紅糖總多酚的提取測定及體外抗氧化作用

張芳銘，滕海輝，金永學，李慧敏，鄭淘，曾藝瓊，鄭慧，楊勇*

1(湖南中醫(yī)藥大學 藥學院食品藥品工程系，湖南 長沙，410208) 2(麻陽鑫茂糖果業(yè)有限公司，湖南 懷化，418000)

紅糖(又稱砂糖)屬于甘蔗粗提物，為甘蔗汁直接脫水產品，屬甘蔗全提取物。由于紅糖采用傳統(tǒng)工藝制作而成，充分保留了甘蔗的各類營養(yǎng)成分，與白糖相比更符合現(xiàn)代健康理念[1-2]。傳統(tǒng)工藝紅糖是以甘蔗為原料，經提汁，澄清，煮煉而成的產品[3]，主要含有蔗糖、果糖、葡萄糖等糖類和甘蔗多酚、維生素、微量元素、氨基酸、蘋果酸、胡蘿卜素、礦物質等非糖成分[4-5]。中醫(yī)認為傳統(tǒng)紅糖具有驅寒暖胃、補血養(yǎng)顏、活血化瘀等功效，其保健功能物質基礎可能與紅糖產品中的非糖成分有密切關系[6]。甘蔗多酚含量高且抗氧化能力強[7]，紅糖作為甘蔗全汁濃縮物，甘蔗多酚在傳統(tǒng)提取濃縮工藝中自然進入紅糖產品，但目前對傳統(tǒng)工藝紅糖產品的多酚類成分研究報道較少。為探討傳統(tǒng)紅糖的保健功能及機制，采用溶劑法提取紅糖中的總多酚，優(yōu)化提取條件，測定不同批次紅糖的總多酚含量，DPPH法和總還原能力測定法評估紅糖產品體外抗氧化能力，擬為傳統(tǒng)工藝紅糖多酚研究提供分析方法和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅糖：批次Ⅰ(10/2018)、批次Ⅲ(11/2018)、批次Ⅴ(10/2019)、批次Ⅵ(12/2019)、批次Ⅶ(01/2020),麻陽鑫茂糖果業(yè)有限公司；批次Ⅱ(11/2017)、批次Ⅳ(01/2017)，麻陽縣福壽糖業(yè)有限公司；沒食子酸標準品(HPLC≥98%)、維生素C標準品(純度≥99%)、福林酚試劑(1 mol/L)，上海源葉生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)，純度>97.0%，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；NaH2PO4(分析純)，汕頭市西隴化工廠有限公司；Na2HPO4(分析純)，天津市恒興化學試劑制造有限公司；無水乙醇(分析純)，成都市科隆化學品有限公司；無水Na2CO3、鐵氰化鉀、三氯乙酸、FeCl3，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

CP114電子天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司；DZKW-4電子恒溫水浴鍋、SHB-Ⅲ-B真空泵，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；80-2臺式離心機，金壇市大地自動化儀器廠；RE-52旋轉蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；紫外-可見分光光度計UV-1800，日本島津有限公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Waters 1525高效液相色譜儀，美國沃特世公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅糖總多酚提取條件優(yōu)化實驗

1.2.1.1 標準曲線繪制與測定方法

參照文獻[8]采用福林酚比色法測定多酚含量，并進行適當調整。精確配制質量濃度為0.05 mg/mL的沒食子酸標準液，分別取沒食子酸標準液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于25 mL容量瓶中，分別加蒸餾水至5 mL，混勻后加入1.0 mL福林酚顯色劑，搖勻，反應1 min后，再依次加入100 g/L Na2CO3溶液8 mL，定容至刻度線。20 ℃避光反應2 h，于760 nm波長處檢測吸光度。以沒食子酸質量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

準確稱取1.5 g紅糖(批次Ⅶ，含水質量分數(shù)6.460%)，按一定液料比加入乙醇溶液，在一定溫度下提取一定時間后，再將提取液進行離心過濾，濾液在45 ℃下旋轉蒸發(fā)后，用蒸餾水定容至100 mL，得待測液。取待測液1 mL置于25 mL容量瓶，同標準曲線方法操作，測定其吸光度值。通過標準曲線方程得公式(1)計算總多酚含量。

(1)

式中：A，紅糖樣品的吸光度值；m，紅糖質量，g。

1.2.1.2 單因素實驗

為了考察不同因素對紅糖總多酚提取效果的影響，根據(jù)所查文獻和預實驗結果[9-12]，選擇乙醇體積分數(shù)(30%、40%、50%、60%、70%)、液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1)、提取溫度(20、30、40、50、60 ℃)和提取時間(30、35、40、45、50、55 min)進行單因素實驗。

固定液料比20∶1(mL∶g)，提取溫度50 ℃，提取時間30 min的條件下，乙醇體積分數(shù)分別為30%、40%、50%、60%、70%，同1.2.1.1方法對紅糖總多酚進行提取并計算含量。

固定乙醇體積分數(shù)50%，提取溫度50 ℃，提取時間30 min的條件下，液料比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1 (mL∶g)，同1.2.1.1方法對紅糖總多酚進行提取并計算含量。

固定乙醇濃度50%，液料比20∶1(mL∶g)，提取時間30 min的條件下，提取溫度分別設置為20、30、40、50、60 ℃，同1.2.1.1方法對紅糖總多酚進行提取并計算含量。

固定乙醇體積分數(shù)50%，液料比20∶1(mL∶g)，50 ℃下，分別提取30、35、40、45、50、55 min，同1.2.1.1方法對紅糖總多酚進行提取并計算含量。

1.2.1.3 響應面法優(yōu)化提取條件

根據(jù)單因素實驗所確定的乙醇濃度、液料比、提取溫度、提取時間的最優(yōu)區(qū)間，利用Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken響應面優(yōu)化分析，采用4因素3水平的響應面分析法，以多酚提取含量為響應值，優(yōu)選出紅糖總多酚的最佳提取條件，實驗因素與水平見表1。

表1 紅糖多酚提取條件響應面分析因素與水平設計Table 1 Response surface analysis factors and levelsdesign of extraction conditions of total polyphenolsin brown sugar

1.2.2 不同批次紅糖多酚定量定性分析

1.2.2.1 不同批次紅糖總多酚含量的測定

準確稱取1.5 g不同批次的紅糖(分別為批次Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ)，按最優(yōu)提取條件進行提取，后續(xù)操作同1.2.1.1方法，另測定不同批次紅糖的水分含量，總多酚含量按公式(2)計算,以紅糖干物質為計算基準。

(2)

式中：A，紅糖樣品的吸光度值；m，紅糖質量，g；w，紅糖含水質量分數(shù)。

1.2.2.2 不同批次紅糖多酚的HPLC定性分析

色譜條件：使用Agilent的ZORBOX-C18液相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相(體積比)：流動相A(甲醇)∶流動相B(0.5%乙酸)=1∶99；紫外檢測波長280 nm；流速1 mL/min；進樣量10 μL；柱溫30 ℃[13-14]。

1.2.3 紅糖體外抗氧化能力評價

1.2.3.1 DPPH自由基清除能力測定

分別取總多酚質量濃度為0.012，0.024，0.036，0.048，0.060 mg/mL的不同批次紅糖(批次Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ)多酚提取液1 mL于試管中，分別加入4 mL質量濃度為0.05 mg/mL DPPH的乙醇溶液，用力振蕩混勻后，室溫避光反應30 min，以無水乙醇為空白，于517 nm處測定吸光度值[15-17]，按公式(3)計算DPPH自由基清除率。

(3)

式中：A0,1.0 mL蒸餾水+4.0 mL DPPH溶液的吸光度；As,1.0 mL樣品溶液+4.0 mL DPPH溶液的吸光度；Ac,1.0 mL樣品溶液+4.0 mL無水乙醇的吸光度。

分別取不同批次紅糖多酚樣品溶液(批次Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ)各1 mL于試管中，后續(xù)操作與計算同上述方法，得到不同批次紅糖多酚提取液的DPPH自由基清除率。

1.2.3.2 總還原能力的測定

物質還原能力的測定就是對該物質將Fe3+還原為Fe2+能力的測定[18]。取不同批次紅糖多酚提取液1 mL，依次加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)和2.5 mL 10 g/L的鐵氰化鉀溶液，混勻后在50℃水浴下反應30 min，然后加入2.5 mL 100 g/L的三氯乙酸，在3000 r/min下離心10 min，取2.5 mL上清液，依次加入2.5 mL蒸餾水和1 g/L的FeCl3水溶液0.5 mL,混勻后室溫反應10 min，以溶劑為空白，在700 nm波長下測定吸光度(吸光度越大，還原能力越強)[19-21]。

2 結果與分析

2.1 標準曲線回歸方程

測定不同質量濃度沒食子酸標準品溶液760 nm處吸光度值，根據(jù)測定結果，得到沒食子酸標準曲線回歸方程為y=20.171x+0.004 2，R2=0.998 8。

2.2 單因素實驗

2.2.1 乙醇體積分數(shù)對多酚提取的影響

由圖1可知，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，紅糖總多酚含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當φ(乙醇)=60%時，提取含量最大，當φ(乙醇)>60%時，得率下降明顯。這可能是由于紅糖為蔗汁濃縮物，含有蛋白質、多糖等大分子物質，當φ(乙醇)>60%時，多酚會與這些大分子類物質復合或包埋，而在高濃度醇溶液中沉降，從而降低了多酚提取率。

圖1 乙醇體積分數(shù)對紅糖總多酚提取的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extractionof total polyphenols from brown sugar

2.2.2 液料比對多酚提取的影響

液料比對紅糖總多酚提取的影響如圖2所示。紅糖總多酚的含量隨著液料比的增加呈現(xiàn)先上升、中間段平穩(wěn)、后下降的趨勢。增大液料比，可增大紅糖與提取溶劑的接觸面積，從而增加多酚成分的溶出，提高提取含量。當液料比為30∶1時，紅糖總多酚提取含量最高；提取溶劑用量繼續(xù)增大時，紅糖總多酚提取含量反而下降。

圖2 液料比對紅糖總多酚提取的影響Fig.2 Effect of liquid material ratio on extractionof total polyphenols from brown sugar

2.2.3 溫度對多酚提取的影響

由圖3可知，紅糖總多酚的含量隨溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。50 ℃時紅糖總多酚提取含量最高。溫度繼續(xù)升高時，紅糖多酚提取含量下降。這可能是由于溫度持續(xù)增加會破壞多酚結構，從而使多酚含量下降，所以，最佳溫度為50 ℃。

圖3 提取溫度對紅糖總多酚提取的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extractionof total polyphenols from brown sugar

2.2.4 提取時間對多酚提取的影響

如圖4所示，在提取時間30～55 min間，紅糖多酚提取含量隨時間的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。45 min時，提取含量最大。45 min后，提取含量隨時間的增加而下降。這可能由于長時間提取會使部分多酚物質被氧化，所以，最佳提取時間為45 min。

圖4 提取時間對紅糖總多酚提取的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction oftotal polyphenols from brown sugar

2.3 響應面優(yōu)化實驗

以單因素實驗為基礎，采用4因素3水平的響應面法對紅糖總多酚提取條件進行優(yōu)化分析，實驗設計與結果見表2。

表2 紅糖總多酚提取條件響應面法實驗設計與結果Table 2 Response surface method design and results

對表2數(shù)據(jù)進行分析，得紅糖總多酚與提取各因素變量間的函數(shù)關系，所得的編碼因子二次多項式方程為：

總多酚含量=+6.71-0.19A-0.022B-0.074C-0.026D+0.12AB+0.040AC-0.052AD-0.000 75BC-0.076BD+0.088CD-0.24A2-0.059B2-0.047C2-0.12D2

由表3數(shù)據(jù)分析可知，回歸模型F=4.38，P=0.005 7<0.01，說明該二次回歸方程模型差異高度顯著，模型成立有統(tǒng)計學意義。失擬項方差分析表明，F(xiàn)=0.95，P=0.587 1>0.05，失擬項不顯著，說明模型擬合良好，可以用此模型對紅糖總多酚的提取工藝進行分析并預測其最佳工藝參數(shù)。

表3 響應面二次模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of response surfacequadratic model

注：P<0.001表示差異極顯著；P<0.01表示差異高度顯著；P<0.05表示差異顯著

由回歸方程顯著性檢查結果分析，回歸方程的一次項中，乙醇體積分數(shù)(A)對紅糖總多酚提取含量差異極顯著，提取溫度(C)對紅糖總多酚提取含量差異接近顯著，液料比(B)和提取時間(D)對紅糖總多酚提取含量差異不顯著。二次項中，乙醇體積分數(shù)(A2)差異極顯著，提取時間(D2)差異顯著。由P值的大小可得出各因素對紅糖總多酚提取含量的影響排序為：乙醇體積分數(shù)(A)>提取溫度(C)>提取時間(D)>液料比(B)。

各因素對紅糖總多酚提取含量影響的響應面曲線圖和等高線圖見圖5。

a-乙醇體積分數(shù)和液料比;b-乙醇體積分數(shù)和提取溫度;c-乙醇體積分數(shù)和提取時間;d-液料比和提取溫度;e-液料比和提取時間;f-提取溫度和提取時間圖5 各因素對紅糖總多酚提取含量影響的響應面曲線圖和等高線圖Fig.5 Response surface curve and contour map ofthe influence of various factors on the extraction totalpolyphenol content from brown sugar

利用Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken響應面優(yōu)化分析，得到紅糖總多酚提取的最佳條件為：乙醇體積分數(shù)為52.78%，液料比為25.54∶1(mL∶g)，提取溫度為40 ℃，提取時間為44.82 min。紅糖總多酚提取含量預測值為6.828 mg/g?？紤]到實驗的可操作性，調整工藝參數(shù)為：乙醇體積分數(shù)53%，液料比26∶1(mL∶g)，提取溫度40 ℃，提取時間45 min。在此最優(yōu)提取條件下，進行3次驗證實驗，紅糖總多酚的最終提取含量為6.794 mg/g，與預測值6.828 mg/g接近，表明回歸模型可以較好的反映紅糖多酚的最佳提取條件。

2.4 不同批次紅糖總多酚含量的測定結果

按最優(yōu)提取條件提取不同批次的紅糖的總多酚,采用前文方法測定提取液的總多酚含量，按扣除水分后的不同批次紅糖干物質為計算基準表示總多酚含量見表4。

表4 不同批次紅糖的總多酚含量Table 4 Total polyphenol content of differentbatches of brown sugar

2.5 不同批次紅糖多酚HPLC檢測結果

將批次Ⅰ和批次Ⅴ的紅糖多酚提取液按前文色譜條件進樣分析，色譜圖見圖6。批次Ⅰ與批次Ⅴ的紅糖多酚HPLC色譜圖中各個峰出峰時間一致，說明所含多酚種類相同，但峰面積有一定差異，因此不同批次紅糖多酚種類間含量存在差異。

2.6 紅糖的抗氧化能力評價

2.6.1 紅糖多酚DPPH自由基清除能力

總多酚質量濃度同為0.012，0.024，0.036，0.048，0.060 mg/mL的不同批次紅糖多酚提取液的DPPH自由基清除率測定結果見圖7。

由圖7可知，不同批次紅糖多酚提取液的DPPH自由基清除能力折線基本重合。這表明，原料均為紅糖，樣液均為紅糖總多酚提取液的情況下，不同批次在同濃度下清除DPPH自由基的能力差異不大，且紅糖多酚的DPPH自由基清除能力與其質量濃度呈正相關。說明來源于不同批次紅糖的多酚在同一多酚濃度下的抗氧化能力基本相同。當質量濃度為0.060 mg/mL時，批次Ⅰ、批次Ⅱ、批次Ⅳ紅糖多酚提取液的DPPH自由基清除率分別為56.447%、60.606%、62.623%。

a-批次Ⅰ;b-批次Ⅴ圖6 不同批次的紅糖多酚色譜圖Fig.6 Chromatogram of different batches of brown sugarpolyphenols

圖7 不同批次紅糖多酚提取液的DPPH自由基清除能力Fig.7 DPPH free radical scavenging capacity of differentbatches of brown sugar polyphenol extracts

2.6.2 不同批次紅糖的DPPH自由基清除能力

不同批次紅糖提取液的DPPH自由基清除能力測定結果見表5。紅糖多酚提取液的DPPH自由基清除能力與其總多酚含量呈正相關，即總多酚含量越多，DPPH自由基清除能力越強。

表5 不同批次的紅糖多酚提取液多酚含量與對DPPH自由基的清除能力Table 5 Polyphenol content and DPPH free radical scavenging ability of different batches of brown sugar polyphenol extract

2.6.3 不同批次紅糖的總還原能力

由表6可知，吸光度值隨其總多酚含量的增大而增大，即不同批次紅糖多酚的總還原能力與其多酚含量呈正相關。

表6 不同批次的紅糖多酚提取液多酚含量與總還原能力Table 6 Polyphenol content and total reduction capacity of different batches ofbrown sugar polyphenol extract

3 結論

通過響應面法優(yōu)化得到紅糖多酚的提取條件為：乙醇體積分數(shù)為52.78%，液料比為25.54∶1(mL∶g)，提取溫度為40 ℃，提取時間為44.82 min，調整工藝參數(shù)為：乙醇體積分數(shù)53%，液料比26∶1(mL∶g)，提取溫度40 ℃，提取時間45 min，為紅糖總多酚的提取提供了科學依據(jù)。

紅糖多酚具有一定的抗氧化能力，且其抗氧化能力與其總多酚含量呈正相關。不同批次的紅糖多酚在同質量濃度下，抗氧化能力無明顯差異，但不同產品間因為多酚含量差異較大，故抗氧化能力差異也大。