白茶萎凋過(guò)程萜烯類合成相關(guān)基因的鑒定和表達(dá)分析

陳雪津，王鵬杰，林馨穎，谷夢(mèng)雅，鄭玉成，鄭知臨，葉乃興

白茶萎凋過(guò)程萜烯類合成相關(guān)基因的鑒定和表達(dá)分析

陳雪津，王鵬杰，林馨穎，谷夢(mèng)雅，鄭玉成，鄭知臨，葉乃興*

福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院/茶學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002

萜烯類化合物是植物中重要的次生代謝產(chǎn)物之一，對(duì)茶樹(shù)揮發(fā)性香氣的組成起著重要作用。從茶樹(shù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定獲得了141個(gè)茶樹(shù)萜烯類合成相關(guān)基因，并對(duì)其不同組織表達(dá)特異性進(jìn)行分析，篩選出16個(gè)在茶樹(shù)頂芽和嫩葉中高表達(dá)的萜烯類合成代表基因。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系將茶樹(shù)與擬南芥和葡萄的萜烯類合成相關(guān)基因分成了4個(gè)亞家族；茶樹(shù)萜烯類合成相關(guān)基因含有5~14個(gè)外顯子，在上游啟動(dòng)子區(qū)域分析發(fā)現(xiàn)了大量與光響應(yīng)、植物生長(zhǎng)發(fā)育、激素和脅迫響應(yīng)密切相關(guān)的順式作用元件。熒光定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，、和在白茶萎凋過(guò)程中的表達(dá)顯著上調(diào)；在萎凋4?h和24?h的表達(dá)達(dá)到峰值。本研究結(jié)果為進(jìn)一步挖掘茶葉萎凋過(guò)程中萜烯類合成相關(guān)基因?qū)Σ枞~香氣組分積累提供了理論依據(jù)。

白茶；香氣；萜烯類；表達(dá)分析

茶葉是世界三大無(wú)酒精飲料之一，隨著健康生活理念的傳播，近年來(lái)具有諸多保健功能的茶葉產(chǎn)品在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)廣受歡迎。白茶是一類微發(fā)酵茶，經(jīng)過(guò)的加工工序在各大茶類中最少。白茶的加工工序包括了長(zhǎng)時(shí)間的萎凋和干燥過(guò)程[1]。萎凋是采后茶葉自然緩慢脫水的過(guò)程。茶葉的風(fēng)味化合物（如兒茶素、脂肪酸、揮發(fā)性香氣成分和游離氨基酸等）在萎凋過(guò)程中發(fā)生生理生化改變，維持生理代謝平衡，以抵御脫水脅迫[2-3]。盡管茶葉的揮發(fā)性香氣成分含量非常有限（總干重的0.01%），但它們對(duì)茶葉風(fēng)味有極大影響[4]。在揮發(fā)性香氣中，萜烯類化合物香味活性高、閾值低，賦予白茶高品質(zhì)的花香。

萜烯類生物合成從一個(gè)異戊二烯（Isoprene，C5）結(jié)構(gòu)單位開(kāi)始[5]，根據(jù)其結(jié)構(gòu)單位數(shù)量的不同，可分為單萜（Monoterpene，C10）、倍半萜（Sesquiterpene，C15）和二萜（Diterpene，C20）等。萜烯類生物合成途徑有兩條，分別是在細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行的甲羥戊酸（Mevalonate，MVA）途徑和在質(zhì)體進(jìn)行的2--甲基--赤蘚糖醇-4-磷酸（2--methyl-- erythritol-4-phosphat，MEP）途徑。MVA途徑由兩分子乙酰CoA（Acetoacetyl-CoA）在硫解酶的催化下合成乙酰乙酰CoA，經(jīng)過(guò)一系列酶促反應(yīng)后，最終產(chǎn)生異戊烯基焦磷酸（Isopentyl diphosphate，IPP）及其異構(gòu)體二甲烯丙基焦磷酸（Dimethylallyl diphosphate，DMAPP）。異戊二烯結(jié)構(gòu)單位在IPP和DMAPP相應(yīng)基因作用下合成香葉基焦磷酸（Geranyl diphosphate，GPP）、法尼基焦磷酸（Farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP）和焦磷酸雙葉酯（Geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP）[6]。

揮發(fā)性萜烯類物質(zhì)以糖苷態(tài)儲(chǔ)存于茶樹(shù)芽葉中，作為其香氣前體物質(zhì)[7]。在糖苷水解酶作用下，水解糖苷態(tài)香氣成分，釋放香氣化合物，控制萜烯類化合物轉(zhuǎn)化形成揮發(fā)性萜烯類物質(zhì)[8]。鑒于揮發(fā)性萜烯類物質(zhì)合成相關(guān)基因在茶葉加工過(guò)程的重要作用，目前調(diào)控?fù)]發(fā)性萜烯類物質(zhì)合成途徑的相關(guān)基因已被鑒定并開(kāi)展研究。本課題組前期通過(guò)克隆和表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，二磷酸甲羥戊酸脫羧酶（）[9]、牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶（）[10]和萜類合成酶（）[11]隨著萎凋時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量顯著提升。在茶葉萎凋過(guò)程中可產(chǎn)生特征性香氣物質(zhì)。Hu等[12]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，在烏龍茶萎凋過(guò)程中，萜烯類合成相關(guān)基因誘導(dǎo)單萜與倍半萜等揮發(fā)性香氣物質(zhì)積累。Chen等[2]的研究顯示，白茶萎凋中萜烯類合成酶相關(guān)基因表達(dá)量上調(diào)，催化底物生成單萜化合物，可能作用于白茶的“毫香”特征。Zheng等[13]研究表明，、和基因?qū)Σ铇?shù)揮發(fā)性雜種優(yōu)勢(shì)具有重要的作用。從上述研究結(jié)果可以看出，萜烯類合成相關(guān)基因在揮發(fā)性香氣形成中具有重要的功能。

本研究以福鼎大白茶為供試材料，從茶樹(shù)基因組中鑒定獲得的141個(gè)萜烯類合成相關(guān)基因，根據(jù)其不同組織表達(dá)特異性分析，進(jìn)一步篩選出16個(gè)在茶樹(shù)頂芽和嫩葉中高表達(dá)的萜烯類合成代表基因。通過(guò)生物信息學(xué)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析這些代表基因的生物信息學(xué)特征和在白茶萎凋過(guò)程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)譜，為研究萜烯類合成相關(guān)基因在茶葉萎凋過(guò)程香氣形成的作用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

以福鼎大白茶（var.）春梢一芽二葉為原料，于2019年4月從福建農(nóng)林大學(xué)南區(qū)教學(xué)茶園采集。白茶萎凋試驗(yàn)處理參照陳靜等[14]的方法：室內(nèi)自然萎凋溫度22~25℃，空氣相對(duì)濕度70%~75%。分別收集0.100?g的鮮葉（萎凋處理0?h）和萎凋處理4、8、16、24、32、40、48?h的葉片，共有8個(gè)樣品，設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，經(jīng)液氮速凍后置–80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 茶樹(shù)萜烯類合成相關(guān)基因的鑒定

為了獲得茶樹(shù)萜烯類合成相關(guān)基因的序列信息，在茶樹(shù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http: //tpia.teaplant.org/index.html）中下載[15]。從TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)（www.arabidopsis.org）獲取擬南芥參與萜烯類生物合成途徑的基因序列，并進(jìn)行BLAST-P搜索，閾值為E-value<10-5。

1.3 茶樹(shù)萜烯類合成相關(guān)基因組織特異性表達(dá)分析與篩選

為明確茶樹(shù)萜烯類合成酶在不同組織特異性表達(dá)譜，采用王鵬杰等[16]方法從NCBI SRA（www.ncbi.nlm.nih.gov/sra）下載茶樹(shù)不同組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，包括根、莖、頂芽、嫩葉、成熟葉、老葉、花和果（SRP056466）。使用TopHat2軟件將轉(zhuǎn)錄組可讀數(shù)映射到茶樹(shù)基因組[17]，再通過(guò)HTseq軟件計(jì)算FPKM值（Fragments per kb per million reads）以量化基因表達(dá)水平[18]。利用TBtools軟件對(duì)已注釋的萜烯類合成相關(guān)基因FPKM值歸一化，并進(jìn)行層次聚類分析。

1.4 茶樹(shù)萜烯類合成相關(guān)基因的生物信息學(xué)分析

以|log2 Ratio|≥1為標(biāo)準(zhǔn)篩選出茶樹(shù)頂芽和嫩葉的萜烯類合成相關(guān)代表基因。篩選獲得的茶樹(shù)萜烯類合成相關(guān)的差異表達(dá)基因利用在線網(wǎng)站ExPASy工具（https://web.expasy.org/protparam）進(jìn)行蛋白的氨基酸組成、等電點(diǎn)、疏水性等理化性質(zhì)分析；利用在線網(wǎng)站W(wǎng)oLF PAORT（https://wolfpsort.hgc.jp）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.5 茶樹(shù)萜烯類合成相關(guān)基因的系統(tǒng)進(jìn)化和基因結(jié)構(gòu)分析

將篩選出的茶樹(shù)萜烯類合成相關(guān)基因通過(guò)在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST-P搜索獲得擬南芥和葡萄萜烯類合成相關(guān)基因蛋白質(zhì)序列。利用ClustalW默認(rèn)設(shè)置對(duì)氨基酸進(jìn)行多序列比對(duì)，采用軟件MEGA 7.0的鄰接法（Neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Boostrap值設(shè)置為1?000；利用在線軟件GSDS2.0（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）分析茶樹(shù)萜烯類合成相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)信息。

1.6 茶樹(shù)萜烯類合成相關(guān)基因啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)分析

在茶樹(shù)基因組網(wǎng)站（http://tpia.teaplant.org/ index.html）下載各成員基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上有2?000?bp的序列，使用在線網(wǎng)站Plant CARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)分析。

1.7 總RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR

使用TIANGEN（天根）多糖多酚試劑盒提取茶樹(shù)葉片中RNA，NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)提取出的RNA濃度和純度并用1%凝膠電泳對(duì)RNA的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，使用全式金Easyscript One-step gDNA Removal and cDNA synthesis superMix試劑盒合成cDNA用于qRT-PCR。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹(shù)萜烯類合成相關(guān)基因鑒定與組織特異性表達(dá)分析

通過(guò)使用擬南芥基因序列作為查詢序列，在NCBI中通過(guò)BLASTn搜索，在茶樹(shù)基因組中鑒定獲得141個(gè)萜烯類生物合成相關(guān)基因，并按順序重新命名。其中有39個(gè)基因?qū)儆谳葡╊惿锖铣傻腗VA途徑，102個(gè)基因?qū)儆谳葡╊惿锖铣傻腗EP途徑。這些基因分別來(lái)自17種不同基因家族的成員。

為了解茶樹(shù)萜類合成相關(guān)基因在茶樹(shù)的不同組織表達(dá)模式，利用茶樹(shù)不同組織的基因組原始數(shù)據(jù)，將141個(gè)萜烯類合成相關(guān)基因進(jìn)行不同組織的特異性表達(dá)模式分析（圖1）。

表1 MVA途徑相關(guān)基因熒光定量引物序列

表2 MEP途徑萜類相關(guān)基因熒光定量引物序列

研究發(fā)現(xiàn)在茶樹(shù)萜類合成相關(guān)基因家族中，特異性組織表達(dá)較高的代表性基因包括（TEA031429）（TEA008511）（TEA014739）（TEA001661）（TEA005868）（TEA028769）（TEA022423）（TEA022400）（TEA026311）（TEA019181）（TEA006109）（TEA000926）（TEA005817）（TEA026482）（TEA027323）（TEA010494）（TEA013763）（TEA012305）（TEA018159）（TEA019181）（TEA006109）（TEA011772）（TEA016514）。

2.2 茶樹(shù)萜烯類合成相關(guān)基因編碼蛋白的理化性質(zhì)

經(jīng)過(guò)鑒定和分析，最終獲得16個(gè)茶樹(shù)萜烯類合成相關(guān)基因。結(jié)果顯示（表3）其基因編碼序列（CDS）長(zhǎng)度為711~2?223?bp，編碼氨基酸開(kāi)放閱讀框（ORF）為236~740?aa。利用在線網(wǎng)站ExPASy軟件包對(duì)茶樹(shù)萜烯類合成相關(guān)基因進(jìn)行理化性質(zhì)分析。茶樹(shù)萜烯類合成相關(guān)基因分子量在59.72~181.79?kDa，等電點(diǎn)為4.91~5.10。篩選出的萜烯類合成基因編碼蛋白均為親水性蛋白，但親水程度不同。對(duì)茶樹(shù)萜烯類合成相關(guān)基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示均存在于細(xì)胞核中，其中大部分基因定位于葉綠體，少部分定位到質(zhì)膜、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。

2.3 茶樹(shù)萜烯類合成相關(guān)基因進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

將茶樹(shù)萜烯類合成相關(guān)基因與擬南芥和葡萄萜烯類合成相關(guān)基因的蛋白序列使用ClustalW進(jìn)行多重序列比對(duì)，并使用MEGA構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2）。結(jié)果顯示，茶樹(shù)、擬南芥和葡萄的萜烯類合成相關(guān)基因聚類后可分成4組，其中，亞家族Ⅰ包含茶樹(shù)、、和，亞家族Ⅱ包含、、和，亞家族Ⅲ包含、、和，亞家族Ⅳ包含、、和。除了和與其他兩個(gè)物種不在同一個(gè)亞家族上，其他基因與擬南芥和葡萄都分布在一個(gè)亞家族上。

2.4 茶樹(shù)萜烯類合成相關(guān)基因結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)對(duì)外顯子-內(nèi)顯子結(jié)構(gòu)分析，進(jìn)一步了解茶葉中在萜烯類生物合成的相關(guān)基因。茶葉萜烯類合成相關(guān)基因外顯子-內(nèi)顯子結(jié)構(gòu)圖顯示（圖3），每個(gè)基因的外顯子-內(nèi)顯子數(shù)量差異很大，表明萜烯類合成相關(guān)基因在進(jìn)化過(guò)程中出現(xiàn)了外顯子增加或者缺失現(xiàn)象。大多數(shù)萜烯類生物合成相關(guān)基因的編碼DNA序列中含有5~14個(gè)外顯子。然而本研究發(fā)現(xiàn)包含外顯子在編碼DNA序列中有19個(gè)外顯子。是最長(zhǎng)的萜烯類生物合成相關(guān)基因，基因序列長(zhǎng)度超過(guò)17.5?kbp。此外發(fā)現(xiàn)基因的外顯子-內(nèi)顯子結(jié)構(gòu)沒(méi)有內(nèi)含子。茶葉在萜烯類生物合成相關(guān)基因結(jié)構(gòu)的顯著差異表明，茶樹(shù)基因組在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了顯著的變化。

2.5 茶樹(shù)萜烯類合成相關(guān)基因啟動(dòng)子順式元件分析

為研究茶樹(shù)萜烯類合成相關(guān)基因順式元件的功能，從茶樹(shù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)下載基因轉(zhuǎn)錄起始位置上游2?000?bp的序列，搜索每個(gè)基因順式作用元件。在茶葉萜烯類合成相關(guān)基因啟動(dòng)子中共鑒定出26種順式元件（圖4），其中包含14種光敏信號(hào)元件、3種植物生長(zhǎng)相關(guān)元件、4種脅迫響應(yīng)元件和5種激素響應(yīng)元件。光敏順式元件占有最大部分，包含有MRE、BOX4、ACE、GATA-motif、GT1-motif、AE-box、G-box、LAMP-element、TCT-motif、chs-CMA1a、I-box、GA-motif、AT1-motif和Sp1結(jié)合位點(diǎn)；響應(yīng)茉莉酸酯的CGTCA-motif 結(jié)合位點(diǎn)和響應(yīng)脫落酸的ABRE是萜烯類合成相關(guān)基因啟動(dòng)子中最豐富的響應(yīng)元件。此外，還發(fā)現(xiàn)少數(shù)激素響應(yīng)元件，例如TCA-element（水楊酸）、TGA-element1（生長(zhǎng)素）、P-box（赤霉素），以及脅迫響應(yīng)順式元件，例如MBS（干旱）、ARE（厭氧誘導(dǎo)）和TC-rich repeats（防御和應(yīng)激）。

2.6 參與MVP和MVA途徑的茶樹(shù)萜烯類合成相關(guān)基因表達(dá)量分析

將篩選出的16個(gè)茶樹(shù)萜烯類合成相關(guān)基因，進(jìn)行白茶萎凋過(guò)程中不同時(shí)間段（0、4、8、16、24、32、40、48?h）基因表達(dá)量分析，結(jié)合MVA和MEP途徑繪制圖譜（圖5）。在MVA途徑中發(fā)現(xiàn)6個(gè)基因，催化IPP和DMAPP的形成。隨著萎凋時(shí)間的延長(zhǎng)，和的表達(dá)量呈持續(xù)上升趨勢(shì)，和的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)。進(jìn)入萜烯類生物合成的IPP和DMAPP主要通過(guò)質(zhì)體的MEP途徑，本研究發(fā)現(xiàn)了10個(gè)基因與該途徑有關(guān)。其中，上調(diào)表達(dá)基因有和。大部分基因在0~4?h和16~24?h表達(dá)量上調(diào)，包括、、、、、和，在萎凋過(guò)程中4?h和8?h的最高表達(dá)量比0?h的高了接近2倍。推測(cè)、、、、、和與茶葉單萜類芳香物質(zhì)形成有關(guān)。

注：顏色刻度表示log2轉(zhuǎn)換后的值，紅色代表高表達(dá)，藍(lán)色代表低表達(dá)

表3 茶樹(shù)萜烯類合成相關(guān)基因編碼蛋白的理化性質(zhì)

圖2 茶樹(shù)、擬南芥和葡萄萜烯類合成相關(guān)基因的進(jìn)化樹(shù)

注：（A）萜烯類合成基因蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；（B）萜烯類合成基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。黃色表示外顯子，黑色表示內(nèi)含子

注：MRE、BOX4、ACE、GATA-motif、GT1-motif、AE-box、G-box、LAMP-element、TCT-motif、chs-CMAIa、I-box、GA-motif、AT1-motif和Sp1是光敏響應(yīng)元件；CAT-box、O2-site和GCN4-motif分別是分生表達(dá)組織、玉米醇溶蛋白代謝和胚乳表達(dá)；MBS，ARE和 TC-rich repeats分別是干旱響應(yīng)，厭氧誘導(dǎo)和防御與應(yīng)激響；ABRE、CGTCA-motif、TCA-element、TGA-element1和P-box分別為脫落酸響應(yīng)、茉莉酸酯響應(yīng)、水楊酸響應(yīng)、生長(zhǎng)素響應(yīng)和赤霉素響應(yīng)

注：AACT，乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶；HMGS，羥基-3-甲基戊二酰輔酶合成酶； HMGR，3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶；MVK，甲羥戊酸激酶；PMK，磷酸甲羥戊酸激酶；MVD，二磷酸甲羥戊酸脫羧酶；FPS，法尼基二磷酸合成酶；DXS，脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶；DXR，脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶；MCT，C-甲基-D-赤蘚糖醇4-磷酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶；CMK，（胞苷5-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤蘚糖激酶；MCS，C-甲基赤蘚糖醇2,4-環(huán)二磷酸合成酶；HDS，4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸合成酶；HDR，4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸還原酶；IDI，異戊烯二磷酸異構(gòu)酶；GPS，香葉基二磷酸合成酶；GGPS，香葉基香葉基二磷酸合成酶

3 討論

萜烯類化合物是種類、數(shù)量最豐富的一類植物次生代謝產(chǎn)物[20]。萜烯類合成相關(guān)基因迄今已在佛手[21]、花椒[22]和桂花[23]等物種中進(jìn)行鑒定和表達(dá)分析。本研究從茶樹(shù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定出141個(gè)萜烯類合成相關(guān)基因，對(duì)其的組織表達(dá)特異性進(jìn)行分析，并通過(guò)茶樹(shù)頂芽和嫩葉的表達(dá)豐度進(jìn)行了二次篩選，獲得16個(gè)差異表達(dá)顯著的代表基因。為了將茶樹(shù)中的萜烯類合成相關(guān)基因進(jìn)行功能分類，利用聚類分析構(gòu)建茶樹(shù)、擬南芥和葡萄的萜烯類合成相關(guān)基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。根據(jù)每個(gè)基因的保守性，將具有相似功能的基因分類到同一組，這也為萜烯類合成相關(guān)基因的功能研究提供了可靠依據(jù)。例如在擬南芥中鑒定出3個(gè)萜烯類合成相關(guān)基因在花中特異性表達(dá)，并催化其揮發(fā)性香氣物質(zhì)的積累[24]。根據(jù)進(jìn)化關(guān)系中基因的同源性，可以推測(cè)位于同一亞家族基因可能參與相似的調(diào)控途徑。

MVA途徑和MEP途徑是萜烯類化合物主要的合成途徑。MVA途徑主要參與茶葉倍半萜、三萜類化合物的合成；MEP途徑主要參與茶葉單萜和二萜類物質(zhì)的合成[7]。萜烯類化合物大多具有獨(dú)特的香氣，特別是具有花香的芳樟醇和香葉醇。前人研究發(fā)現(xiàn)芳樟醇、香葉醇及其氧化物等萜烯類化合物是白茶顯“毫香”的特征成分，萎凋過(guò)程中脫水脅迫誘導(dǎo)的萜烯類化合物顯著增加[2]。在茶葉萎凋過(guò)程從0?h到48?h，萜烯類化合物從44種增加到65種[25]。芳樟醇及其氧化物、香葉醇、檸檬醛等萜烯類揮發(fā)物含量隨著萎凋進(jìn)程持續(xù)顯著增加。Han等[26]研究表明，是控制MVA和MEP途徑中代謝通路的關(guān)鍵限速酶，在茶葉萎凋過(guò)程中促進(jìn)了萜類化合物及其前體物質(zhì)的積累。因此，萎凋過(guò)程可能會(huì)顯著影響茶葉萜烯類揮發(fā)物的含量與合成相關(guān)基因的表達(dá)，這與之前的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，和隨著萎凋時(shí)間延長(zhǎng)逐漸上調(diào)，在48?h內(nèi)顯示出表達(dá)峰值，這可能有助于下游萜烯類揮發(fā)物達(dá)到最大程度。

單萜化合物是具有花香的主要物質(zhì)，對(duì)茶葉的品質(zhì)風(fēng)味有重要影響。對(duì)茉莉花不同花發(fā)育階段分析結(jié)果表明，MEP途徑關(guān)鍵基因?qū)岳蚧ㄖ饕獡]發(fā)性香氣化合物-法尼烯、芳樟醇和乙酸芐酯的含量起作用[27]。Xu等[28]研究表明，MEP途徑的相關(guān)基因被激活以響應(yīng)茶葉在萎凋過(guò)程中受到的脅迫?；蚴荕EP途徑控制速率的重要因子[29]，在葡萄中也發(fā)現(xiàn)是揮發(fā)性萜烯類代謝前體異戊二烯基焦磷酸（IPP）及二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）的限速酶之一[30]，預(yù)測(cè)與該基因與在葡萄萜烯類合成途徑的調(diào)節(jié)功能是相似的。姚雪倩等[10]研究發(fā)現(xiàn)，橙花叔醇、香葉醇、芳樟醇和法尼烯在做青后期不斷積累，可能與的表達(dá)量在做青過(guò)程靜置過(guò)程中持續(xù)增高有關(guān)。與該研究對(duì)比發(fā)現(xiàn)，本研究中在白茶萎凋過(guò)程中表達(dá)量持續(xù)增高，在萎凋48?h其表達(dá)量最高可達(dá)到鮮葉的2倍以上。在本研究中，和在萎凋過(guò)程0~4?h和16~24?h表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，預(yù)測(cè)在這兩個(gè)時(shí)間段單萜類化合物得到快速積累。

本研究在茶樹(shù)基因組中鑒定出141個(gè)萜烯類合成相關(guān)基因，結(jié)合基因組織表達(dá)特異性篩選出16個(gè)高表達(dá)的成員，并進(jìn)行系統(tǒng)的發(fā)育進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)和啟動(dòng)子順式作用元件分析。此外采用熒光定量PCR分析萎凋過(guò)程中萜烯類合成相關(guān)基因的表達(dá)譜信息，推測(cè)其在茶葉萎凋過(guò)程中發(fā)揮作用。對(duì)茶葉萎凋過(guò)程中萜烯類合成相關(guān)基因的研究，既為茶葉揮發(fā)性香氣化合物合成機(jī)制提供信息，也為白茶萎凋生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

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Identification and Expression Analysis of Terpene Synthesis Related Genes during the Withering of White Tea

CHEN Xuejin, WANG Pengjie, LIN Xinying,GU Mengya, ZHENG Yucheng,ZHENG Zhilin,YE Naixing*

College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University/Key Laboratory of Tea Science at Universities in Fujian, Fuzhou 350002, China

Terpenes are the important secondary metabolites in plants and play an important role in the composition of the volatile aroma of tea plants. In this study, 141 tea plant terpenoid synthesis-related genes were identified from the tea plant genome database. Their expression specificities in different tissues were analyzed. Sixteen terpene synthetic genes which were highly expressed in the apical buds and young leaves of tea plants were screened. The results of bioinformatics methods show that the phylogenetic relationship divides the genes related to terpene synthesis of tea plant, Arabidopsis and grape into four subfamilies. The terpenoid synthesis related genes contain 5 to 14 exons and a large number of cis-related elements closely related to light response, plant growth and development, hormone and stress response according to the upstream promoter region analysis. Fluorescence quantitative detection showed that the expressions of,andwere significantly up-regulated during the withering process of white tea. The expressions of,,,,,andshowed the highest expressions at 4?h and 24?h after withering. The results of this study provided a theoretical basis for further exploring the functions of terpenoid synthesis related genes in tea.

white tea, aroma, terpenes, expression analysis

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S571.1；Q946.8

A

1000-369X(2020)03-363-12

2019-11-07

2019-12-13

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31270735）、福建農(nóng)林大學(xué)科技創(chuàng)新專項(xiàng)基金項(xiàng)目（CXZX2017181、CXZX2016117）

陳雪津，女，碩士研究生，主要從事茶樹(shù)栽培育種和生物技術(shù)。*通信作者：ynxtea@126.com

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