十二井穴刺絡(luò)放血對(duì)腦缺血大鼠腦組織缺氧狀態(tài)及能量代謝紊亂的影響

高靚 韓寶杰 李蘭媛 徐夢(mèng)瑤 孟雪

(1天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院針灸臨床部 國(guó)家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300193；2天津中醫(yī)藥大學(xué))

腦血管病是一種對(duì)人類(lèi)健康有著嚴(yán)重危害的多發(fā)病與常見(jiàn)病，具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高致殘率、高死亡率等特點(diǎn)〔1〕。在全部腦血管病中缺血性腦血管病占主要比重，約為75%，且近年來(lái)有升高趨勢(shì)，可見(jiàn)其防治的嚴(yán)峻性〔2〕。缺血性腦血管病在祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中屬“中風(fēng)”范疇，臟腑經(jīng)絡(luò)氣血陰陽(yáng)失調(diào)是疾病發(fā)病的主要病因，腦髓病變?yōu)槠浔?，臟腑病變?yōu)槠錁?biāo)，經(jīng)絡(luò)則為委，是本虛標(biāo)實(shí)之證〔3，4〕。因祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)有其獨(dú)特之處，為進(jìn)一步提高腦缺血治療的效果，可考慮采取中醫(yī)治療?！秲?nèi)經(jīng)》中首次提到將針刺用于“中風(fēng)”的治療，且該治療方法被后來(lái)的歷代醫(yī)家完善與發(fā)展，積累了大量的理論與臨床經(jīng)驗(yàn)，其帶來(lái)的治理效果理想，治療機(jī)理獨(dú)特〔5〕。但現(xiàn)有的研究多涉及針刺在腦卒中恢復(fù)期的應(yīng)用，將其直接用于腦卒中急性起病后的治療是否可行尚未見(jiàn)較多報(bào)道。目前國(guó)內(nèi)外研究越來(lái)越重視腦缺血早期的治療，這對(duì)逆轉(zhuǎn)患者腦神經(jīng)功能缺損、改善其預(yù)后意義重大。刺絡(luò)放血即祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的刺血療法，十二井穴刺絡(luò)放血能夠起到極佳的活血化瘀、活絡(luò)通經(jīng)、開(kāi)竅啟閉、祛除邪氣、促正氣恢復(fù)之效，故認(rèn)為將其用于腦卒中的治療有重要價(jià)值〔6，7〕。但與之相關(guān)的研究并不多見(jiàn)。本研究建立腦缺血大鼠模型，給予其十二井穴刺絡(luò)放血治療，主要觀察十二井穴刺絡(luò)放血對(duì)大鼠腦組織缺氧狀態(tài)及能量代謝紊亂的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年健康SD雄性大鼠共50只，體重0.25～0.27 kg，平均(0.25±0.01)kg，月齡為2～3個(gè)月，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，編號(hào)：SCXK(京)2016-0006，飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房籠具內(nèi)(紹豐SIM型、SIR型獨(dú)立換氣系統(tǒng)籠具)，溫度：(22±2)℃，濕度≥40%，動(dòng)物飼養(yǎng)及手術(shù)、給藥和取材等各個(gè)環(huán)節(jié)均符合國(guó)際動(dòng)物倫理相關(guān)動(dòng)物福利要求，倫理號(hào)(TCM-LAEC2018027)，自由飲食水。術(shù)前12 h禁食。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 上海太陽(yáng)生物有限公司提供的組織型纖溶酶原激活物(tPA)試劑盒(批號(hào)：170520)、南京建成生物工程研究所提供的一氧化氮合酶(NOS)試劑盒(批號(hào)：170524)、上海太陽(yáng)生物有限公司提供的腫瘤壞死因子(TNF)-α試劑盒(批號(hào)：170511)、尼地平注射液由山東新華制藥廠提供(批號(hào)170321)、甲醛由開(kāi)封化學(xué)制品提供(批號(hào)：170514)、膽固醇購(gòu)自天津化學(xué)制品廠(批號(hào)：170510)。

1.3主要儀器及設(shè)備 上海第三儀器提供分光光度儀、四川智誠(chéng)醫(yī)療儀器公司提供酶標(biāo)儀、南京建成生物科技提供的玻璃勻漿器、日本SHIMAPZN提供的精密天平、北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器提供的恒溫水浴箱、上海醫(yī)用分析儀器廠提供的離心機(jī)、日本OLYMPUS提供的生物顯微鏡。其他材料還包括：一次性注射器、毫針、量杯、量筒、漏斗、燒杯、止血鉗、鑷子、手術(shù)剪、吸管、試管、離心管、蓋玻片、載玻片等。

1.4動(dòng)物模型建立與分組 大鼠均接受紋狀體微透析導(dǎo)管埋植，并在術(shù)后隨機(jī)選擇10只大鼠作為空白組。除空白組大鼠之外，其他40只大鼠均制備急性腦缺血模型，方法參照文獻(xiàn)中線栓法〔8〕，并進(jìn)行部分改良，并將建模成功的大鼠納入實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為3組，包括模型組、吸氧組與十二井穴刺絡(luò)組。為避免實(shí)驗(yàn)期間大鼠感染或死亡，術(shù)后將大鼠置于無(wú)墊料鼠盒內(nèi)，待蘇醒后在放入有墊料的鼠盒，大鼠能夠自行進(jìn)食與飲水，每日使用碘酒對(duì)手術(shù)局部消毒。

1.5干預(yù)方法 空白組與模型組大鼠不進(jìn)行其他干預(yù)。吸氧組給予50%濃度氧氣吸入60 min，十二井穴刺絡(luò)組給予十二井穴刺絡(luò)放血：(1)穴位定位：參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》〔9〕，模擬家兔十二井穴取穴方法：第一指橈，爪根角旁側(cè)0.1 cm處即“少商”；第二指橈，爪根角旁側(cè)0.1 cm處即“商陽(yáng)”；第五指尺，爪根角旁側(cè)0.1 cm處即“少澤”；第五指橈，爪根角旁側(cè)0.1 cm處即“少?zèng)_”；第三指掌側(cè)頂端中位，爪根0.1 cm處即“中沖”；第四指尺側(cè)，爪根角旁側(cè)0.1 cm處即“關(guān)沖”；第二趾腓，爪根角旁側(cè)0.1 cm即“厲兌”；第一趾脛，爪根角旁側(cè)0.1 cm處即“隱白”；第五趾腓，爪根角旁側(cè)0.1 cm處即“至陰”等，其余還包括涌泉、足竅陰與大敦。(2)刺絡(luò)方法：佩戴無(wú)菌手套，一人抓大鼠背部皮膚，頭部固定，一手固定尾部；另一人點(diǎn)刺各個(gè)穴位，針刺前應(yīng)嚴(yán)格消毒，以毫針點(diǎn)刺后出血3～5滴為宜。每日上午定時(shí)治療，1次/d，左右兩側(cè)交替刺絡(luò)。治療時(shí)間為3 d。

1.6指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1腦組織缺氧狀態(tài) 對(duì)大鼠進(jìn)行斷頭處理，處死后將頭部皮膚切開(kāi)，使用咬骨鉗較顱骨掀開(kāi)，腦組織充分暴露，無(wú)菌條件下將大腦組織分為左半球與右半球，將右側(cè)腦組織取下后去除小腦，稱(chēng)重后向內(nèi)放入適量的10%甲醛溶液固定備用。根據(jù)重量體積比為1∶9的比例加入生理鹽水，使用勻漿器制備腦組織勻漿，后以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清液檢測(cè)腦組織缺氧狀態(tài)相關(guān)指標(biāo)，包括NOS、TNF-α、tPA。嚴(yán)格按照試劑盒步驟操作，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定tPA含量；在一氧化氮作用下，氧合血紅蛋白氧化為甲基血紅蛋白，活性提示每分鐘每毫克腦組織可以生成1個(gè)NOS活力單位(U/ml)；采用液相競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定TNF-α含量。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物的處理均嚴(yán)格符合國(guó)家科技部2006年發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》〔10〕。

1.6.2能量代謝紊亂 腦組織的采集與處理同1.3.1，收集樣本后使用分析儀與對(duì)應(yīng)的試劑盒測(cè)定樣本內(nèi)γ-氨基酸(GABA)及谷氨酸(Glu)含量，檢測(cè)方法均為高效液相法。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1建模結(jié)果 40只用于模型建立的大鼠，最終成功建模33只，其他7只大鼠建模失敗并合理處理，將建模成功的33只大鼠隨機(jī)分為了模型組、吸氧組與十二井穴刺絡(luò)組，各11只。

2.2各組腦組織缺氧狀態(tài)相關(guān)指標(biāo)比較 空白組腦組織中NOS、TNF-α水平表達(dá)最低，tPA水平最高，后依次為十二井穴刺絡(luò)組、吸氧組、模型組，除空白組與十二井穴刺絡(luò)組NOS指標(biāo)無(wú)顯著差異外，其余組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

組別nNOS(U/ml)TNF-α(pg/ml)tPA(ng/ml)空白組1030.01±1.421.57±0.0616.78±0.29模型組1134.98±1.491)2.24±0.041)10.32±0.491)吸氧組1133.64±1.611)2)2.10±0.031)2)11.71±0.411)2)十二井穴刺絡(luò)組1132.02±1.512)3)1.88±0.081)2)3)13.00±0.791)2)3)F值21.064276.582280.880P值<0.001<0.001<0.001

與空白組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；與吸氧組比較：3)P<0.05；表2同

2.3各組能量代謝紊亂相關(guān)指標(biāo)比較 空白組GABA、Glu含量最低，后依次為十二井穴刺絡(luò)組、吸氧組、模型組，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組能量代謝紊亂相關(guān)指標(biāo)水平比較

3 討 論

缺血性腦血管疾病的發(fā)病率是出血性腦血管疾病的3倍左右，具有高發(fā)病率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率、高死亡率等特點(diǎn)〔11〕。故疾病的早期檢出與治療極為關(guān)鍵。

腦缺血以猝然暈倒、不省人事，伴語(yǔ)言不利、口鼻歪斜、半身不遂等為主要癥狀，起病急，病情變化迅速，與自然界中風(fēng)性善變特性相近，故古代醫(yī)家將這類(lèi)疾病以“中風(fēng)”命名，又因疾病發(fā)病突然，故稱(chēng)之為“卒中”，但該病與《傷寒論》中提及“中風(fēng)”實(shí)質(zhì)各異〔12，13〕。關(guān)于腦卒中的病因病機(jī)，歷代醫(yī)家均有論述，在病因方面經(jīng)歷了外因到內(nèi)因論的變化，隨著近現(xiàn)代對(duì)腦卒中的不斷了解與研究，認(rèn)為“氣血不足、腦空”是腦卒中主要病機(jī)〔14〕。腦缺血發(fā)生時(shí)缺血導(dǎo)致的灌注損傷是引起神經(jīng)元發(fā)生不可逆損傷并致殘的關(guān)鍵，故如何選穴，并給予患者合理的針刺治療，能夠減少缺血再灌注損傷帶來(lái)的影響一直是臨床研究的重點(diǎn)〔15〕。

本研究中采用的刺絡(luò)是一種刺血療法，凡屬大熱、氣結(jié)、痰凝、血瘀等病癥均可使用該方法治療，由針灸理論來(lái)看，刺絡(luò)的實(shí)施能夠通過(guò)調(diào)和氣血、祛瘀通絡(luò)、祛邪解表、泄熱解毒、急救開(kāi)竅等途徑來(lái)調(diào)整機(jī)體經(jīng)絡(luò)、臟腑、氣血等功能，故而可考慮將其用于腦卒中的治療〔16〕。然而刺絡(luò)放血療法的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值并未得到較多循證學(xué)證據(jù)支持，且在選穴方面也有一定爭(zhēng)議。祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為腦卒中的病機(jī)為氣、血、風(fēng)、火、虛、痰六端，肝腎虧虛是其根本，這些病機(jī)在一定條件下可以相互影響并相互作用導(dǎo)致疾病突然發(fā)作〔17〕。故可以根據(jù)上述病機(jī)為腦卒中的刺絡(luò)放血治療選穴。十二井穴是一類(lèi)由陰引陽(yáng)的穴位，包括至陰、中充、涌泉、關(guān)沖、大敦、少商、商陽(yáng)、少?zèng)_、隱白、少澤等，十二井穴刺絡(luò)放血能夠大接經(jīng)氣，促十二經(jīng)之氣通調(diào)〔18〕。而腦缺血正是因經(jīng)氣不通、血?dú)獠粫?，左右無(wú)法環(huán)周導(dǎo)致發(fā)病，故十二井穴刺絡(luò)放血能夠使經(jīng)氣相通，促左右環(huán)周，不失為一種腦缺血有效的治療方法。腦缺血患者在發(fā)病后多存在腦組織缺氧，而腦組織缺氧又會(huì)導(dǎo)致能力代謝發(fā)生紊亂，故觀察十二井穴刺絡(luò)放血對(duì)腦缺血患者腦組織缺氧及能量代謝紊亂是否有良好影響，便可確定該方法的腦缺血中的應(yīng)用價(jià)值。本研究成功建立了腦缺血大鼠模型，并對(duì)其進(jìn)行分組與治療，結(jié)果顯示，在治療3 d后，十二井穴刺絡(luò)組大鼠腦組織缺氧狀態(tài)改善情況最理想，且患者能量代謝紊亂情況較其他組得到很好的糾正。結(jié)果顯示，十二井穴刺絡(luò)放血用于腦缺血大鼠的治療用重要的價(jià)值，還應(yīng)在未來(lái)多開(kāi)展類(lèi)似的臨床實(shí)驗(yàn)研究來(lái)證實(shí)其治療有效性安全性，以指導(dǎo)臨床制定更為安全有效的腦缺血治療方案，減少患者因腦組織缺血缺氧導(dǎo)致的一系列損傷。

綜上所述，十二井穴刺絡(luò)放血能夠減輕腦缺血大鼠一氧化氮神經(jīng)毒性，改善大腦缺氧狀態(tài)，糾正大腦能量代謝紊亂的情況，調(diào)節(jié)大鼠腦組織微循環(huán)，保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞，對(duì)阻止腦缺血大鼠腦損傷進(jìn)一步發(fā)展有著積極意義。