XM-4菌株的鑒定及其農(nóng)用功能分析

李慶芬，仰潔玉，余梅霞，朱 玉，余俊杰

（阜陽(yáng)師范大學(xué) 生物與食品科學(xué)學(xué)院，安徽 阜陽(yáng) 236037）

關(guān)鍵字：枯草芽孢桿菌；鑒定；抑菌效應(yīng)；抗氧化；解纖維素

土壤為農(nóng)作物的生存和生長(zhǎng)提供物質(zhì)基礎(chǔ)，而農(nóng)業(yè)生產(chǎn)穩(wěn)定發(fā)展的前提是土壤的可持續(xù)性利用[1-2]。近年來(lái)，由于化肥的大量施用導(dǎo)致了土壤的品質(zhì)下降、水體污染及農(nóng)作物品質(zhì)降低等一系列問(wèn)題[3-4]。生物菌肥中多種微生物的自身代謝活動(dòng)能增加土壤肥力和通透性，降解土壤中殘留的農(nóng)藥，改善環(huán)境，有益于實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[5]。

芽孢桿菌是一類(lèi)能產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。主要分布于植物的根部和葉圍[6]。自身代謝活動(dòng)不僅能產(chǎn)生多種抑制病原微生物生長(zhǎng)的抗菌物質(zhì)還能增強(qiáng)植物自身的抗病性，進(jìn)而提高植物的生防能力[7-10]。所以在菌肥研制、秸稈處理、飼料開(kāi)發(fā)、環(huán)境凈化等方面有很高的應(yīng)用價(jià)值[11]。

本實(shí)驗(yàn)探究了XM-4菌株及其代謝產(chǎn)物對(duì)的抑制活性抗氧化活性和解纖維素能力，為生物菌肥的研制和植物病害的生物治理奠定了基礎(chǔ)，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和16S rDNA序列分析鑒定了XM-4菌株為枯草芽孢桿菌。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 供試菌株

XM-4菌株、小麥赤霉病菌、茶葉炭疽病菌、玉米彎孢病菌、串珠鐮刀病菌、黃瓜枯萎病菌、瓜炭疽病菌均保存于實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

1.2.1 主要試劑

十六烷基三甲基溴化銨、十二烷基硫酸鈉、蛋白酶K、瓊脂糖、PCR反應(yīng)試劑盒、膠回收試劑盒，剛果紅溶液（1 mg/mL），氯化鈉溶液（1 mol/L），緩沖溶液，DNS試劑，羧甲基纖維素鈉底物溶液等。

1.2.2 培養(yǎng)基

所用培養(yǎng)基有Luria-Bertani培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基、CMC-Na培養(yǎng)基、羧甲基纖維素酶活性檢測(cè)培養(yǎng)基、濾紙酶活性檢測(cè)培養(yǎng)基、解磷培養(yǎng)基、解鉀菌分離培養(yǎng)基、固氮培養(yǎng)基[12-15]。

1.3 XM-4菌株的鑒定

1.3.1 菌株常規(guī)鑒定

觀察該菌的形態(tài)并進(jìn)行革蘭氏染色觀察和掃描電鏡實(shí)驗(yàn)[16]。

1.3.2 16S rRNA基因序列的測(cè)定與分析

采用DNA抽提法（酚-氯仿法）提取XM-4菌株基因組[17]，以XM-4菌株DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增[18]。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。用膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物后送北京睿博興科生物公司進(jìn)行序列測(cè)定并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析[19]。

1.4 XM-4菌株的抑菌譜檢測(cè)

1.4.1 XM-4菌株的抑菌活性檢測(cè)

平板對(duì)峙培養(yǎng)法：先將6種病原菌分別接種到PDA平板上，再在距病原菌2 cm處接種XM-4菌株，對(duì)照組只在PDA平板上接種6種病原菌，設(shè)置溫度為28℃，恒溫培養(yǎng)3 d。然后測(cè)量實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組6種病原菌的菌落直徑，計(jì)算XM-4菌株的抑菌率R：

1.4.2 XM-4菌株無(wú)菌發(fā)酵液的抑菌活性檢測(cè)

選取玉米彎孢病菌、小麥赤霉病菌、串珠鐮刀病菌作為指示菌株。采用搖瓶發(fā)酵法獲得無(wú)菌發(fā)酵產(chǎn)物。

抑菌實(shí)驗(yàn)：取200 mL的PDA培養(yǎng)基融化，待其冷卻至50℃左右時(shí)，加入20 mL的無(wú)菌發(fā)酵液，充分混勻后，制成含藥平板。將上述3種指示菌接種到含藥平板上，對(duì)照組則將3種指示菌接種到加有20 mL的液體LB培養(yǎng)基的PDA平板上，置于28℃真菌培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3 d。然后測(cè)量實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中3種指示菌的菌落直徑，并計(jì)算XM-4菌株的抑菌率。

1.5 發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性檢測(cè)

取無(wú)菌發(fā)酵產(chǎn)物1 mL，加入0.1 mmol/L的DPPH溶液2 mL、無(wú)水乙醇2 mL混勻，以無(wú)水乙醇調(diào)零，在517 nm處測(cè)其吸光值A(chǔ)i，即加入抗氧化劑后DPPH的吸光度。陽(yáng)性對(duì)照用1 mL抗壞血酸加入0.1 mmol/L的DPPH溶液2 mL、無(wú)水乙醇2 mL混勻，以無(wú)水乙醇調(diào)零，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光值A(chǔ)f。陰性對(duì)照用1 mL無(wú)菌發(fā)酵液加入2 mL無(wú)水乙醇混勻，以無(wú)水乙醇調(diào)零，在517 nm處測(cè)其吸光值A(chǔ)j，即無(wú)菌代謝產(chǎn)物的吸光度?？瞻捉M采用蒸餾水1 mL，加入0.1 mmol/L的DPPH溶液2 mL、無(wú)水乙醇2 mL混勻，以無(wú)水乙醇調(diào)零，在517 nm處測(cè)其吸光值A(chǔ)o。連續(xù)4天檢測(cè)菌株XM-4的無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)DPPH的清除率

1.6 解纖維素能力測(cè)定

以葡萄糖在540 nm處的吸光值為橫坐標(biāo)、葡萄糖量（mg/mL）為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到回歸方程：

將XM-4菌株接種到羧甲基纖維素酶活性檢測(cè)培養(yǎng)基和濾紙酶活性檢測(cè)培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接種24瓶，將接好菌的培養(yǎng)基置于恒溫?fù)u床中，設(shè)置溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為160 r/min，培養(yǎng)1～6 d，取發(fā)酵上清液分別檢測(cè)XM-4菌株的羧甲基纖維素酶活及濾紙酶活[12-13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 XM-4菌株的鑒定

2.1.1 菌落形態(tài)觀察

過(guò)夜培養(yǎng)成熟后XM-4菌株的菌落直徑約3 mm，菌落呈光滑圓球或橢圓狀，顏色為白色，菌落表面濕潤(rùn)、黏稠，半透明，不易挑取如圖1（a）。經(jīng)革蘭氏染色后，菌體呈現(xiàn)藍(lán)紫色桿狀如圖1（b），表明XM-4菌株為革蘭陽(yáng)性菌。后經(jīng)掃描電鏡觀察，證實(shí)XM-4菌株為桿狀細(xì)菌如圖1（c）。

圖1 XM-4菌株的菌落形態(tài)、革蘭氏染色和掃描電鏡圖。（a）XM-4 菌株的單菌落；（b）XM-4 菌株的革蘭氏染色圖；（c）XM-4菌株掃描電鏡圖

2.1.2 分子鑒定

以菌株XM-4基因組為模板，對(duì)16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增如圖2。

圖2 PCR產(chǎn)物電泳圖。泳道1：100～2 000 bp的DNAmarker；泳道 2：PCR 產(chǎn)物

測(cè)得的XM-4菌株的16S rDNA的部分序列用BLASTN軟件進(jìn)行同源性比對(duì)，采用Clustal2.0軟件進(jìn)行分析，并使用Mega6.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建如圖3。綜合所得結(jié)果，XM-4菌株鑒定為枯草芽孢桿菌。

圖3 基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.2 XM-4菌株的抗菌譜檢測(cè)

XM-4菌株對(duì)6種植物病原菌均產(chǎn)生了抑菌效果，如圖4。對(duì)玉米彎孢病菌和小麥赤霉病菌的抑制率分別達(dá)到89.68%和82.21%；對(duì)瓜炭疽病菌的抑制作用最弱，但也達(dá)到了56.22%如圖5，與對(duì)照組相比均達(dá)到顯著水平（p＜0.05）。

圖4 XM-4菌株對(duì)植物病原菌的拮抗作用。（a）～(f)為對(duì)照組；(g)～(l)為實(shí)驗(yàn)組；(a)玉米彎孢病菌；(b)小麥赤霉病菌；(c)串珠鐮刀病菌；(d)黃瓜枯萎病菌；(e)茶葉炭疽病菌；(f)瓜炭疽病菌

圖5 XM-4菌株對(duì)6種植物病原菌的抑菌率

2.3 XM-4菌株發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性檢測(cè)

XM-4菌株的無(wú)菌發(fā)酵產(chǎn)物能夠明顯的抑制玉米彎孢病菌、小麥赤霉病菌、串珠鐮刀病菌的正常生長(zhǎng)，如圖6。XM-4菌株的無(wú)菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)串珠鐮刀病菌的抑菌率最高達(dá)82%，對(duì)玉米彎孢病菌的抑菌率最低達(dá)71%，如圖7，差異顯著（p＜0.05）。

圖6 XM-4菌株無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)植物病原菌的拮抗作用。（a）～（c）為對(duì)照組；（d）～（f）為實(shí)驗(yàn)組；（a）玉米彎孢病菌；（b）小麥赤霉病菌；（c）串珠鐮刀病菌

圖7 XM-4菌株無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)3種植物病原菌的抑菌率

2.4 抗氧化活性檢測(cè)

連續(xù)發(fā)酵2 d的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)DPPH的清除能力較弱，只有7.6%。連續(xù)發(fā)酵3 d、4 d，發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性大幅增加，分別達(dá)到59.9%和84.3%，如圖 8。

圖8 XM-4菌株發(fā)酵液DPPH的清除率

2.5 XM-4菌株降解纖維素能力測(cè)定

菌株XM-4連續(xù)6 d發(fā)酵上清液的羧甲基纖維素酶活和濾紙酶活均呈先升后降的趨勢(shì)，CMCase酶活在第三天達(dá)到最高為203.74 U/mL，如圖9，F(xiàn)Pase酶活在第三天達(dá)到最高為172.66 U/mL，如圖 10。

圖9 XM-4菌株的羧甲基纖維素酶活

圖10 XM-4菌株的濾紙酶活

3 結(jié)論與討論

本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和16S rDNA序列分析方法對(duì)XM-4菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明該菌株為枯草芽孢桿菌。抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，XM-4菌株對(duì)玉米彎孢病菌和小麥赤霉病菌的抑菌率分別高達(dá)89.28%和82.21%。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵原液也具有良好的抑菌作用。抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，XM-4菌株的發(fā)酵產(chǎn)物具有一定的抗氧化能力，連續(xù)發(fā)酵4 d的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)DPPH的清除率可達(dá)84.3%。此外，本研究還探究了菌株XM-4的解纖維素能力。實(shí)驗(yàn)測(cè)得該菌的羧甲基纖維素酶活在第3 d達(dá)到最高為203.74 U/mL，濾紙酶活在第3 d達(dá)到最高為172.66 U/mL。XM-4菌株是一株性狀優(yōu)良的枯草芽孢桿菌，具有很高的開(kāi)發(fā)潛能。

已有研究證明初始接菌量會(huì)影響菌株發(fā)酵液的抑菌作用，當(dāng)初始接菌量過(guò)多或過(guò)少時(shí)都會(huì)影響菌株進(jìn)入穩(wěn)定期的時(shí)間和菌株發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物的積累，進(jìn)而影響菌株發(fā)酵液的抑菌效果[20]。因此確定最佳接種量能有效提高代謝產(chǎn)物的積累從而增強(qiáng)微生物的抑菌能力。而本實(shí)驗(yàn)缺乏對(duì)XM-4菌株最佳接種量的探究，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中有待進(jìn)一步完善。

4 小結(jié)

菌株XM-4經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌，通過(guò)抑菌實(shí)驗(yàn)證明菌株XM-4能有效的抑制玉米彎孢病菌、小麥赤霉病菌、串珠鐮刀病菌、黃瓜枯萎病菌、茶葉炭疽病菌和瓜炭疽病菌6種病原菌菌絲的生長(zhǎng)同時(shí)菌株XM-4的無(wú)菌發(fā)酵原液也具有良好的抑菌活性結(jié)合發(fā)酵液定量實(shí)驗(yàn)證明菌株XM-4還具有很強(qiáng)的纖維素降解能力和抗氧化能力。