茶葉微生物固態(tài)發(fā)酵中咖啡堿降解途徑初探

鄭城欽，馬存強(qiáng),2，張正艷，李肖宏，吳婷婷，周斌星*

茶葉微生物固態(tài)發(fā)酵中咖啡堿降解途徑初探

鄭城欽1，馬存強(qiáng)1,2，張正艷1，李肖宏1，吳婷婷1，周斌星1*

1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍潤(rùn)普洱茶學(xué)院，云南 昆明 650201；2. 昆明大樸茶業(yè)有限公司，云南 昆明 650224

為探究微生物作用下咖啡堿的降解產(chǎn)物與途徑，將普洱茶發(fā)酵中篩選鑒定的NRRL250（聚多曲霉）、NRRL4789CBS137324和CBS253.31等優(yōu)勢(shì)菌株分別接種至?xí)袂嗝柽M(jìn)行單菌種固態(tài)發(fā)酵，并采用高效液相色譜（HPLC）測(cè)定咖啡堿、可可堿、茶堿的含量，探究微生物對(duì)咖啡堿代謝的影響；另外，基于UHPLC-QTOF-MS代謝組學(xué)技術(shù)，以滅菌處理組（ST組）和原料組（RM組）為對(duì)照，對(duì)聚多曲霉接種發(fā)酵樣進(jìn)行代謝組學(xué)分析。結(jié)果表明，NRRL4789CBS137324和CBS253.31等優(yōu)勢(shì)菌株對(duì)咖啡堿等嘌呤類(lèi)堿代謝均無(wú)顯著影響，而在聚多曲霉接種發(fā)酵中，咖啡堿含量顯著下降（＜0.05），降幅達(dá)83.89%；茶堿含量顯著增加（＜0.05），發(fā)酵末期含量為(25.03±1.17)?mg·g-1；而可可堿保持基本穩(wěn)定。由此可知，聚多曲霉對(duì)咖啡堿降解代謝有顯著影響。采用UHPLC-QTOF-MS方法檢出茶堿、3-甲基黃嘌呤、1,7-二甲基黃嘌呤等9種與咖啡堿降解相關(guān)的代謝物。在聚多曲霉作用下，茶堿、3-甲基黃嘌呤、1,7-二甲基黃嘌呤、7-甲基黃嘌呤含量顯著提高（＜0.05）。茶堿、3-甲基黃嘌呤、1,7-二甲基黃嘌呤和1-甲基黃嘌呤與咖啡堿及其相關(guān)代謝物的-脫甲基化途徑相關(guān)。1,7-二甲基尿酸、1-甲基尿酸與咖啡堿相關(guān)代謝物的氧化途徑相關(guān)。由此可知，聚多曲霉為降解普洱茶咖啡堿的優(yōu)勢(shì)菌株，且具有將咖啡堿轉(zhuǎn)化為茶堿的潛在能力；在咖啡堿降解代謝過(guò)程中，存在聚多曲霉作用下的-脫甲基化和氧化，并以-脫甲基化為主。

普洱茶；固態(tài)發(fā)酵；聚多曲霉；咖啡堿；降解途徑

黑茶是一類(lèi)由微生物主導(dǎo)下的后發(fā)酵茶類(lèi)[1]。普洱茶（熟茶）是以云南大葉種茶樹(shù)鮮葉[(L.) Var.(Masteas Kitamura)]制成的曬青毛茶為原料，采取特定的加工工藝，加工形成具有獨(dú)特品質(zhì)特征的茶葉[2]。渥堆發(fā)酵是普洱茶（熟茶）品質(zhì)形成的關(guān)鍵工序。在普洱茶渥堆發(fā)酵中，咖啡堿含量多呈現(xiàn)顯著增加的變化趨勢(shì)[3]。然而，由于微生物的影響，在普洱茶渥堆發(fā)酵中偶爾會(huì)出現(xiàn)減少的趨勢(shì)[4-7]。大多數(shù)真菌和細(xì)菌對(duì)嘌呤堿的利用有限[8]，前人僅在茶園和咖啡園土壤中篩選鑒定出幾株可降解咖啡堿的有效菌株[9-10]。Zhou等[11]首次在普洱茶渥堆中發(fā)現(xiàn)可有效降解咖啡堿的菌株為聚多曲霉，其同源性高達(dá)99.8%。

咖啡堿（1,3,7-三甲基黃嘌呤）是茶葉中主要的生物堿和呈味物質(zhì)[12]。研究證明，茶葉生物堿對(duì)人體心血管系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、呼吸和循環(huán)系統(tǒng)等方面的生理活性均有一定影響[13-16]。但咖啡堿的過(guò)量攝入不僅易造成腸胃功能失調(diào)、心悸、嗜睡、血壓升高等不良反應(yīng)，甚至?xí)黾邮?、焦慮、心臟負(fù)荷，降低生育率，骨質(zhì)疏松等健康問(wèn)題[17-19]。因此，人們十分關(guān)注與生物堿含量等相關(guān)的茶飲料的開(kāi)發(fā)，對(duì)低咖啡堿飲料的需求也越來(lái)越迫切。

本文將普洱茶渥堆發(fā)酵中篩選鑒定出的優(yōu)勢(shì)菌株分別接種至?xí)袂嗝柚羞M(jìn)行茶葉單菌種發(fā)酵，探究其對(duì)咖啡堿代謝的影響，從而確定可降解咖啡堿的優(yōu)勢(shì)菌株，并采用UHPLC-QTOF-MS技術(shù)探究可降解咖啡堿菌株作用下的咖啡堿降解代謝途徑，為優(yōu)勢(shì)菌株在茶葉加工中的應(yīng)用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

云南大葉種群體種[Var.(JW Masteas Kitamura)]曬青毛茶購(gòu)自云南昆明茶葉市場(chǎng)。瓊脂粉（生化試劑）購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；乙腈（色譜純）購(gòu)自美國(guó)飛世爾有限公司?？Х葔A（≥99%）、可可堿（≥99%）、茶堿（≥99%）標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

試驗(yàn)菌株：NRRL250（聚多曲霉，GenBank登錄號(hào)：EF652450）、NRRL4789（GenBank登錄號(hào)：NR137468）CBS137324（GenBank登錄號(hào)KJ775437）和CBS253.31（GenBank登錄號(hào)：MH855205）篩選于普洱茶渥堆樣中，在實(shí)驗(yàn)室–20℃條件下純甘油保存。

1.1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（Agilent 1200型，美國(guó)安捷倫公司）。超高效液相色譜儀（Agilent 1290型，美國(guó)安捷倫公司）。高分辨質(zhì)譜儀（Triple TOF? 6600型，美國(guó)AB Sciex公司）。色譜柱[ACQUITY BEH Amide型，規(guī)格（2.1?mm×100?mm×1.7?μm），Waters公司]。

1.2 方法

1.2.1 孢子菌懸液的制備

真菌菌株經(jīng)PDA培養(yǎng)基活化后，用無(wú)菌水進(jìn)行洗脫，轉(zhuǎn)移至錐形瓶，充分振蕩搖勻，并調(diào)節(jié)孢子濃度約為1.0×108CFU·mL-1（Colony forming units，CFU）于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 真菌菌株的茶葉固態(tài)發(fā)酵[20]

稱(chēng)取20?g曬青毛茶，其含水量為6.25%，與12.25?mL蒸餾水混合，使得固態(tài)發(fā)酵體系含水量為38%。1×105Pa滅菌后，每培養(yǎng)瓶接種1?mL目標(biāo)菌株的種子菌懸液，并以接種1?mL無(wú)菌水的發(fā)酵組作為對(duì)照。培養(yǎng)瓶均放置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)（30℃，85%）進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵。參照普洱茶渥堆發(fā)酵方法，每3?d取樣1次，3次重復(fù)，采取HPLC測(cè)定茶樣中咖啡堿、可可堿和茶堿含量[21]。收集聚多曲霉接種發(fā)酵9?d時(shí)60℃條件下的烘干樣作為接種發(fā)酵組（IF），并以滅菌組（ST）和原料組（RM）為對(duì)照，分別進(jìn)行代謝組學(xué)分析。

1.2.3主要嘌呤堿含量測(cè)定

咖啡堿、可可堿、茶堿等主要嘌呤堿含量采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定。上樣液制備：稱(chēng)取3?g磨碎試樣于500?mL錐形瓶中，加沸蒸餾水450?mL，立即移入沸水浴，浸提45?min（每隔l0?min搖動(dòng)1次）。浸提完畢后立即趁熱減壓過(guò)濾，并定容至500?mL。茶湯經(jīng)0.45?μm水系膜過(guò)濾后進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10?μL。色譜條件[22-23]：流動(dòng)相為乙腈和0.2%乙酸水溶液的混合溶液，A相為乙腈，B相為0.2%乙酸水溶液，流速為1?mL?min-1。色譜柱：安捷倫反相Cl8色譜柱（250?mm×4.6?mm×5?μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)為280?nm；柱溫為30℃。洗脫程序?yàn)椋??min，A相8%，B相92%；50?min，A相31%，B相69%。采取梯度洗脫，程序運(yùn)行結(jié)束10?min后進(jìn)下一樣品。

1.2.4 茶葉代謝物萃取與上機(jī)檢測(cè)

稱(chēng)取150?mg樣品于2?mL離心管中，加入1?500?μL提取液（甲醇︰乙腈︰水=2︰2︰1），再加入30?μL核糖醇，渦旋混勻10?s；加入瓷珠，45?Hz研磨儀處理4?min，超聲15?min（冰水浴）；13?000?r·min-1離心15?min后提取上清液用于代謝組學(xué)檢測(cè)[24]。

用于代謝組學(xué)分析的液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)由Agilent 1290型超高效液相色譜儀串聯(lián)Triple TOF? 6600型高分辨質(zhì)譜儀組成。流動(dòng)相色譜條件：A相為25?mmol·L-1醋酸銨＋25?mmol·L-1氨水，B相為100%乙腈，進(jìn)樣體積1?μL，流速500?μL·min-1；洗脫程序?yàn)椋?~0.5?min，A相5%，B相95%；7?min，A相35%，B相65%；8~9?min，A相60%，B相40%；9.1~12?min，A相5%，B相95%。

質(zhì)譜條件：AB 6600 Triple TOF質(zhì)譜儀能夠在控制軟件（Analyst TF 1.7，AB Sciex）控制下基于IDA功能進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。在每個(gè)數(shù)據(jù)采集循環(huán)中，篩選出強(qiáng)度最強(qiáng)且大于100的分子離子進(jìn)行采集對(duì)應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。其電噴霧電離（ESI）離子源參數(shù)設(shè)置如下：在正、負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)，噴霧電壓分別為5?500?V和–4?500?V。霧化氣（GS1）、輔助加熱氣（GS2）和氣簾氣（CUR）的壓力分別為60?Psi（1?Psi=6.89?kPa）、60?Psi、30?Psi，離子源溫度550℃，轟擊能量為35?eV；15張二級(jí)譜圖每個(gè)50?ms。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用XCMS做峰尋找、峰對(duì)齊等數(shù)據(jù)處理（XCMS版本號(hào)：1.41.0）。

物質(zhì)鑒定的數(shù)據(jù)處理及匹配：設(shè)minfrac為0.5，cutoff為0.8。隨后基于XCMS開(kāi)發(fā)的xcms4dda和xcms4lipid程序及自建庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，其篩選原則是在forward或reverse只要其中有1個(gè)被鑒定出來(lái)即保留該peak，首先對(duì)已鑒定的二級(jí)數(shù)據(jù)的peak進(jìn)行篩選。然后對(duì)一級(jí)和二級(jí)數(shù)據(jù)的peak進(jìn)行匹配，尋找一級(jí)數(shù)據(jù)中的peak在二級(jí)數(shù)據(jù)中對(duì)應(yīng)的peak。按照mz tolerance±25?μg·mL-1進(jìn)行匹配。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）：使用SIMCA軟件（V14.1，Sartorius Stedim Data Analytics AB，Umea, Sweden）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)（Log）轉(zhuǎn)換加UV格式化處理。首先對(duì)第一主成分進(jìn)行OPLS-DA建模分析，模型的質(zhì)量用7折交叉驗(yàn)證（7-fold cross validation）進(jìn)行檢驗(yàn)；然后用交叉驗(yàn)證后得到的2（模型對(duì)分類(lèi)變量的可解釋性）、2（模型對(duì)分類(lèi)變量的可解釋性）和2（模型的可預(yù)測(cè)性）對(duì)模型有效性進(jìn)行評(píng)判；最后通過(guò)置換檢驗(yàn)（Permutation test），隨機(jī)多次改變分類(lèi)變量的排列順序得到不同的隨機(jī)Q值，對(duì)模型有效性做進(jìn)一步的檢驗(yàn)。各組對(duì)比OPLS-DA模型的模型累積解釋率見(jiàn)表1。

表1 OPLS-DA模型參數(shù)表

注：2(cum)：代表模型對(duì)變量的累計(jì)解釋度；2(cum)：代表模型對(duì)變量的累計(jì)解釋度；2(cum)：模型的可預(yù)測(cè)性

Note:2(cum): represents the cumulative interpretation ofvariables by the model,2(cum): represents the cumulative interpretation ofvariables by the model, and predictability of the2(cum): model

單變量統(tǒng)計(jì)分析（UCA）：差異化合物篩選和鑒定本項(xiàng)目使用的卡值標(biāo)準(zhǔn)為Student′s檢驗(yàn)的值小于0.05，同時(shí)OPLS-DA模型第一主成分的變量投影重要度（Variable importance in the projection，VIP）大于1。

差異代謝物的代謝通路分析（Pathway analysis）：通過(guò)差異代謝物對(duì)KEGG、PubChem等權(quán)威代謝物數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行映射，對(duì)應(yīng)物種（Thale cress）的通路數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索和代謝通路分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶葉微生物固體發(fā)酵中咖啡堿、可可堿、茶堿含量的變化

在NRRL4789CBS137324和CBS253.31接種發(fā)酵中，在不計(jì)干物質(zhì)損耗的前提下，咖啡堿含量明顯有大幅度增加，增幅分別為23.32%、22.24%和16.46%，對(duì)咖啡堿降解代謝均無(wú)顯著影響（圖1）。僅在聚多曲霉（NRRL250接種發(fā)酵中，發(fā)現(xiàn)咖啡堿含量顯著下降（＜0.05），含量由原料中的(34.39±0.686)?mg·g-1降低至發(fā)酵末期的(5.54±0.548)?mg·g-1，降幅高達(dá)83.89%。因此，聚多曲霉應(yīng)該是可降解咖啡堿的有效菌株，可用于探究微生物作用下的咖啡堿降解代謝。

在接種發(fā)酵和滅菌處理中可可堿含量均有所增加（圖2），特別在NRRL4789CBS137324和CBS253.31接種發(fā)酵中，可可堿有大幅度增加，增幅分別為21.10%、20.24%、11.58%。在滅菌處理中，可可堿的增幅約6.09%。在聚多曲霉接種發(fā)酵中可可堿僅有小幅度增加，增幅僅為4.15%左右。

由圖3可見(jiàn)，在NRRL4789、CBS13732和CBS253.31接種發(fā)酵和滅菌處理中，茶堿含量均無(wú)顯著性增加（＞0.05）。在聚多曲霉接種發(fā)酵中，茶堿顯著增加（＜0.05），由最初的0.43?mg·g-1增加至(25.03±1.172)?mg·g-1，增幅為原料的57倍以上。結(jié)合圖1中咖啡堿含量變化可知：在聚多曲霉發(fā)酵中，茶堿主要來(lái)自于咖啡堿的降解。

2.2 差異代謝物篩選

為進(jìn)一步分析差異顯著的代謝物，將接種發(fā)酵組（IF）對(duì)原料組（RM）和滅菌組（ST）之間建立OPLS-DA模型并進(jìn)行兩兩相互比較，以找出樣品間差異代謝產(chǎn)物。由表1可知，接種發(fā)酵組（IF）對(duì)原料組（RM）包含2個(gè)成分，其擬合參數(shù)為2=0.865，2=1，2=0.997，表明該模型的穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)率較高；接種發(fā)酵組（IF）對(duì)滅菌組（ST）包含2個(gè)成分，其擬合參數(shù)為2=0.504，2=1，2=0.993，表明該模型的穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)率較高。對(duì)OPLS-DA模型進(jìn)行置換檢驗(yàn)，模型的排列檢驗(yàn)結(jié)果如圖4，由圖4可知，模型驗(yàn)證結(jié)果參數(shù)：接種發(fā)酵組（IF）對(duì)原料組（RM）2截距為0.92，2截距為–0.51，發(fā)酵組（IF）對(duì)滅菌組（ST）2截距為0.8，2截距為–0.69，也表明該模型可靠，不存在過(guò)擬合現(xiàn)象。因此，采用建立的OPLS-DA模型進(jìn)行后續(xù)的差異化合物篩選。

注：數(shù)值采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，**表示同一處理下差異的顯著性水平（P＜0.05）。下同

圖2 單菌種接種發(fā)酵與滅菌處理中可可堿含量變化

注：數(shù)值采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。**顯示差異的顯著性水平（P＜0.05）

圖4 IF-RM（a）和IF-ST（b）的差異代謝物OPLS-DA分析結(jié)果

2.3 聚多曲霉作用下的代謝通路富集分析

為探究微生物作用下咖啡堿降解代謝途徑，采用UHPLC-QTOF-MS方法對(duì)聚多曲霉接種發(fā)酵組（IF組），與原料組（RM組）和滅菌處理組（ST組）為對(duì)照進(jìn)行代謝組學(xué)分析。在正、負(fù)離子模式下，通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜分別定性匹配288種和146種代謝物。將代謝物在HDMB、PubChem和KEGG等數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行匹配。正、負(fù)離子模式下，接種發(fā)酵組（IF組）和原料組（RM組）分別有92種和73種差異代謝物（VIP＞1且＜0.05）；接種發(fā)酵組（IF組）和滅菌處理組（ST組）分別有92種和67種差異代謝物（VIP＞1且＜0.05）。

在正、負(fù)離子模式下，基于接種發(fā)酵組（IF組）對(duì)原料組（RM組）差異代謝物的代謝通路進(jìn)行富集分析（圖5）。接種發(fā)酵組（IF組）與原料組（RM組）在咖啡堿代謝（Caffeine metabolism）、嘌呤代謝（Purine metabolism）、苯丙烷代謝（Phenylalanine metabolism）、核黃素代謝（Riboflavin metabolism）、-亞麻酸代謝（-linolenic acid metabolism）、半乳糖代謝（Galactose metabolism）等方面存在顯著差異。

在正、負(fù)離子模式下，基于接種發(fā)酵組（IF組）對(duì)滅菌處理組（ST組）差異代謝物的代謝通路進(jìn)行富集分析（圖6）。接種發(fā)酵組（IF組）與滅菌處理組（ST組）在苯丙烷代謝（Phenylalanine metabolism）、半乳糖代謝（Galactose metabolism）、核黃素代謝（Riboflavin metabolism）、-亞麻酸代謝（-Linolenic acid metabolism）、色氨酸代謝（Tryptophan metabolism）等方面存在顯著差異。

圖5 在負(fù)離子模式（a）與正離子模式下（b），基于接種發(fā)酵組（IF組）對(duì)原料組（RM組）差異代謝物的代謝通路富集分析圖

圖6 在負(fù)離子模式（a）與正離子模式下（b），基于接種發(fā)酵組（IF組）對(duì)滅菌處理組（ST組）差異代謝物的代謝通路富集分析圖

綜合接種發(fā)酵組（IF組）與原料組（RM組）和滅菌處理組（ST組）在咖啡堿代謝（Caffeine metabolism）、嘌呤代謝（Purine metabolism）、苯丙烷代謝（Phenylalanine metabolism）、核黃素代謝（Riboflavin metabolism）、酪氨酸代謝（Tyrosine metabolism）、淀粉和蔗糖代謝（Starch and sucrose metabolism）等代謝通路富集上存在顯著差異。因此，聚多曲霉對(duì)氨基酸、碳水化合物、黃酮類(lèi)和咖啡堿代謝有顯著影響（＜0.05）。

2.4 聚多曲霉作用下咖啡堿降解代謝途徑分析

本文采用UHPLC-QTOF-MS方法在接種發(fā)酵樣、滅菌處理樣、曬青毛茶原料樣中共檢測(cè)出咖啡堿、茶堿、3-甲基黃嘌呤、1,7-二甲基黃嘌呤、7-甲基黃嘌呤、1-甲基黃嘌呤、次黃嘌呤等7種嘌呤堿（表2）。相比于原料組（RM組）和滅菌處理組（ST組），在接種發(fā)酵組（IF組）中咖啡堿發(fā)生顯著降低（＜0.05），而茶堿、3-甲基黃嘌呤、1,7-二甲基黃嘌呤、7-甲基黃嘌呤均顯著增加（＜0.05），1-甲基黃嘌呤在接種發(fā)酵過(guò)程中略有增加。

在聚多曲霉接種發(fā)酵中，咖啡堿的主要降解途徑如圖7所示。聚多曲霉作用下，咖啡堿降解代謝存在N-脫甲基化途徑和氧化途徑。通過(guò)N-脫甲基化反應(yīng)，咖啡堿降解為茶堿、3-甲基黃嘌呤、1,7-二甲基黃嘌呤、7-甲基黃嘌呤、1-甲基黃嘌呤。其中部分降解產(chǎn)物，氧化后產(chǎn)生的1,7-二甲基尿酸和1-甲基尿酸均有小幅度增加。次黃嘌呤的顯著增加，可能和咖啡堿降解代謝相關(guān)。在聚多曲霉作用下，產(chǎn)生相關(guān)N-脫甲基酶，分別去除咖啡堿7號(hào)位甲基和3號(hào)位甲基生成茶堿和1,7-二甲基黃嘌呤，并且茶堿為主要咖啡堿降解產(chǎn)物，1,7-二甲基黃嘌呤為次要降解產(chǎn)物。

3 討論

本文以滅菌處理為對(duì)照，采用NRRL250（聚多曲霉）、NRRL4789、CBS137324和CBS253.31等4株優(yōu)勢(shì)菌株分別接種至?xí)袂嗝柽M(jìn)行茶葉固態(tài)發(fā)酵，并采用HPLC測(cè)定咖啡堿、可可堿和茶堿等嘌呤堿含量。結(jié)果表明，NRRL4789、CBS137324和CBS253.31對(duì)咖啡堿、可可堿、茶堿等嘌呤堿代謝無(wú)顯著影響，這與普洱茶自然渥堆[25]和茶葉單菌種發(fā)酵[3]的研究結(jié)果基本一致。此外，本文僅在聚多曲霉接種發(fā)酵中發(fā)現(xiàn)咖啡堿含量顯著下降（＜0.05），茶堿含量顯著增加（＜0.05），這與前人研究結(jié)果一致[22]。另外，有研究報(bào)道茶堿是咖啡堿主要的代謝產(chǎn)物和限速步驟[26-27]。綜上所述，在普洱茶發(fā)酵中咖啡堿降解的優(yōu)勢(shì)菌株為聚多曲霉，并具有將咖啡堿轉(zhuǎn)化為茶堿的潛在能力。

表2 不同處理組中咖啡堿代謝相關(guān)代謝物的相對(duì)含量和倍數(shù)變化

注：代謝物的相對(duì)含量為3個(gè)重復(fù)通過(guò)LC-MS/MS獲得數(shù)據(jù)的平均值，相對(duì)含量是內(nèi)標(biāo)歸一化后的值，其內(nèi)標(biāo)為核糖醇（≥99%）。RM為原料組，ST為滅菌處理組，IF為接種發(fā)酵組。倍數(shù)變化通過(guò)公式log2（處理/對(duì)照）進(jìn)行計(jì)算。**表示同列差異顯著性水平（＜0.05）

Note: Relative content of each metabolite is an average of data from three replicates obtained through LC-MS/MS. The relative content is the normalized value of the internal standard, and the internal standard is ribose alcohol (≥99%). RM stands for Raw material, ST stands for Sterilization treatment, IF stands for Inoculated fermentation. Fold changes were calculated using the formula log2(treatment/control). ** indicates significance of the same column (＜0.05)

注：藍(lán)色箭頭（→）表示在SSF中檢測(cè)到的N-脫甲基化通路。紅色箭頭（→）表示在SSF中檢測(cè)到的氧化通路。棕色箭頭（→）表示在SSF中未檢測(cè)到的可能通路

運(yùn)用UHPLC-QTOF-MS的代謝組學(xué)分析探究聚多曲霉作用下第9天發(fā)酵樣中咖啡堿降解代謝相關(guān)的物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)茶堿、3-甲基黃嘌呤、1,7-二甲基黃嘌呤、7-甲基黃嘌呤、1-甲基黃嘌呤、1-甲基尿酸、次黃嘌呤均顯著增加（＜0.05）。其中，茶堿含量與HPLC檢測(cè)結(jié)果一致。由此可見(jiàn)，茶堿作為N-脫甲基作用下咖啡堿降解的主要產(chǎn)物，進(jìn)一步降解為3-甲基黃嘌呤或1-甲基黃嘌呤。而1,7-二甲基黃嘌呤作為-脫甲基作用下咖啡堿降解的次要產(chǎn)物，可通過(guò)-脫甲基作用進(jìn)一步降解為7-甲基黃嘌呤或1-甲基黃嘌呤。

前人研究發(fā)現(xiàn)，茶樹(shù)生理中咖啡堿的分解代謝途徑以咖啡堿→茶堿→3-甲基黃嘌呤→黃嘌呤→尿酸→尿囊素→尿囊酸→乙醛酸→尿素→NH3+CO2為主[28-29]。在本研究中，在聚多曲霉作用下咖啡堿降解代謝中存在著-脫甲基作用和氧化作用，并以-脫甲基化作用為主，且以咖啡堿→茶堿→3-甲基黃嘌呤降解為主途徑，這與Mccarthy等[30]的研究結(jié)果一致。另外，在極少數(shù)的青霉屬和曲霉屬類(lèi)群中，真菌分解代謝咖啡堿會(huì)逐級(jí)代謝為茶堿和3-甲基黃嘌呤[31]，并且以咖啡堿→1,7-二甲基黃嘌呤→7-甲基黃嘌呤降解途徑為輔。1-甲基黃嘌呤的增加可能源于茶堿或1,7-二甲基黃嘌呤的進(jìn)一步降解[32]。同時(shí)，通過(guò)氧化作用，少量1,7-二甲基黃嘌呤和1-甲基黃嘌呤可氧化成甲基尿酸，這與細(xì)菌參與下的嘌呤堿代謝途徑一致。1,7-二甲基尿酸亦可脫甲基形成1-甲基尿酸，與Cornish等[32]在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)咖啡堿通過(guò)脫甲基后轉(zhuǎn)化為1,7-二甲基黃嘌呤，進(jìn)一步脫甲基后轉(zhuǎn)化為1-甲基黃嘌呤，再氧化為1-甲基尿酸的代謝途徑一致。-脫甲基作用是由相關(guān)的-脫甲基酶催化咖啡堿3個(gè)位點(diǎn)的甲基完成，最終生成黃嘌呤。目前關(guān)于茶葉中-脫甲基酶的研究報(bào)道較少。運(yùn)用-脫甲基酶相關(guān)基因的超表達(dá)促使咖啡堿的降解，定向生產(chǎn)相應(yīng)嘌呤堿存在不少難題。研究-脫甲基酶相關(guān)基因簇將促進(jìn)生物降解嘌呤堿技術(shù)的研發(fā)，對(duì)解決相關(guān)領(lǐng)域應(yīng)用咖啡堿產(chǎn)生的問(wèn)題具有現(xiàn)實(shí)意義。

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A Preliminary Study on the Degradation Pathway of Caffeine in Tea Microbial Solid-state Fermentation

ZHENG Chengqin1, MA Cunqiang1,2, ZHANG Zhengyan1, LI Xiaohong1, WU Tingting1,ZHOU Binxing1*

1. Longrun Pu-erh Tea College, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 2. Kunming Dapu Tea Industry Company Limited, Kunming 650224, China

In order to explore caffeine degradation products and pathways under the action of microorganisms, the dominant strains includingNRRL250,NRRL4789,CBS137324 andCBS253.31 were screened and identified during pu-erh tea fermentation.Strains were inoculated into sun-dried green tea leaves for solid-state fermentation. High performance liquid chromatography (HPLC) was used to determine caffeine, theobromine and theophylline contents to explore the effect of microorganisms on caffeine metabolism. UHPLC-QTOF-MS was used for the metabonomic analysis ofinoculated fermentation with sterilization treatment group (ST group) and raw material group (RM group). The results show that the dominant strains such asNRRL4789,CBS137324 andCBS253.31 had no significant effects on the metabolism of caffeine and other purine alkaloids. However, caffeine content was decreased significantly (＜0.05) with a great reduction about 83.89% during the inoculated fermentation of. Additionally, theophylline content was increased significantly (＜0.05) and arrived to (25.03±1.17)?mg·g-1at the end of fermentation.While theobromine content remained stable. Therefore,has a profound effect on caffeine degradation metabolism. Nine metabolites related to caffeine degradation were detected by UHPLC-QTOF-MS during the inoculated fermentation, Among them, theophylline, 3-methylxanthine, 1,7-dimethylxanthine and 7-methylxanthine contents were significantly increased (＜0.05) under the action ofwhich were related to N-demethylation pathway of caffeine and its related metabolites. 1,7-dimethyluric acid and 1-methyluric acid were related to the oxidation pathway of caffeine-related metabolites. It can be seen thatis the dominant strain that can degrade caffeine and has the potential ability to convert caffeine into theophylline. Under the action of, both N-demethylation and oxidation were found in caffeine degradation metabolism, and the former was the dominant.

Pu-erh tea, solid-state fermentation,, caffeine, degradation pathway

SI詞頭符號(hào)表

因數(shù)詞頭中文名稱(chēng)詞頭符號(hào)因數(shù)詞頭中文名稱(chēng)詞頭符號(hào) 1024堯Y10-1分d 1021澤Z10-2厘c 1018艾E10-3毫m 1015拍P10-6微μ 1012太T10-9納n 109吉G10-12皮p 106兆M10-15飛f 103千K10-18阿a 102百H10-21仄z 101十da10-24幺y

S571.1；Q52

A

1000-369X(2020)03-386-11

2019-11-26

2019-12-23

云南農(nóng)業(yè)云南省現(xiàn)代茶葉產(chǎn)業(yè)體系（2017KJTX007）、國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31960617）、國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31760225）、國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31560221）

鄭城欽，男，碩士，主要從事制茶工程與質(zhì)量控制方面的研究。*通信作者：bxzhou01@126.com

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