HBV感染型原發(fā)性肝癌患者腫瘤微環(huán)境中CD4+、CD8+T細(xì)胞和VEGF水平變化特征及其臨床意義

方菊梅 張萬里 陳怡發(fā) 劉黎明 黃慶勇

原發(fā)性肝癌在臨床治療中是1種比較常見的惡性消化道腫瘤之一，發(fā)病人群主要在40～50歲的中年男性人群中[1-2]。目前具體的發(fā)病機(jī)制還沒有找到，但普遍認(rèn)同這一觀點(diǎn)：病毒性肝炎、肝硬化以及黃曲霉素等化學(xué)致癌物質(zhì)病變、環(huán)境因素與原發(fā)性肝癌之間有著一定的聯(lián)系，而最主要的危險因素是長期慢性HBV感染[3-4]。原發(fā)性肝癌腫瘤惡性程度非常高，其外形質(zhì)地堅(jiān)硬，邊緣不整齊且表面凹凸不平，呈巨快型或者大小結(jié)節(jié)型。早期腫瘤可隨時在腦、肺、骨等多處進(jìn)行轉(zhuǎn)移，還有相應(yīng)的并發(fā)癥產(chǎn)生，顯著突出的并發(fā)癥有癌腫破裂出血、肝性昏迷、上消化道出血以及繼發(fā)性感染。少部分的病人會出現(xiàn)高膽固醇血癥、紅細(xì)胞增多癥、低血糖、高血鈣等特殊的癥狀[5-6]。腫瘤的迅速生長增加了肝包膜的張力，造成一定的肝區(qū)疼痛，這也是原發(fā)性肝癌的首發(fā)癥狀將，隨后再出現(xiàn)全身和消化道不適等癥狀。同時，腫瘤細(xì)胞的免疫耐受程度也影響到肝癌細(xì)胞的生長[7-8]。由于原發(fā)性肝癌不易立即診斷出，且治療難，病情發(fā)展迅速，臨床上通常采用手術(shù)進(jìn)行根除，但大多數(shù)患者術(shù)后的預(yù)后性差，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率仍比較高。近年來研究指出，VEGF作為最強(qiáng)的促血管生長因子，其水平的變化會直接影響到腫瘤血管的形成。淋巴浸潤程度也被發(fā)現(xiàn)與腫瘤細(xì)胞數(shù)量有聯(lián)系。國內(nèi)外有關(guān)的研究表明，CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群高水平的表達(dá)會減少患者的免疫耐受發(fā)生[9-11]。但現(xiàn)有的研究在研究HBV感染性原發(fā)性肝癌患者腫瘤微環(huán)境中VEGF和T細(xì)胞亞群水平和VEGF水平變化特點(diǎn)這一方面比較少。因此，筆者根據(jù)多年的臨床經(jīng)驗(yàn)，對是否感染HBV型原發(fā)性肝癌腫瘤患者微環(huán)境中CD4+、CD8+T細(xì)胞表達(dá)情況及血清VEGF水平變化進(jìn)行研究，為臨床研究提供可靠客觀的依據(jù)，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取我院2016年5月至2017年11月期間收治的94例原發(fā)性肝癌患者作為研究對象，按照是否感染HBV進(jìn)行分組，其中對照組為非HBV感染型原發(fā)性肝癌患者40例，觀察組為感染HBV型原發(fā)性肝癌患者54例，參照國際抗癌聯(lián)盟(union for international cancer control，UICC)分期標(biāo)準(zhǔn)[12]：18例I期患者，11例Ⅱ期患者，16例Ⅲ期患者，9例Ⅳ期患者。對照組中男性26例，女性14例，年齡35～50歲，平均年齡(49.9±7.4)歲，體質(zhì)量指數(shù)為(21.1±2.4)kg/m2；觀察組男性35例，女性19例，年齡38～55歲，平均年齡(48.8±7.0)歲，體質(zhì)量指數(shù)為(22.2±1.3)kg/m2，兩組患者在年齡、性別及體重指數(shù)等一般資料差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

表1 兩組一般資料比較(例，%)

1.2 研究對象選定標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①參照《慢性乙型肝炎防治指南》(2015年版)[13]的診斷標(biāo)準(zhǔn)，確診為HBV感染患者；②采集的肝穿刺活檢標(biāo)本≥1 cm；③經(jīng)過本院倫理委員會和患者本人同意，均簽署書面知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠或哺乳期婦女；②患有酒精性肝病、自身免疫性肝病、藥物性肝損傷；③由于其他原因造成臨床資料不全者、中斷治療者。

1.3 檢測方案

1.3.1 CD4+、CD8+T細(xì)胞的檢測 對所有患者的肝穿刺活檢標(biāo)本或肝癌根治切除標(biāo)本進(jìn)行采集，6 h內(nèi)處理，采用購自美國BioLegend公司的流式細(xì)胞儀(FCM)對CD4+、CD8+T細(xì)胞進(jìn)行檢測。

1.3.2 檢測血清VEGF 采集所有患者外周靜脈血各4 ml，3 000 r/min離心10 min，取離心后上清液置于Eppendorf(艾本德)離心管中，在-70 ℃條件下儲存。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunoSorbent assay,ELISA)對血清中的VEGF進(jìn)行測定。試劑和購自上海波亞生物科技有限公司，嚴(yán)格按照指導(dǎo)說明書進(jìn)行操作。

1.4 觀察指標(biāo)

①腫瘤微環(huán)境中CD4+、CD8+T細(xì)胞表達(dá)情況，并計(jì)算CD4+、CD8+T細(xì)胞各占細(xì)胞的比例；②VEGF水平：血清VEGF是反應(yīng)腫瘤新生血管形成活躍程度的重要指標(biāo)，其高水平的表達(dá)或過度表達(dá)直接或間接影響到腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移程度。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組患者CD4+、CD8+T細(xì)胞水平的比較

觀察組感染HBV患者的CD4+T細(xì)胞水平明顯高于對照組，而CD8+T細(xì)胞水平要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對照組，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組患者CD4+、CD8+T細(xì)胞高水平表達(dá)情況比較(例，%)

2.2 兩組患者血清VEGF水平比較

觀察組患者血清VEGF水平顯著高于對照組，差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見表3。

表3 兩組患者血清VEGF水平比較

3 討論

我國屬于肝癌高發(fā)病率區(qū)，肝癌腫瘤惡性增殖迅速，術(shù)后生存率低，預(yù)后性差，嚴(yán)重威脅患者生命安全及身心健康，同時也給患者及其家屬帶來經(jīng)濟(jì)、生活上的壓力，也是引發(fā)中老年人死亡的原因之一[13-14]。肝癌的發(fā)生，腫瘤的惡性增殖、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)都是極其復(fù)雜的過程。

胸腺依賴性淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞)是胸腺中分化成熟的淋巴細(xì)胞，在淋巴和血液循環(huán)中逐漸遍布至機(jī)體的免疫器官和組織中，并且發(fā)揮免疫功能。其生物學(xué)功能較多[15-16]，比如，輔助性T細(xì)胞(Helper T cells,Th)、抑制性T細(xì)胞(Suppressor T cells,Ts)、細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Cytotoxic T cells,Tc)、效應(yīng)T細(xì)胞(Effector T cells,Te)、遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)T細(xì)胞(Delayed type hypersensitivityT cells,Td)、記憶T細(xì)胞(Memory T cell,Tm)等等。按其生物功能可分為Th1、Th2和Th17細(xì)胞亞群[17]，其中Th1細(xì)胞亞群在抗瘤反應(yīng)中產(chǎn)生更為強(qiáng)大的抗腫瘤免疫反應(yīng)；Th2主要管理機(jī)體的體液免疫，其分泌的IL-4細(xì)胞因子對CD8+T細(xì)胞有一定的直接抑制作用[18-19]。CD3細(xì)胞是成熟T淋巴細(xì)胞的表面標(biāo)志，參與T細(xì)胞的信號傳導(dǎo)，穩(wěn)定T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)結(jié)構(gòu)，啟動細(xì)胞內(nèi)的活化過程；CD4是Th細(xì)胞[20]的主要表面標(biāo)志，能夠增強(qiáng)吞噬細(xì)胞介導(dǎo)的抗感染作用和提高B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答，協(xié)助體液免疫和細(xì)胞免疫功能(在腫瘤免疫過程中對CD8+T細(xì)胞和B細(xì)胞起到重要的協(xié)助作用)；而CD8是Tc細(xì)胞表面的主要標(biāo)志，具有抑制性和殺傷力，可對產(chǎn)生特殊抗原反應(yīng)的目標(biāo)細(xì)胞直接進(jìn)行殺滅[21]；CD4/CD8的比值反映機(jī)體免疫功能的穩(wěn)定情況[22]。許多學(xué)者認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞能夠?qū)Ω伟┗颊哌M(jìn)行免疫耐受，通過提高調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞水平來減少患者的免疫功能；或者降低CD8+細(xì)胞來減少Tc細(xì)胞水平，削弱機(jī)體的免疫功能喪失對腫瘤細(xì)胞的殺傷力[23]；而腫瘤細(xì)胞可以改變本身分子表面的受體，從而增加了對免疫系統(tǒng)的抵抗力。劉伯陽等[24-25]學(xué)者也指出，肝癌患者的腫瘤細(xì)胞的增殖和淋巴細(xì)胞的浸潤關(guān)聯(lián)緊密，原發(fā)性肝癌患者外周血單個核細(xì)胞中的CD4+T細(xì)胞水平越高、CD8+T細(xì)胞越低說明患者的預(yù)后性就越差，本文的研究結(jié)果與之一致：觀察組感染HBV患者的CD4+T細(xì)胞水平明顯高于對照組，而CD8+T細(xì)胞水平低于對照組。這是因?yàn)镠BV感染原發(fā)性患者隨著腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，其機(jī)體自身的免疫功能不足以對抗腫瘤，引起CD4+T細(xì)胞水平上升，一旦CD4+T細(xì)胞水平上升其功能作用受到抑制，又大大削弱體液免疫和細(xì)胞免疫；同理CD8+T細(xì)胞水平大幅度的下降，Tc細(xì)胞也隨之減少，不能發(fā)揮對靶細(xì)胞的殺傷作用。

目前，誘發(fā)原發(fā)性肝癌的發(fā)生主要因素有食物中的黃霉菌污染、吸煙、病毒性肝炎、性傳播等，但大量的臨床診治表明，感染HBV和原發(fā)性肝癌的發(fā)生兩者之間關(guān)系最為緊密。HBV是公認(rèn)的全球性公共衛(wèi)生問題，在基因工程疫苗的生產(chǎn)和普及下，其感染率得到有效的控制HBV是誘發(fā)乙肝的病原體，其屬于嗜肝DNA病毒科，而引起機(jī)體感染的是正嗜肝DNA病毒屬。

多血管性是肝癌組織中最典型的特征，腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移在新生血管的基礎(chǔ)上進(jìn)行。由于新生毛細(xì)血管壁較薄弱，通同性較大，使得腫瘤細(xì)胞很容易通過。在毛細(xì)血管形成的過程中，內(nèi)皮細(xì)胞所產(chǎn)生的Ⅳ型膠原酶和纖溶酶原激活活物等，這些多種基質(zhì)的降解酶能夠?qū)ρ芑|(zhì)屏障進(jìn)行破壞，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的大量轉(zhuǎn)移。而VEGF是腫瘤組織中最關(guān)鍵的內(nèi)源性血管發(fā)生因子，具有促進(jìn)血管通透性的增加，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖，細(xì)胞外基質(zhì)的變形及血管的形成特點(diǎn)，還有5種不同的亞型模式。大量研究表明，VEGF的高表達(dá)在門靜脈血栓、腫瘤復(fù)發(fā)過程、微血管浸潤中存在的很大聯(lián)系。其作用過程是，通過細(xì)胞小囊泡器的快速、短時間的特點(diǎn)來提高VEGF水平，進(jìn)而擴(kuò)大血管的通透性，是最強(qiáng)增加血管通透性的物質(zhì)之一。VEGF它有強(qiáng)大的功能可以產(chǎn)生眾多的生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，而其中部分細(xì)胞因子與肝素的親和力非常之高，VEFG在人類及動物的體內(nèi)都能夠檢測出，主要分布于各重要臟器與骨骼組織之中。VEFG具有極強(qiáng)的促血管生成的作用，在人體腫瘤的生長發(fā)展中屬于重要的1種物質(zhì)，癌細(xì)胞繁殖、突變、激活、都會出現(xiàn)VEGF過度表達(dá)的情況，VEGF過度表達(dá)達(dá)或增加會影響腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果也顯示，觀察組患者血清VEGF水平顯著高于對照組，差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說明肝癌細(xì)胞能產(chǎn)生大量的VEGF，大幅度提高了其表達(dá)水平，以此促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖。因VEGF可讓微血管的通透性增強(qiáng)，讓血漿纖維蛋白外泄情況加劇，這對于腫瘤的的繁殖增加提供了非常好的條件，VEGF讓內(nèi)皮細(xì)胞中的囊泡小體進(jìn)行結(jié)合，這在細(xì)胞膜上形成了小孔，從而讓各種生物細(xì)胞、分子從中進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。在此情況下對于血管的生成，癌細(xì)胞因子進(jìn)入其他相鄰細(xì)胞與血管提供了非常充分的先天條件，讓腫瘤的發(fā)生與展、浸潤提供了非常好的環(huán)境。

綜上所訴，HBV感染型原發(fā)性肝癌患者腫瘤微環(huán)境中CD4+、CD8+T細(xì)胞以及血清VEGF水平的表達(dá)情況在肝癌病情發(fā)展過程中有著重要的意義，從這三個指標(biāo)表達(dá)情況上既可以初步了解患機(jī)體免疫情況以及其病情和轉(zhuǎn)移狀態(tài)，讓我們更進(jìn)一步了解肝癌的生物化學(xué)行為，為日后肝癌的治療提供可靠的治療方向。