、液相色譜質(zhì)譜法(liquid chromatography-mass spectrometry, HPLC-MS)、氣相色譜質(zhì)譜法(gas chromatography mass spectrometry, GC-MS)、酶聯(lián)免疫法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)和電化學(xué)(electrochemistry)等方法[10-15]。但是感官測定法受主觀和客觀因素影響較大；比色法操作繁瑣、費(fèi)時費(fèi)事、靈敏度和準(zhǔn)確度低；HPLC是最常用的檢測方法，但所用儀器價格昂貴、成本高、步驟繁瑣；酶聯(lián)免疫法和質(zhì)譜法同樣存在檢測成本高、周期時間長的問題，無法滿足經(jīng)濟(jì)薄弱的中小型企業(yè)需求。而電化學(xué)的方法具有操作簡單、檢測效率高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[16]。目前關(guān)于印刷電極測定辣椒堿的報道大都是將印刷電極進(jìn)行修飾，如已經(jīng)被報道的氨基功能化碳微球修飾的印刷電極[17]及聚(4-苯乙烯磺酸鈉)功能化石墨修飾絲網(wǎng)印刷電極(screen-printed electrode，SPE)[18]，但成本高、步驟繁瑣。因此，制備價格低廉、靈敏度高、穩(wěn)定的未修飾印刷電極在辣椒堿的測定上具有顯著的優(yōu)勢。

本研究建立了一種未修飾的印刷電極測定辣椒堿的方法，與HPLC相比，具有方便快速、成本低、檢測限低的優(yōu)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

貴州辣椒3批(分別記為A、B、C)、重慶辣椒2批(分別記為A、B)、湖北辣椒2批(分別記為A、B)、四川辣椒、河南辣椒、福建辣椒各1批，由周黑鴨國際控股有限公司提供，共10個批次的干辣椒試樣。

辣椒堿(純度≥98%)，上海源葉生物科技有限公司；四氫呋喃、無水乙醇、NaOH、硼酸、H3PO4、乙酸、KOH、醋酸鈉、NaH2PO4、Na2HPO4、HCl均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈、甲醇(色譜級)，賽默飛世爾公司。

CHI850D型電化學(xué)工作站，上海辰華儀器有限公司；Waters 2695高效液相色譜儀，美國沃特世公司；PHS-3電子精密pH計，上海雷磁儀器廠；絲網(wǎng)印刷電極(三電極系統(tǒng)組成：碳電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，碳電極為輔助電極)，武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與安全研究所；DL150-2氮吹儀，杭州佑寧儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的預(yù)處理及辣椒堿的提取

樣品的預(yù)處理：將辣椒樣品除蒂除雜后，在60 ℃干燥箱中烘干，粉碎過100目篩，稱量、裝瓶備用。

干辣椒辣椒堿的提?。簠⒖糋B/T 21266—2007并稍作改動[19]，稱取2.50 g烘干的辣椒樣品于100 mL燒杯中，加入V(甲醇)∶V(四氫呋喃)=1∶1混合溶劑25 mL，保鮮膜封口，50 ℃超聲提取30 min，過濾，濾渣重復(fù)提取2次，合并濾液，60 ℃條件下經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，冷卻后定容至50 mL，取1 mL濾液用氮?dú)獯蹈桑芋w積分?jǐn)?shù)10%乙醇溶解，4 ℃儲存，備用。

辣椒鹵水的制備：取烘干的辣椒2.60 g，添加蒸餾水186.00 g、玉米油14.00 g，130 ℃加熱20 min，得到辣椒鹵水。

辣椒鹵水辣椒堿的提?。簩Ⅺu水倒入分液漏斗，取上層油相，降至室溫后參考文獻(xiàn)[20]提取辣椒堿，取1 mL提取液經(jīng)氮?dú)獯蹈珊?，加體積分?jǐn)?shù)10%乙醇溶解，4 ℃儲存，備用。

1.2.2 電化學(xué)測定條件的優(yōu)化

1.2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的優(yōu)化

選擇KCl濃度為40 mmol/L，電解質(zhì)溶液體系為Britton-Robison(BR)溶液，pH值為2，采用循環(huán)伏安(cyclic voltammetry，CV)法研究5%、10%、20%、30%、40%、50%的乙醇體積分?jǐn)?shù)分別對未修飾印刷電極測定辣椒堿的影響。

1.2.2.2 電解質(zhì)溶液體系的優(yōu)化

1.2.2.3 pH的優(yōu)化

選擇KCl濃度為40 mmol/L，電解質(zhì)溶液體系為BR溶液，辣椒堿溶液中乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%，采用CV法研究pH值分別為1、2、3、4、5、6對未修飾印刷電極測定辣椒堿的影響。

1.2.2.4 KCl濃度的優(yōu)化

選擇電解質(zhì)溶液體系為BR溶液，pH值為1，辣椒堿溶液中乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%，采用CV法研究KCl濃度分別為10、20、40、80、160 mmol/L對未修飾印刷電極測定辣椒堿的影響。

1.2.3 電化學(xué)方法學(xué)考察

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測限的測定

分別選取濃度為0.80、1.68、3.36、6.73、13.46、26.93、53.86、107.72 μmol/L辣椒堿標(biāo)液，采用方波伏安法測定辣椒堿氧化峰電流值，以辣椒堿的濃度為橫坐標(biāo)，以峰電流值為縱坐標(biāo)繪制辣椒堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率(k)和空白樣測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviation, SD)，求得其檢測限(LOD = 3SD/k)。

1.2.3.2 方法精密度和穩(wěn)定性的測定

監(jiān)督是一項要求極高的系統(tǒng)工程，影響監(jiān)督效力的因素本身也是綜合且復(fù)雜的。盡管目前我國的紀(jì)檢監(jiān)察派駐制度成效顯著，然而其不足之處也十分明顯。筆者認(rèn)為可以通過以下途徑進(jìn)行改革與探索，以期盡快解決影響我國紀(jì)檢監(jiān)察派駐功能發(fā)揮的問題。

選擇濃度為107.72 μmol/L的辣椒堿溶液平行測定5次，計算平行測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)來表示精密度大??；選擇濃度為107.72 μmol/L的辣椒堿溶液分別在0、12、24、48、60 h測定其峰電流值，計算不同時間測定值的RSD來表示穩(wěn)定性大小。

1.2.3.3 方法加標(biāo)回收率的測定

取已知辣椒堿含量的樣品9份，分別加入等體積不同濃度的辣椒堿標(biāo)液，得到加標(biāo)濃度為10.00、20.00、40.00 μmol/L的加標(biāo)樣品，各濃度下的加標(biāo)回收率按公式(1)計算：

(1)

1.2.4 HPLC測定辣椒堿

色譜柱為TOSOH TSKgel ODS-100V (5 μm，250 mm×4.6 mm)；柱溫25 ℃；梯度洗脫條件：V(水)∶V(乙腈)=50∶50，等度洗脫30 min；流速1.0 mL/min；檢測波長280 nm；進(jìn)樣量40 μL。

分別配制質(zhì)量濃度為25、50、100、150、200、250 μg/mL的辣椒堿溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用，采用HPLC對各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定。以辣椒堿的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的優(yōu)化

不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對CV法測定辣椒堿的影響如圖1所示。辣椒堿溶液中乙醇體積分?jǐn)?shù)為5%時，辣椒堿氧化峰電流最高，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，辣椒堿的氧化峰電流值減小(圖1-a)，這與S?PSTAD等[21]的研究結(jié)果一致，因為乙醇會影響辣椒堿的電荷轉(zhuǎn)移，抑制辣椒堿的氧化還原反應(yīng)。但辣椒堿作為脂溶性化合物，易溶于有機(jī)溶劑，過低的乙醇體積分?jǐn)?shù)會導(dǎo)致辣椒堿的溶解度降低。因此，選擇10%乙醇體積分?jǐn)?shù)作為適宜的測定條件。

a-不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下辣椒堿的CV曲線;b-不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下辣椒堿的的氧化峰電流值圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對CV法測定辣椒堿的影響Fig.1 The influence of ethanol concentration on measuringcapsaicin with CV

2.2 電解質(zhì)溶液體系的優(yōu)化

不同電解質(zhì)溶液對CV法測定辣椒堿的影響如圖2所示。

由圖2可知，BR、CH3COOH-CH3COONa、NaH2PO4- Na2HPO4三種電解質(zhì)溶液會影響辣椒堿的氧化峰電位值，BR的氧化峰電位值最小(圖2-a)，但3種電解質(zhì)溶液對辣椒堿的氧化峰電流值沒有顯著性影響(圖2-b)，3種電解質(zhì)溶液也在多種電極測定辣椒堿電化學(xué)方法中使用。因此，BR、CH3COOH-CH3COONa和NaH2PO4-Na2HPO4電解質(zhì)溶液均可用于此電極測定辣椒堿。

2.3 pH的優(yōu)化

不同pH對CV法測定辣椒堿的影響如圖3所示。由圖3可知，pH值為1時，辣椒堿氧化峰電位(圖3-a)和電流值(圖3-b)最大。隨著pH值從1升高至4，辣椒堿的氧化峰電位值和電流值逐漸降低，這是因為pH的升高導(dǎo)致辣椒素分子中酚醛結(jié)構(gòu)的部分去質(zhì)子化，這與pH對碳微球修飾絲網(wǎng)印刷電極[17]及鈀修飾的還原型氧化石墨烯電極[2]測定辣椒堿的電流值影響一致。隨著pH值由4升高至6，氧化峰電流值不變，但氧化峰電位繼續(xù)左移?？紤]到靈敏度，選擇pH 1作為最佳pH條件。

a-不同緩沖溶液下辣椒堿的CV曲線；b-不同緩沖溶液下辣椒堿的氧化峰電流值圖2 緩沖溶液對CV法測定辣椒堿的影響Fig.2 The influence of buffer systems on measuringcapsaicin with CV

a-不同pH下辣椒堿的CV曲線;b-不同pH下辣椒堿的氧化峰電流值圖3 pH對CV法測定辣椒堿的影響Fig.3 The influence of pH values on measuring capsaicinwith CV

2.4 KCl濃度的優(yōu)化

不同KCl濃度對CV法測定辣椒堿的影響如圖4所示。KCl的濃度對辣椒堿的氧化峰電位值沒有顯著性影響(圖4-a)，由圖4-b可知，當(dāng)KCl 濃度達(dá)到80 mmol/L時，辣椒堿氧化峰電流值趨于穩(wěn)定， 含80 mmol/L KCl的辣椒堿溶液的氧化峰電流值顯著高于含10、20、40 mmol/L KCl的辣椒堿溶液的氧化峰電流值，與含160 mmol/L KCl的辣椒堿溶液沒有顯著性差異，表明80和160 mmol/L的KCl濃度下電極反應(yīng)容易發(fā)生。因此，選取KCl濃度為80 mmol/L即可滿足要求。

a-不同KCl濃度下辣椒堿的CV曲線;b-不同KCl濃度下辣椒堿的氧化峰電流值圖4 KCl濃度對CV法測定辣椒堿的影響Fig.4 The influence of KCl concentration on measuringcapsaicin with CV

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測限的測定

如圖5所示，在優(yōu)化的檢測條件下，隨著辣椒堿濃度的增加，辣椒堿氧化峰電流顯著增加。辣椒堿響應(yīng)電流值Y與其辣椒堿濃度X在0.80～107.72 μmol/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，線性方程為Y=0.063 5X+0.385 8，R2為0.981 6。該線性范圍比報道的氧化釔(Y2O3)納米粒子修飾的石墨糊電極(1～80 μmol/L)[22]以及Ag/Ag2O納米粒子和還原型氧化石墨烯復(fù)合修飾的印刷電極(1～60 μmol/L)[23]測定辣椒堿的線性范圍寬。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率(k)和空白樣測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)，得到該未修飾印刷電極測定辣椒堿的檢出限為0.13 μmol/L，該檢測限低于本文HPLC測定的辣椒堿檢測限(24.56 μmol/L)，且低于已報道的多壁碳納米管納米金粒子復(fù)合材料修飾玻碳電極[15]和碳納米管修飾石墨電極[24]測定辣椒堿的檢測限(0.89和0.31 μmol/L)。

圖5 辣椒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.5 The calibration plot of capsaicin

2.6 方法精密度和穩(wěn)定性的測定

由表1可知，平行測定的同一辣椒堿標(biāo)準(zhǔn)液(107.72 μmol/L)氧化峰電流值大小的RSD為2.10%，表明精密度好。由表2可知，在0～60 h內(nèi)測定同一辣椒堿標(biāo)準(zhǔn)液的氧化峰電流值大小的RSD為6.53%，具有較好的穩(wěn)定性。以上結(jié)果表明該未修飾印刷電極測定辣椒堿具有良好的精密度和穩(wěn)定性。

表1 精密度實驗結(jié)果Table 1 Results of precision test

表2 穩(wěn)定性實驗結(jié)果Table 2 Results of stability test

2.7 方法加標(biāo)回收率的測定

從表3可知，10、20、40 μmol/L三個不同濃度辣椒堿的樣品的加標(biāo)回收率在91.87%～100.86%之間。結(jié)果表明，此未修飾印刷電極測定辣椒堿的結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以應(yīng)用于實際辣椒樣品中辣椒堿的測定。

表3 辣椒堿的加標(biāo)回收率Table 3 Results of the recovery analysis of capsaicin inthe extract of pepper samples

2.8 電化學(xué)和液相色譜測定辣椒堿的結(jié)果比較

5種不同產(chǎn)地的干辣椒及5種辣椒鹵水中辣椒堿的電化學(xué)和液相色譜測定結(jié)果如表4和表5所示。由表4、表5可知，所有干辣椒及辣椒鹵水中辣椒堿的電化學(xué)測定結(jié)果與HPLC測定結(jié)果基本一致，2種方法測定干辣椒及辣椒鹵水中辣椒堿的RSD較小，分別在0.41%～6.78%、0.80%～8.80%之間，這表明該電化學(xué)檢測方法準(zhǔn)確、可靠，可以作為替代HPLC的方法，應(yīng)用于辣椒及其辣椒制品辣椒堿的測定。

表4 電化學(xué)和液相色譜測定干辣椒辣椒堿的結(jié)果比較Table 4 Comparison of capsaicin content in dried pepperdetermined by electrochemistry and HPLC

表5 電化學(xué)和液相色譜測定鹵水辣椒堿的結(jié)果比較Table 5 Comparison of capsaicin content in bitterndetermined by electrochemistry and HPLC

3 結(jié)論

本實驗對未修飾的印刷電極應(yīng)用于辣椒堿的測定條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了此印刷電極測定辣椒堿的電化學(xué)方法。此印刷電極測定辣椒堿的適宜條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)10%、KCl濃度80 mmol/L、pH 1，3種電解質(zhì)溶液BR、CH3COOH-CH3COONa、NaH2PO4-Na2HPO4溶液均適宜。該方法在0.80～107.72 μmol/L范圍內(nèi)辣椒堿氧化峰電流值與辣椒堿的濃度呈良好線性關(guān)系，檢出限為0.13 μmol/L，具有較好的精密度、穩(wěn)定性及加標(biāo)回收率。此外，該方法可代替?zhèn)鹘y(tǒng)的HPLC法測定辣椒堿，具有操作簡單、成本低、檢測效率高等優(yōu)點(diǎn)，為辣椒堿的快速、準(zhǔn)確測定方法提供了借鑒。