LncRNA SNHG5對高糖缺氧環(huán)境下視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞增殖及遷移的影響

陳雅楠 楊堃2 孟旭霞 王一博 楊靜

(青島大學附屬醫(yī)院，山東 青島 266500 1 眼科； 2 中心實驗室)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病的常見微血管并發(fā)癥，也是糖尿病患者致盲的最常見原因[1]，視網(wǎng)膜因缺氧導致新生血管形成是其發(fā)病的重要因素[2]。研究表明長鏈非編碼RNA(LncRNA)是糖尿病并發(fā)癥病理過程中的重要調(diào)節(jié)因子[3-6]。小核仁RNA宿主基因5(SNHG5)是snoRNA U50以及U50宿主基因外顯子的成熟剪切體[7-8]。為了探討SNHG5對視網(wǎng)膜微血管的作用，本研究選用人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞(HRCECs)建立體外高糖缺氧模型，選用脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染SNHG5過表達質(zhì)粒，觀察SNHG5對高糖缺氧誘導的HRCECs凋亡和遷移能力的影響，以期為DR的預防和治療提供新的切入點。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑

HRCECs購自美國ScienCell公司。細胞培養(yǎng)試劑DMEM培養(yǎng)基購自上海中喬新舟生物科技有限公司；胎牛血清、青霉素和鏈霉素、內(nèi)皮細胞生長因子、胰蛋白酶及PBS購自美國Gibco公司；葡萄糖購自美國Invitrogen公司。實時熒光定量PCR(RT-qPCR)主要試劑細胞裂解液、核DNA清除反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自日本TaKaRa公司；RT-qPCR所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。SNHG5過表達型質(zhì)粒由上海吉凱基因化學技術有限公司設計合成，脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司。Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自上海東仁化學科技有限公司。

1.2 HRCECs的培養(yǎng)及分組處理

HRCECs由液氮罐中取出后置于37 ℃水浴鍋中融化復蘇，以1 000 r/min離心 3 min后，棄上清液，移入加有5 mL且含體積分數(shù)0.10胎牛血清的DMEM混合培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。細胞常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中，隔日換液。當細胞融合度達到90%左右時，按照1∶3的比例傳代培養(yǎng)，將HRCECs接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，留取狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。

細胞按實驗設計隨機分為 5組，分別為正常對照組(A組)、高糖組(B組)、高糖缺氧組(C組)、高糖缺氧過表達組(D組)、高糖缺氧空載組(E組)。各組細胞處理如下：① A組：HRCECs接種于含有5 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基當中，然后置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；②B組：HRCECs接種于含有30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基中，然后置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；③C組：HRCECs接種于含有30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基中，并且置于37 ℃、含體積分數(shù)0.01 O2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；④D組：利用脂質(zhì)體LipofectimineTM2000將其中含有SNHG5目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HRCECs，再將其接種于含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基中，并且置于37 ℃、含體積分數(shù)0.01 O2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；⑤E組：利用脂質(zhì)體LipofectimineTM2000將含有與D組等量的陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HRCECs，將其接種于含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、含體積分數(shù)為0.01 O2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 RT-qPCR方法測定細胞中SNHG5基因相對表達量

將HRCECs以105個/孔的密度均勻接種至6孔板中，待細胞貼壁12 h后，更換無血清培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)細胞使其同步化，按上述實驗設計分組并處理細胞，每組設3個復孔，培養(yǎng)24 h后收集細胞。取處理后的各組細胞，棄液后胰酶消化，PBS沖洗，使用Trizol試劑分組提取細胞總RNA，以紫外分光光度計測定波長260以及280 nm處的吸光度(A)值，測定總RNA的純度和濃度。應用去除基因組DNA反應體系，酶解各組實驗樣本中的DNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為相應的cDNA，并按照TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒(TaKaRa，Japan)說明書中要求配置熒光反應體系，在八聯(lián)管中以cDNA為模板進行PCR擴增，SNHG5上游引物序列：5′-GAGCAGCTCTGAAGATGCAAAGA-3′，下游引物序列：5′-GCTACTCGTCCACACTCAGAACG-3′；內(nèi)參照為β-actin，β-actin上游引物序列：5′-CGAG-AAGATGACCCAGAT-3′，下游引物序列：5′-GA-TAGCACAGCCTGGATA-3′。定量分析結(jié)果以熒光強度(CT值)表示，待檢基因表達水平以β-actin作為參比，采用2-△△CT法計算待檢基因相對含量，以判定基因上調(diào)或下調(diào)幅度。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期的細胞制成細胞懸液，以4×105個/孔的密度接種于6孔板中，于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞融合度達到80%左右。稀釋脂質(zhì)體LipofectimineTM2000和質(zhì)粒并各自孵育5 min后，混合脂質(zhì)體和質(zhì)粒，后室溫靜置20 min，按照LipofectimineTM2000轉(zhuǎn)染試劑使用說明書轉(zhuǎn)染HRCECs，D組轉(zhuǎn)入含有SNHG5目的基因的質(zhì)粒，E組轉(zhuǎn)入與D組等量的陰性對照體，A～C組不做細胞轉(zhuǎn)染處理。4～6 h后觀察細胞狀態(tài)，更換為新鮮的培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染24～48 h后觀察質(zhì)粒上熒光標記基因的表達情況，待熒光率達80%后補加500 μL正常培養(yǎng)基，于細胞的融合度達到90%時收集細胞。

1.5 Annexin V-FITC/PI雙標記染色法檢測細胞凋亡情況

取A～E組HRCECs，經(jīng)胰酶消化后接種于6孔板中，根據(jù)實驗設計分組并相應處理細胞，將HRCECs培養(yǎng)于不同葡萄糖濃度的培養(yǎng)基中，置于含體積分數(shù)0.05 CO2或體積分數(shù)0.01 O2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)；加入胰蛋白酶終止消化，PBS液沖洗3次，1 000 r/min離心5 min重懸細胞，均勻分成四管，分別標號為1、2、3、4；其中1號管不加任何試劑，2號管加入5 μL Annexin V-FITC，3號管加入5 μL PI，4號管加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI；輕混勻后室溫下避光靜置反應15 min，加PBS每管補至1 mL后混勻，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況；流式細胞儀測定結(jié)果輸入計算機，應用分析程序軟件進行處理，顯示出細胞凋亡百分比。

1.6 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力

將生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)期的HRCECs接種于6孔板中，用無菌200 μL移液槍頭垂直于培養(yǎng)板底畫“一”字水平劃痕，形成一個無細胞區(qū)，PBS洗滌2次去除離壁漂浮的細胞，按照實驗分組加入不同葡萄糖濃度的DMEM培養(yǎng)液，將6孔板置于不同氧濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組細胞設3個復孔，分別于培養(yǎng)后第0、12和36小時在倒置相差顯微鏡下觀察并拍照。用Image J圖像分析軟件分別測量初始無細胞區(qū)面積與當前無細胞區(qū)面積，細胞相對遷移面積=(初始無細胞區(qū)面積-當前無細胞區(qū)面積)/第36小時無細胞區(qū)面積×100%。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 各組HRCECs中SNHG5相對表達量變化

RT-qPCR方法檢測結(jié)果示，A～E組HRCECs中SNHG5基因的相對的表達量分別為1.006±0.101、0.487±0.474、0.335±0.271、1.609±0.153以及0.985±0.131，差異有統(tǒng)計學意義(F=278.007,P<0.05)。HRCECs中SNHG5的相對表達量B組低于A組(P<0.05)，C組低于B組(P<0.05)，D、E組高于C組(P<0.05)，D組高于E組(P<0.05)，其他任意2組間比較差異均無顯著統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 各組HRCECs凋亡百分比比較

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，A～E組HRCECs的凋亡百分比分別為(2.093±0.146)%、(20.690±1.117)%、(28.683±1.728)%、(14.250±0.276)%和(27.697±0.594)%，差異具有顯著統(tǒng)計學意義(F=384.415,P<0.05)。細胞的凋亡百分比B組明顯高于A組(P<0.05)，C組高于B組(P<0.05)，D組低于C、E組(P<0.05)，其他任意2組間比較差異無統(tǒng)計學意義。

2.3 各組HRCECs相對遷移面積比較

析因設計的方差分析結(jié)果顯示，時間、組別及其交互作用均對HRCECs相對遷移面積有明顯影響(F組別=252.93,F時間=791.36,F時間*組別=169.89,P<0.05)。單獨效應結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時間的延長，A～E組HRCECs的相對遷移面積均逐漸增大(F=11.64～186.76,P<0.05)；第12和36小時A～E組細胞相對遷移面積比較差異有統(tǒng)計學意義(F=102.28、268.84，P<0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示，B組細胞在培養(yǎng)后第12和36小時的相對遷移面積均高于A組(P<0.05)，C組高于B組(P<0.05)，D組低于C、E組(P<0.05)，其他任意2組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組細胞各時間點相對遷移面積比較

3 討 論

隨著LncRNA所受的關注越來越多，其在血管生物學中的作用逐漸被學術界所認識[9-14]。研究表明，LncRNASNHG12具有促進氧葡萄糖剝奪/復氧后的腦微血管內(nèi)皮細胞血管生成以及改善腦微血管內(nèi)皮細胞損傷的作用[15]。SNHG5在多種人類癌癥中表達異常[16-19]，如SNHG5在胃癌、結(jié)腸癌等癌癥組織中表達下調(diào)，并可通過MIR-132-3p途徑抑制結(jié)腸癌細胞凋亡[20-21]。

本研究以HRCECs為研究對象，為模擬糖尿病患者視網(wǎng)膜內(nèi)的高糖缺氧環(huán)境，將高糖環(huán)境培養(yǎng)的HRCECs置于含氧體積分數(shù)為0.01的培養(yǎng)箱內(nèi)，進行體外高糖缺氧環(huán)境的培養(yǎng)實驗。結(jié)果顯示，B組SNHG5的表達量低于A組，C組SNHG5的表達量低于B組，表明高糖缺氧培養(yǎng)可以引起HRCECs中SNHG5的表達下調(diào)。目前，多項研究結(jié)果表明，SNHG5基因在胃癌、腦膠質(zhì)瘤、肝細胞癌、黑色素瘤等多種惡性腫瘤中具有致癌作用[22-24]。此外，外源性沉默SNHG5基因可促進膀胱癌和結(jié)直腸癌細胞凋亡，并抑制相應細胞的增殖能力[25]。本研究將含有SNHG5目的基因的質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染進入HRCECs中，RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，D組的SNHG5基因表達量明顯高于C組，說明通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的HRCECs能夠高表達SNHG5。通過流式細胞儀檢測細胞凋亡的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，D組HRCECs細胞的凋亡百分比明顯低于C組，說明過表達SNHG5基因可以抑制高糖缺氧環(huán)境誘導的HRCECs凋亡，從而提示SNHG5對HRCECs的凋亡過程具有調(diào)控作用。

研究證實，血管內(nèi)皮細胞的遷移能力越強，越有利于新生血管的形成[26]。本研究中利用細胞劃痕法觀察SNHG5對HRCECs遷移能力的影響。結(jié)果顯示，B組細胞第36小時細胞相對遷移面積高于A組，C組細胞第36小時細胞相對遷移面積高于B組，說明高糖缺氧環(huán)境可增加HRCECs的遷移能力；同時發(fā)現(xiàn)D組細胞第36小時細胞相對遷移面積低于C組，因此推測在高糖缺氧環(huán)境中SNHG5對HRCECs遷移起抑制作用。上述實驗結(jié)果提示SNHG5可能在抑制糖尿病性新生血管形成的過程中起重要作用。

DAMAS等[18]相關實驗研究結(jié)果表明，過表達SNHG5可抑制奧沙利鉑介導的直腸癌細胞凋亡，同時進一步證實富含絲氨酸精子發(fā)生相關蛋白2(SPATS2)是SNHG5重要的直接靶點，同時對細胞增殖具有重要調(diào)節(jié)作用。下調(diào)SNHG5可以破壞SPATS2 mRNA的穩(wěn)定性，顯著降低SPATS2蛋白的表達，而過表達SNHG5可以導致SPATS2 mRNA穩(wěn)定性以及蛋白表達增加[18]。因此，我們推測SNHG5在HRCECs增殖過程中的調(diào)節(jié)作用可能通過SPATS2途徑實現(xiàn)，但具體的作用機制仍有待進一步的實驗加以證實。本實驗僅在視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的層面上進行研究，然而視網(wǎng)膜新生血管形成的通路錯綜復雜，是多種因子共同作用的結(jié)果。我們后期的研究將通過構(gòu)建體外新生血管模型或采用糖尿病動物模型，進一步探究SNHG5在DR中的調(diào)控機制以及具體的信號通路。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)高糖缺氧環(huán)境培養(yǎng)可以顯著下調(diào)HRCECs中SNHG5基因的表達，而過表達SNHG5對HRCECs在高糖缺氧環(huán)境下的凋亡和遷移起抑制作用。提示SNHG5在抑制糖尿病性新生血管生成中發(fā)揮著重要的正向調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果為LncRNA在DR預防和治療中發(fā)揮調(diào)控作用提供了更多的實驗室依據(jù)。