糧食真菌毒素的光譜檢測技術(shù)研究進展

郭志明，尹麗梅，石吉勇，陳全勝，鄒小波

江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013

引 言

糧食安全是重大的民生問題，關(guān)系人民群眾身體健康和生命安全。糧食安全問題中，真菌毒素污染最為嚴重，據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計，全球平均25%的糧食受到真菌毒素的污染。中國工程院食品安全重大咨詢研究結(jié)果顯示[1]：我國每年有3 100多萬公噸糧食在生產(chǎn)、儲存、運輸過程中被真菌毒素污染，約占糧食年總產(chǎn)量的6.2%。真菌毒素是真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，主要包括黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、赭曲霉毒素、伏馬毒素等。真菌毒素具有強毒性和致癌性，能夠污染所有種類的食用和飼用農(nóng)產(chǎn)品，已成為世界各國高度關(guān)注的食品安全熱點問題。

傳統(tǒng)檢測方法主要有高效液相色譜、薄層色譜、液相色譜-質(zhì)譜法以及酶聯(lián)免疫吸附等測定方法[2-4]，所需設備復雜、步驟繁瑣、檢測周期長，很難實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測，不適于大量糧食樣本的快速篩查測定，無法滿足食品流通及加工過程中快速實時檢測的要求，亟需綠色、高通量、快速無損檢測方法。近年來食品安全光譜檢測技術(shù)成效顯著，以其特有的客觀、重現(xiàn)性好、一般不需要預處理且易實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測等優(yōu)勢[5]，已成為食品、農(nóng)產(chǎn)品檢測領(lǐng)域的研究熱點，并朝著高靈敏、高通量、多功能等方向發(fā)展，逐漸成為食品、農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)安全檢測不可或缺的重要技術(shù)手段，與大型精密的理化分析儀器的檢測形成互補[6]。光譜分析技術(shù)特別是近紅外光譜、拉曼光譜和熒光光譜等分子光譜在糧食真菌毒素檢測相關(guān)領(lǐng)域展現(xiàn)了巨大的潛力和優(yōu)勢。

目前已有多個國家和優(yōu)勢研究單位從事糧食真菌毒素的光譜分析技術(shù)研究，包括中國、美國、德國、英國、日本、俄羅斯、西班牙等，國內(nèi)中國農(nóng)業(yè)大學、國家糧科院、江蘇大學、浙江大學、江南大學、南京財經(jīng)大學等研究小組開展了相關(guān)研究。本文主要綜述了近紅外光譜、拉曼光譜、熒光光譜和光譜成像技術(shù)的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀，對各技術(shù)的優(yōu)缺點進行分析，并展望光譜分析技術(shù)的發(fā)展趨勢，為糧食真菌毒素的光譜檢測提供借鑒和參考。

1 光譜分析技術(shù)原理

近紅外光譜是分子振動光譜的合頻和各級倍頻的吸收光譜，是非諧振性分子振動從基態(tài)向高能級躍遷產(chǎn)生的，主要產(chǎn)生于有機分子中含氫基團(C—H，O—H，N—H等)的振動[7]。當近紅外光照射樣本時，頻率相同的光與樣本中基團發(fā)生共振，光能通過分子偶極矩的變化傳遞給分子，樣品中不同基團對近紅外光的選擇性吸收，可反映樣品有機化合物的組成和分子結(jié)構(gòu)的特征信息。

拉曼光譜是激發(fā)光與樣品中分子運動相互作用發(fā)生散射效應且引起頻率變化的振動光譜，拉曼光譜由印度科學家C.V.拉曼(Raman)于1928年實驗所發(fā)現(xiàn)，這一現(xiàn)象也被稱為拉曼散射效應。拉曼散射光的頻率和瑞利散射光頻率之差不隨入射光頻率的變化而變化，與樣品分子的振動和轉(zhuǎn)動能級有關(guān)。此頻率差稱為拉曼頻移，是特征性的，與入射光波長無關(guān)。對與激發(fā)光頻率不同的散射光譜進行分析可得到分子振動、轉(zhuǎn)動能級特性等信息，適應于分子結(jié)構(gòu)表征、成鍵效果、內(nèi)部應力分布等分析。

圖1 糧食真菌毒素的不同光譜分析技術(shù)示意圖Fig.1 Schematic diagram of different spectral analysis techniques of grain mycotoxin

熒光光譜是固定激發(fā)波長時，物質(zhì)發(fā)射的熒光強度隨發(fā)射光波長變化的關(guān)系曲線，熒光本身是由電子在兩能級間不發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)的輻射躍遷過程中所產(chǎn)生的光[8]。激發(fā)時電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長一定的熒光，因此，發(fā)射譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)。通過熒光光譜可以獲得被測物質(zhì)的量子產(chǎn)率、熒光強度、熒光壽命、斯托克斯位移、熒光偏振與去偏振特性和熒光的淬滅信息。

光譜成像技術(shù)能同時獲得糧食的光譜和圖像信息，光譜技術(shù)能檢測待測對象的組織結(jié)構(gòu)和化學成分，圖像技術(shù)能反映待測對象的外在特征和空間信息，集合了光譜技術(shù)與圖像分析技術(shù)于一身[8]，因此既能對待測對象的外觀特性進行檢測又能對其內(nèi)部成分進行檢測，在糧食真菌毒素空間分布的可視化檢測方面將發(fā)揮重要作用。

近紅外光譜、拉曼光譜和熒光光譜均能反映物質(zhì)分子振動的能級結(jié)構(gòu)信息，但獲取的分子信息不同。近紅外光譜探測的是電偶極矩變化引起的振動，拉曼光譜探測的是分子極化引起的振動，而熒光光譜反映具有長共軛結(jié)構(gòu)的分子信息，應用不同光譜分析技術(shù)檢測糧食真菌毒素的過程如圖1所示，從原理上分析糧食真菌毒素快速、高精度光譜檢測是可行的。

2 光譜分析技術(shù)研究進展及動態(tài)分析

2.1 真菌毒素的近紅外光譜檢測研究現(xiàn)狀及發(fā)展動態(tài)分析

近紅外光譜是分子振動光譜倍頻和合頻吸收譜，具有豐富的結(jié)構(gòu)和組成信息，在糧食真菌毒素檢測方面國內(nèi)外學者開展了實驗研究。美國農(nóng)業(yè)部USDA-ARS的Dowell等[10]率先開展了近紅外光譜檢測糧食中真菌毒素檢測的實驗室研究，建立了小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的預測模型。Pearson等[11]建立了玉米黃曲霉毒素含量高中低三個類別的識別模型。美國農(nóng)業(yè)部拉塞爾農(nóng)業(yè)研究中心Sohn等[12]比較了近紅外光譜和拉曼評價大米的蛋白質(zhì)和直鏈淀粉的效果。西班牙食品開發(fā)研究所Fernandez-Ibanz等[13]利用兩種近紅外光譜儀分別建立玉米和小麥中黃曲霉毒素的預測模型。美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)應用研究中心Tallada等[14]利用近紅外光譜和彩色圖像分別識別玉米中真菌毒素。意大利烏迪內(nèi)大學Della RicciaGiacomo等[15]建立了玉米伏馬毒素的近紅外光譜定量預測模型。德國霍恩海姆大學Miedaner等[16]利用近紅外光譜結(jié)合癥狀分級預測禾谷鐮刀菌污染的玉米中嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮。美國農(nóng)業(yè)部谷物與動物健康研究所Peiris等[17]利用近紅外光譜快速評價有赤霉病癥狀的單粒小麥中嘔吐毒素的等級。英國諾丁漢大學Caporaso等[18]綜述了近紅外光譜和高光譜成像在谷物評價中的應用，指出近紅外光譜在糧食的真菌污染檢測方面極具應用潛力。美國密西西比州立大學Tao等[19]利用近紅外識別玉米黃曲霉菌污染的準確率為97.78%，黃曲霉毒素定量模型的線性測定范圍為20～100 ppb。意大利國家食品安全委員會Girolamo等[20]利用近紅外光譜和中紅外光譜快速篩查小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和赭曲霉毒素A，識別率分別在86%和94%。

國內(nèi)糧食真菌毒素檢測方面開展較晚，隨著我國糧食安全重視程度的提高，糧食真菌毒素的光譜檢測也逐漸成為研究熱點。中國農(nóng)業(yè)大學Wang等[20-21]利用近紅外高光譜圖像定性判別黃曲霉污染的四種不同程度的玉米籽粒，提取近紅外高光譜圖像的光譜角建立了玉米黃曲霉毒素識別模型，還利用近紅外光譜特征波長結(jié)合支持向量機建立了玉米顆粒霉變程度的判別模型。江蘇大學黃星奕等[23]利用FT-NIR結(jié)合KNN識別方法建立了霉變和出芽花生的識別模型。東北農(nóng)業(yè)大學張強等[24]利用近紅外光譜結(jié)合支持向量機建立了貯藏稻谷中黃曲霉毒素B1的檢測模型。南京財經(jīng)大學劉鵬等建立了近紅外光譜技術(shù)的花生產(chǎn)毒霉菌污染程度的判別模型，Shen[25]分別利用近紅外光譜和中外光譜建立了糙米黃曲霉毒素的分類模型和定量預測模型。

糧食真菌毒素的近紅外光譜檢測已在實驗室開展了一些研究，對真菌污染比較嚴重的糧食，近紅外光譜可以較好的識別，但低含量真菌毒素檢測方面精度不高(如Pearson，Wang等的研究)；糧食的真菌污染具有隨機性，即使同粒玉米或小麥毒素分布是不均勻的，在尺度上，前期研究一般只是對整粒進行研究，對粉碎樣從顯微尺度上研究可以提高預測的穩(wěn)定性；真菌毒素分子量小、含量低，合頻和倍頻的分子振動信號弱，真菌毒素的近紅外光譜響應與解析方法需要進一步探索，明確毒素近紅外的譜帶歸屬，以提高檢測模型的適應性和穩(wěn)定性。

2.2 真菌毒素的拉曼光譜檢測研究現(xiàn)狀及發(fā)展動態(tài)分析

拉曼效應是光子與光學及聲子相互作用的結(jié)果，拉曼散射光譜可以獲取分子振動能級與轉(zhuǎn)動能級躍遷的特征信息，具有強大的分子識別能力，同時具有非標記、非接觸的特點，是分子信息快速獲取的理想手段。拉曼光譜在糧食真菌毒素檢測方面從2009年開始了實驗室階段研究，美國馬里蘭大學的Liu等[26]利用傅里葉拉曼光譜在小麥和大麥粉未做萃取處理的情況下結(jié)合簡單的比值算法實現(xiàn)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量高低的識別。美國佐治亞大學Wu等[27]通過銀納米棒陣列基底增強拉曼光譜識別四種不同類型的黃曲霉毒素。美國馬薩諸塞大學Zheng等[28]指出表面增強拉曼光譜在食品化學污染物高靈敏檢測方面有巨大潛力。德州農(nóng)工大學的Lee等[29-31]建立了表面增強拉曼光譜的玉米黃曲霉毒素分類模型，并分別利用拉曼、紅外和近紅外三種分子光譜檢測玉米中的黃曲霉毒素，另外建立了玉米中伏馬毒素的定性和定量分析模型。國家糧科院Li等[31]利用表面增強拉曼光譜檢測花生奶中的黃曲霉毒素。上海師范大學Yuan等[32]建立了表面增強拉曼光譜檢測谷物中嘔吐毒素的方法。江蘇大學Chen等[33]構(gòu)建表面增強拉曼散射適配體探針檢測花生油中黃曲霉毒素B1。法國巴黎第十三大學Gillibert等[35]制備了高靈敏度、選擇性檢測赭曲霉毒素A的表面增強拉曼傳感器。德國弗里德里希·席勒大學Zukovskaja等[36]利用紫外-拉曼光譜快速識別真菌孢子。江南大學Shao等[37]建立了基于磁性納米顆粒的赭曲霉毒素A的檢測表面增強拉曼光譜結(jié)合用于赭曲霉毒素A的檢測。江蘇大學Guo等[38]利用宏量取樣獲取拉曼光譜實現(xiàn)玉米中的玉米赤霉烯酮的快速定量篩查，預測模型相關(guān)系數(shù)為0.926。

拉曼光譜信號指紋性和特異性的技術(shù)特點，在糧食真菌毒素檢測方面有巨大潛力，受到越來越多的關(guān)注，但研究多是基于金、銀等納米材料或磁性材料進行拉曼增強，而這種復雜的穩(wěn)態(tài)檢測體系與常規(guī)濕化學分析一樣需要進行耗時的樣本預處理；另外，拉曼增強材料或增強基底制備的重現(xiàn)性和檢測的穩(wěn)定性有待提高；與特異性抗體相結(jié)合的免疫檢測方法存在抗體分子較大、合成復雜、昂貴等缺陷；在拉曼光譜數(shù)據(jù)分析方面，大多基于單個的拉曼峰來定量分析，沒有充分利用獲取的待測物質(zhì)的分子信息。

2.3 真菌毒素的熒光檢測研究現(xiàn)狀及發(fā)展動態(tài)分析

熒光光譜因其特異性和靈敏性在食品安全檢測領(lǐng)域展現(xiàn)了巨大的發(fā)展?jié)摿?，雖起步較晚，但已成為國內(nèi)外食品安全檢測領(lǐng)域的研究新熱點。德國波茨坦大學Rasch等[39-40]比較了時間分辨熒光光譜、近紅外光譜和雙光子激發(fā)熒光光譜分析技術(shù)，分別建立了啤酒和葡萄酒中真菌毒素的定性和定量檢測模型。歐洲生物化學研究所Pennacchio等[41]建立了一種基于熒光偏振的近紅外熒光探針技術(shù)，不需要對樣本進行預處理就可以檢測蘋果汁中的棒曲霉素。德國哥廷根大學的Karlovsky等[42]指出物理技術(shù)特別是熒光光譜技術(shù)在未來食品安全檢測方面具有巨大潛力。江蘇大學Chen等[43]通過合成上轉(zhuǎn)換納米粒子制備超靈敏熒光探針的檢測黃曲霉毒素B1和嘔吐毒素。中國農(nóng)業(yè)科學院動物科學研究所Chen等[43]構(gòu)建了熒光適配體探針用于特異性檢測嬰幼兒米粉中的黃曲霉毒素B1。江蘇師范大學Tian等[45]利用納米線與石墨烯量子點間熒光共振能量轉(zhuǎn)移適配體測定赭曲霉毒素A。日本國家農(nóng)業(yè)與食品研究會Aiyama等[46]建立了肉豆蔻中黃曲霉毒素污染水平的熒光指紋圖譜檢測方法。俄羅斯國家生物技術(shù)研究中心Samokhvalov等[47]通過激發(fā)發(fā)射矩陣熒光光譜測定熒光適配體交互作用的赭曲霉毒素A。

有關(guān)熒光光譜技術(shù)的糧食真菌毒素檢測研究較少，已有研究通過構(gòu)造特異性熒光探針或熒光指紋圖譜實現(xiàn)真菌毒素的高靈敏檢測，表明熒光光譜在真菌毒素檢測方面具有很好的應用前景。熒光光譜技術(shù)具有有效表征真菌毒素的長共軛結(jié)構(gòu)信息的這一技術(shù)優(yōu)勢，經(jīng)過進一步研究探索必將成為一種強有力的檢測工具。

2.4 真菌毒素的光譜圖像融合檢測研究現(xiàn)狀及發(fā)展動態(tài)分析

光電信息的融合包括不同傳感器間的信息融合和同一傳感器不同維度的融合，其中光譜圖像技術(shù)是光譜分析和機器視覺的高精度融合技術(shù)，具有圖譜合一的技術(shù)優(yōu)勢，可實現(xiàn)糧食真菌毒素分布的可視化分析；另外，分子光譜集成獲取糧食的內(nèi)部信息，通過信息融合互補可提高真菌毒素檢測的精度。美國愛荷華州大學Jin等[48]利用可見-近紅外高光譜成像和紫外激發(fā)熒光高光譜成像鑒別黃曲霉菌產(chǎn)毒和不產(chǎn)毒菌株，混合識別率僅為75%，成對識別率達95%。之后很多研究單位或課題小組開展了近紅外光譜成像和熒光光譜成像的糧食真菌污染及毒素檢測，部分總結(jié)見表1。中國農(nóng)業(yè)大學Chu等[62]利用近紅外光譜成像檢測玉米單粒的黃曲霉毒素污染水平，識別率為82.5%。美國密西西比州立大學Hruska等[63]分析了接種產(chǎn)毒曲霉和脫毒曲霉的玉米籽粒橫斷面內(nèi)熒光發(fā)射時間的影響，產(chǎn)毒與不產(chǎn)毒斷面的熒光信號及分布有顯著差異。中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所Xing等[64]利用熒光高光譜圖像鑒別花生黃曲霉菌株不產(chǎn)毒和產(chǎn)毒菌株類型，識別率分別為100%和80%。南京農(nóng)業(yè)大學Liang等[65]利用高光譜成像法測定不同水平的脫氧雪烯醇的散裝小麥籽粒，識別率為97.2%。美國農(nóng)業(yè)部食品安全實驗室Delwiche等[66]利用近紅外光譜成像篩選四個特征波長(1 100,1 197,1 308和1 394 nm)評價硬質(zhì)小麥籽粒被鐮刀菌污染的程度。真菌污染及真菌毒素分布的不均勻性影響了檢測的可靠性，光譜成像技術(shù)可解決這個問題。但對樣本的整體性有效評價還存在許多挑戰(zhàn)，檢測準確性和速度需要進一步提高，光譜成像檢測儀器價格較高，成本也限制了該技術(shù)實際和大規(guī)模的應用。

表1 糧食真菌毒素的光譜成像檢測研究匯總表Table 1 Summary of spectralimaging techniques that have been used for the detection of mycotoxin grains

3 展 望

光譜分析技術(shù)在糧食真菌毒素檢測領(lǐng)域已展現(xiàn)了巨大的應用潛力，但仍處于試驗探索階段。已有研究分別利用近紅外光譜、拉曼光譜、熒光光譜及與其他技術(shù)相結(jié)合實現(xiàn)了糧食中真菌毒素的快速篩查、定性判別或高靈敏檢測，為糧食及其制品在流通、貯藏及加工過程質(zhì)量與安全控制提供了新的途徑。通過進一步研究可提供一種全新的方法，在糧食的原料篩選、過程控制和安全保障方面具有廣闊的應用前景，但光譜分析技術(shù)仍然面臨著一些亟待解決的問題，如檢測的認可度、檢測精度和穩(wěn)定性。

糧食真菌污染的隨機性和毒素分布的不均勻性，在傳統(tǒng)檢測尺度下很難得到穩(wěn)定的光譜預測模型，如近紅外光譜在低含量真菌毒素檢測時精度不高，拉曼光譜在傳統(tǒng)尺度下無法獲取有效的拉曼信號。如果能將顯微成像技術(shù)與光譜技術(shù)有機結(jié)合，可將光譜分析技術(shù)的研究內(nèi)容拓展深入到微觀領(lǐng)域，為精細化科學研究提供一種新的手段。前期研究比較不同模態(tài)下光譜預測糧食真菌毒素的效果，但在光譜信息采集時，不同模態(tài)光譜獲取樣本信息的位置不同，因毒素分布的不均勻性，這種研究無法獲得令人信服的比較結(jié)果。江蘇大學自主開發(fā)了顯微多模態(tài)融合光譜檢測系統(tǒng)，已獲得發(fā)明專利授權(quán)(ZL201710082623.1)，通過共享光學主軸線創(chuàng)新設計，實現(xiàn)三種模態(tài)光譜的同位獲取，為真菌毒素的光譜分析打開一個全新的研究空間。

糧食樣品中毒素濃度和分布不均勻、背景成分的干擾、光譜采集定位精度及環(huán)境因素的變化均會影響檢測的精度。通過多光譜信息融合技術(shù)可獲得的信息更全面、檢測結(jié)果更客觀精確。對多種光譜系統(tǒng)來說，信息具有多樣性和復雜性，信息融合方法要求具有魯棒性和并行處理能力，其中協(xié)調(diào)優(yōu)化和綜合處理是信息融合的核心。將不同模態(tài)的光譜信息進行融合，開發(fā)新的信息處理算法，可為糧食真菌毒素高精度檢測提供新途徑。