生防菌鏈霉菌對西瓜枯萎病防治及幼苗生長的影響

孫洪寶, 李茂營, 吳慧玲, 郭紹貴, 張 潔, 任 毅, 張海英, 宮國義, 許 勇

(1.北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，國家蔬菜工程技術(shù)研究中心，北京 100097；3.北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所，北京 100097)

西瓜是世界上重要的園藝作物[1]，中國的西瓜栽培面積、總產(chǎn)量與人均消費(fèi)量均居世界首位[2]。由于大棚種植長期連作引起連作障礙導(dǎo)致土壤理化性質(zhì)發(fā)生變化，病原菌增加，極易引發(fā)病害，特別是枯萎病的大規(guī)模爆發(fā)已成為制約西瓜生產(chǎn)的重要因素[3]。

西瓜枯萎病是由鐮孢屬尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporumf.sp.niveurn)寄生引發(fā)的真菌土傳病害，嚴(yán)重影響西瓜產(chǎn)量和品質(zhì)[4]。西瓜枯萎病的防治主要有砧木嫁接、培育抗病品種、輪作換茬及藥劑防治等。但各具弊端，如嫁接導(dǎo)致果實(shí)風(fēng)味和品質(zhì)下降、抗病品種選育周期長、農(nóng)藥濫用引發(fā)環(huán)境污染等[5]。與之比較，生物防治有著安全、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。

鏈霉菌(Streptomyces)廣泛分布于各類土壤中，因其能產(chǎn)生多類具有重要價(jià)值的次級代謝產(chǎn)物而倍受關(guān)注，在醫(yī)藥及農(nóng)業(yè)領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用[6]。從土壤中分離篩選的利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus)A02，其代謝產(chǎn)物對植物病原真菌具有廣譜抗性[7]，可通過產(chǎn)生納他霉素影響真菌的生長[8]，A02發(fā)酵液也可誘發(fā)番茄體內(nèi)防御酶活性，增強(qiáng)抗灰霉病的防御體系[7]。鏈霉菌VSMGT1014乙酸乙酯提取物對植物病原真菌有很好的拮抗作用[9]。鏈霉菌SSD49對蘋果輪紋病病原菌、板栗疫病病原菌和大豆核盤菌等多種植物病原菌具有明顯的抑制作用[10]。鏈霉菌M527發(fā)酵液能夠抑制黃瓜枯萎病菌的生長[11]。鏈霉菌可以提高辣椒，黃瓜，草莓等作物多酚氧化酶活性，增強(qiáng)植物整體防御機(jī)能，降低病害的發(fā)生[12-14]。鏈霉菌還可以對植物生長發(fā)育產(chǎn)生一系列的促進(jìn)作用，從而提高植物的抗病性[15-16]。如一些植物根際鏈霉菌可產(chǎn)生有效促進(jìn)植物生長的吲哚乙酸[17]。

試驗(yàn)研究了鏈霉菌A02對西瓜枯萎病的防控效果以及對西瓜生長發(fā)育的影響，分析其固態(tài)菌劑對西瓜枯萎病防控應(yīng)用的可行性，為鏈霉菌A02在生產(chǎn)上的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試品種：枯萎病感病西瓜品種“YX”，由北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心西瓜課題組提供。

供試菌株：利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus)A02由北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所提供；Fusariumoxysporumf.sp.niveurnrace1(FON1)西瓜枯萎病生理小種1(FON1)，由北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心抗病公共平臺(tái)保存。

1.2 鏈霉菌A02皿上抑菌測定

將西瓜枯萎病菌菌餅置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)平板中央，距病菌等距離兩側(cè)接種鏈霉菌，以無菌空白PDA餅塊為對照，每個(gè)處理重復(fù)3次。于25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～4 d后，觀察鏈霉菌對枯萎病菌拮抗和抑制效果。

1.3 鏈霉菌A02固態(tài)菌劑和病原菌孢子懸浮液的制備

鏈霉菌固態(tài)菌劑的制備：鏈霉菌A02菌株發(fā)酵溫度28 ℃，初始pH為7.0左右，接種量15%，培養(yǎng)6天。黃豆粉、麩皮與沙土占大米重量5%、20%與30%，米水比為1:1.5。發(fā)酵完成后干燥粉碎，活菌計(jì)數(shù)后待用。

FON1孢子懸浮液的制備[18]：將FON1菌塊放在PDA培養(yǎng)基表面，置于28 ℃培養(yǎng)箱中，暗培養(yǎng) 3 d，從菌落邊緣挑取菌餅，接種于PD(馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基)培養(yǎng)基中，繼續(xù)在28 ℃條件下?lián)u床振蕩(250 r/min)暗培養(yǎng)7 d，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整孢子濃度為5×106conidia/mL。

1.4 鏈霉菌A02對西瓜枯萎病防控試驗(yàn)

1.4.1 盆栽試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心空調(diào)溫室內(nèi)展開，高壓滅菌后的營養(yǎng)土裝入育苗穴盤中(54 cm×28 cm)，每穴盤播種催芽露白的西瓜種子100粒，待西瓜真葉初展時(shí)，按照每營養(yǎng)缽(9 cm×9 cm)含0.25 g、0.5 g與1.0 g鏈霉菌A02固態(tài)菌劑(1×109CFU/g)的量，與滅菌土混勻后分裝于營養(yǎng)缽中，選取長勢較為一致的西瓜幼苗進(jìn)行病原菌接種，采用浸根接種法[19]，浸根完成后定植到營養(yǎng)缽中。

試驗(yàn)共分為6個(gè)處理，分別為清水對照(Ctrl)、單獨(dú)接種鏈霉菌A02固態(tài)菌劑(Ctrl+A02)、單獨(dú)接種西瓜枯萎病菌(FON1)、接種西瓜枯萎病菌與0.25 g鏈霉菌A02(FON1+0.25 g A02)、接種西瓜枯萎病菌與0.5 g鏈霉菌A02(FON1+0.5 g A02)以及接種西瓜枯萎病菌與1.0 g鏈霉菌A02(FON1+1.0 g A02)。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30株西瓜幼苗，接種處理后遮蔭2～3 d，溫度保持在28 ℃。10 d后進(jìn)行發(fā)病植株病情調(diào)查。

1.4.2 試驗(yàn)測定指標(biāo)與方法

抗病性指標(biāo)測定：西瓜苗期枯萎病的鑒定方法參照Martyn等的分級標(biāo)準(zhǔn)[20]，并參照康振生和宗兆鋒[21]的方法計(jì)算枯萎病病情指數(shù)。

接種處理14 d后，對西瓜幼苗生長指標(biāo)與生理指標(biāo)進(jìn)行測定。

株高：用直尺測定莖基部到頂部之間的距離。莖粗：用游標(biāo)卡尺測定中部莖粗度。植株鮮重與干重：植株洗凈，用電子天平測定鮮重，65 ℃烘干后，測定干重。

光合作用相關(guān)指標(biāo)測定：采用美國LiCOR公司的LiCOR-6400便攜式光合儀測定，以不同處理西瓜植株完全展開功能葉為材料，測定葉片胞間CO2濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導(dǎo)度(Gs)以及凈光合速率(Pn)。用SPAD-502型葉綠素儀在植株功能葉上測定葉綠素含量(SPAD)。

植物激素測定：稱取西瓜葉片1.0 g，采用高效液相色譜法測定激素含量。

1.4.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析利用Excel 2010整理原始數(shù)據(jù)，同時(shí)采用DPS V16.05軟件，差異顯著性分析利用LSD法進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用“平均值”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 鏈霉菌A02皿上抑菌效果

通過瓊脂塊法拮抗性和發(fā)酵液抑菌活性逐級篩選，在候選的100余株鏈霉菌中，得到2株鏈霉菌與西瓜枯萎病FON1形成明顯的拮抗帶，將其中一株鏈霉菌A02與病原菌進(jìn)行皿內(nèi)抑制試驗(yàn)，對峙培養(yǎng)4 d后可觀察到枯萎病菌生長受到了明顯的抑制，菌落形狀為不規(guī)則形狀，如圖1所示。這表明鏈霉菌A02對西瓜枯萎病菌具有明顯的抑制作用。

圖1 鏈霉菌A02對FON1皿內(nèi)抑制效果

2.2 鏈霉菌A02對西瓜枯萎病的防效

如表1所示，與單接種病原菌對照相比接種鏈霉菌A02能顯著降低西瓜枯萎病的發(fā)病率和病情指數(shù)，不同濃度A02處理的防病效應(yīng)也存在差異，0.5 g A02固體菌劑處理的效果優(yōu)于0.25 g和1.0 g A02固體菌劑處理，對枯萎病防治效果也以0.5 g A02固體菌劑效果最好，對枯萎病防效達(dá)到68.23%，顯著高于0.25 g A02(57.75%)和1.0 g A02(62.74%)。綜合比較，選取0.5 g A02固體菌劑處理進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

如圖2所示，F(xiàn)ON1處理導(dǎo)致西瓜幼苗整株嚴(yán)重萎蔫并枯死，而FON1+A02的西瓜幼苗病害程度降低并且新葉無病癥，表明鏈霉菌A02對西瓜枯萎病具有顯著的防控效果。

表1 不同處理對西瓜枯萎病的防治效果

注：數(shù)據(jù)是四次重復(fù)的平均值。當(dāng)P≤0.05時(shí)，同一列中后跟相同字母的值沒有顯著性差異。

圖2 鏈霉菌A02對西瓜枯萎病防病效果

2.3 鏈霉菌A02對西瓜幼苗生長的影響

如表2所示，F(xiàn)ON1處理西瓜幼苗的株高、莖粗、鮮重及干重較清水對照顯著性降低(P<0.05)，嚴(yán)重影響西瓜幼苗生長。FON1+A02處理?xiàng)l件下西瓜幼苗株高、莖粗、鮮重及干重與FON1單獨(dú)處理相比分別增加20.4%、25.8%、49.5%和41.3%(P<0.05)，表明鏈霉菌A02能顯著緩解枯萎病菌對西瓜幼苗生長的不利影響。與清水對照相比，添加A02處理西瓜幼苗株高與鮮重分別增加11.1%和4.9%(P<0.05)，表明鏈霉菌A02對西瓜幼苗生長具有一定的促進(jìn)作用。

表2 枯萎病接種條件下鏈霉菌A02對西瓜生長的影響

注：數(shù)據(jù)是四次重復(fù)的平均值。當(dāng)P≤0.05時(shí)，同一列中后跟相同字母的值沒有顯著性差異。

如表3所示，F(xiàn)ON1處理?xiàng)l件下光合作用相關(guān)指標(biāo)與清水對照相比均有顯著降低，F(xiàn)ON1+A02處理?xiàng)l件下Pn、Ci、Gs、Tr及SPAD值較FON1單獨(dú)處理分別增加17.9%、8.1%、75%、31.3%和10.7%(P<0.05)，表明鏈霉菌A02可減輕枯萎病對西瓜幼苗光合系統(tǒng)的影響，增強(qiáng)西瓜葉片光合作用能力，進(jìn)而增加光合產(chǎn)物的積累；氣孔是植物與外界進(jìn)行氣體交換的主要通道，與清水對照相比，Ctrl+A02西瓜葉片氣孔導(dǎo)度(Gs)提高27.3%(P<0.05)，蒸騰速率(Tr)提高20.8%(P<0.05)，表明植物生長適應(yīng)性的增強(qiáng)，鏈霉菌A02對西瓜植株生長具有一定的促進(jìn)作用。

表3 枯萎病接種條件下鏈霉菌A02對西瓜光合作用相關(guān)指標(biāo)的影響

注：數(shù)據(jù)是四次重復(fù)的平均值。當(dāng)P≤0.05時(shí)，同一列中后跟相同字母的值沒有顯著性差異。

如表4所示，F(xiàn)ON1單獨(dú)處理?xiàng)l件下西瓜幼苗體內(nèi)IAA含量低于可測水平，施用鏈霉菌A02后，F(xiàn)ON1+A02處理中西瓜幼苗體內(nèi)IAA含量顯著性增加，SA較FON1單獨(dú)處理增加62.00%(P<0.05)。

表4 枯萎病接種條件下鏈霉菌A02對西瓜激素含量的影響

注：數(shù)據(jù)是四次重復(fù)的平均值。當(dāng)P≤0.05時(shí)，同一列中后跟相同字母的值沒有顯著性差異。

3 討論與結(jié)論

利用生防鏈霉菌防治西瓜枯萎病國內(nèi)外已有報(bào)道。任遷琪等[22]從辣椒根際土中篩選出10株對西瓜枯萎病有拮抗作用的放線菌，其中菌株F32為鏈霉菌屬，對西瓜枯萎病的防效可達(dá)66.7%。但鑒于土傳病害易受植物根際環(huán)境因素的影響，針對西瓜枯萎病使用單一生防菌劑的防效不高，且穩(wěn)定性差，生產(chǎn)上亟需提供高效的防病促生的鏈霉菌生防制劑。固體發(fā)酵具有設(shè)備簡單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的發(fā)展前景，在本研究中，采用鏈霉菌A02固態(tài)發(fā)酵菌劑，盆栽試驗(yàn)表明A02對西瓜枯萎病防效高達(dá)68.23%，病情指數(shù)由79.39降至25.22，表明鏈霉菌A02固態(tài)發(fā)酵菌劑可有效防治西瓜枯萎病。目前研究大多數(shù)以盆栽試驗(yàn)等控制條件為主，尚需在大田等復(fù)雜環(huán)境中驗(yàn)證鏈霉菌的生防效果。

鏈霉菌不僅能通過誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性實(shí)現(xiàn)其生防作用，還可通過影響植物光合作用能力和內(nèi)源激素含量等生長發(fā)育指標(biāo)來影響其植物抗病性[23]，Wu等[24]發(fā)現(xiàn)利迪鏈霉菌(S.lydicus)能夠增加番茄(Lycopersiconesculentum)葉片數(shù)量，提高光合能力，促進(jìn)生長，并且增加植株體內(nèi)水楊酸與脫落酸等植物生長調(diào)節(jié)劑含量，魏曉麗等[25]發(fā)現(xiàn)鏈霉菌對黃萎病接種條件下仍然具有促進(jìn)棉花生長和提高光合生理特性的作用。辣椒內(nèi)生細(xì)菌 BS-2可提高辣椒和白菜的生長類激素含量，減少脫落酸含量[26]，植物體內(nèi)生菌株XG32具ACC脫氨酶的活性，可以分泌IAA，促進(jìn)植物的生長[27]。鏈霉菌JD211處理水稻幼苗后，促進(jìn)生長提高株高與鮮重，并對水稻稻瘟病有極顯著的抑制作用[28]。本研究中施用鏈霉菌A02后，西瓜幼苗株高與鮮重較對照增加11.1%和4.9%，西瓜幼苗葉片的葉綠素含量較對照組增加8.46%。鏈霉菌A02與枯萎病菌同時(shí)接種，西瓜幼苗葉片凈光合速率(Pn)、細(xì)胞間CO2濃度(Ci)、氣孔導(dǎo)度(Gs)以及蒸騰速率(Tr)均有顯著性增加。在接種西瓜枯萎病條件下施用鏈霉菌A02后，西瓜幼苗葉片IAA含量顯著增加，SA較FON1單獨(dú)處理增加62.00%(P<0.05)。

綜上研究結(jié)果表明，鏈霉菌A02對西瓜枯萎病具有良好的防控效果，進(jìn)一步明確鏈霉菌A02固態(tài)菌劑作為生防農(nóng)藥的良好的應(yīng)用前景。也可以考慮將其應(yīng)用于其他作物病害的生物防治研究中。