穿心蓮水提取物對(duì)大腸桿菌臨床分離株的體外抑制試驗(yàn)

唐豪 郭慧琳

摘 要：試驗(yàn)用不同濃度的穿心蓮水提取物對(duì)大腸桿菌臨床分離株進(jìn)行了體外抑制試驗(yàn)。制備含不同濃度穿心蓮的培養(yǎng)基進(jìn)行大腸桿菌培養(yǎng)，其中試驗(yàn)Ⅱ組、試驗(yàn)Ⅲ組、試驗(yàn)Ⅳ組和試驗(yàn)Ⅴ組培養(yǎng)基分別含不同濃度的穿心蓮，試驗(yàn)Ⅰ組的培養(yǎng)基不加藥作為對(duì)照。3 d后測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑制率，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和回歸分析。結(jié)果表明，穿心蓮對(duì)大腸桿菌具有抑制作用。各組之間均存在顯著差異（P<0.05）。其中試驗(yàn)Ⅰ組與試驗(yàn)Ⅳ組、試驗(yàn)Ⅴ組之間，試驗(yàn)Ⅱ組與試驗(yàn)Ⅴ組之間，試驗(yàn)Ⅲ組與試驗(yàn)Ⅴ組之間均差異極顯著（P<0.01）。劑量與抑制率之間的回歸方程為：y=1.672 9x+2.778 6，R2=0.992，其半數(shù)效應(yīng)濃度EC50=21.28 mg/mL。

關(guān)鍵詞：穿心蓮;大腸桿菌;體外抑制試驗(yàn)

穿心蓮[Andrographis paniculata （Burm. f.）Nees]又名春蓮秋柳、一見(jiàn)喜、欖核蓮、苦膽草、金香草、金耳鉤、印度草和苦草等，一年生草本，藥用植物，具有解熱、抗炎、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)等作用[1-3]。在臨床上，穿心蓮主要用于治療人或動(dòng)物的腸道感染、呼吸道感染、皮膚疾病以及急性菌痢、胃腸炎、感冒發(fā)熱和高血壓等疾病;另外，穿心蓮也可用于抗癌和抗生育等[4-10]。研究表明，穿心蓮具有很高的體外抗菌活性，對(duì)金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、甲型鏈球菌和乙型鏈球菌均有明顯的抑菌作用[7]。為進(jìn)一步確定穿心蓮對(duì)致病性大腸桿菌的抑制作用，特進(jìn)行本試驗(yàn)。

1? 材料與方法

1.1 材料

藥物：中藥穿心蓮購(gòu)自本地醫(yī)藥公司。

菌株：雞大腸桿菌菌株系本實(shí)驗(yàn)室從當(dāng)?shù)仉u場(chǎng)疑似病例中分離、鑒定和保存的優(yōu)勢(shì)菌株O78型大腸桿菌。

培養(yǎng)基的制備：普通LB肉湯和普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基均按常規(guī)方法配制。

1.2 方法

1.2.1 穿心蓮水提取物制備

稱(chēng)取穿心蓮200 g，清洗、浸泡后加? 2 000 mL蒸餾水，文火煎煮1 h，保存濾液。分別加1 600 mL和800 mL蒸餾水進(jìn)行第2次和第3次煎煮。合并3次濾液，加熱濃縮到200 mL（生藥濃度為 1 g/mL），高壓滅菌后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 制備菌懸液

將大腸桿菌接種到肉湯培養(yǎng)基中，? ?37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，調(diào)節(jié)菌液濃度為107 CFU/mL。

1.2.3 含藥培養(yǎng)基的制備

按常規(guī)方法配制普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂，按所需濃度加入不同體積的穿心蓮水提取物，使各組培養(yǎng)基藥物濃度分別為5 mg/mL、? ? 10 mg/mL、20 mg/mL和40 mg/mL，高壓滅菌后，放置于超凈工作臺(tái)，待培養(yǎng)基冷卻至40 ℃～50 ℃，倒入培養(yǎng)皿。

1.2.4 試驗(yàn)分組

試驗(yàn)設(shè)5組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)（n=3）。試驗(yàn)Ⅰ組的培養(yǎng)基不含穿心蓮水提取物，為空白對(duì)照組，試驗(yàn)Ⅱ組、試驗(yàn)Ⅲ組、試驗(yàn)Ⅳ組和試驗(yàn)Ⅴ組的培養(yǎng)基分別加入不同體積的穿心蓮水提取物，使各組培養(yǎng)基含藥濃度分別為5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL和40 mg/mL。

1.2.5 預(yù)試驗(yàn)

取1 mL菌懸液，用無(wú)菌生理鹽水104倍稀釋?zhuān)缓笕?00 μL稀釋菌液，均勻涂布于事先準(zhǔn)備好的普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出，置4 ℃冰箱備用。

1.2.6 抑菌試驗(yàn)

在無(wú)菌條件下，取預(yù)試驗(yàn)制備的大腸桿菌培養(yǎng)皿，選擇一生長(zhǎng)良好、邊緣整齊且獨(dú)立的圓形菌落，用直徑5 mm的打孔器進(jìn)行打孔，用鑷子輕輕夾出菌餅并翻轉(zhuǎn)，使長(zhǎng)有菌落的一面朝下，對(duì)各試驗(yàn)組及對(duì)照組的培養(yǎng)皿進(jìn)行接種，每組3個(gè)。接種后置于? ?37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d后用十字交叉法測(cè)量每組3個(gè)菌落直徑，求平均值，并計(jì)算抑制率。抑制率計(jì)算公式如下：

2? 結(jié)果與分析

穿心蓮水提取物對(duì)大腸桿菌的抑制試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，方差分析結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可見(jiàn)，F(xiàn)=52.36>F0.01，說(shuō)明該試驗(yàn)的處理平均數(shù)間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的極顯著差異（P<0.01）。用最小顯著差數(shù)法（LSD法）進(jìn)行多重比較，結(jié)果見(jiàn)表3。

查t值表，當(dāng)dfe=10時(shí)，t0.05=2.228，t0.01=3.169。計(jì)算得：

由表3可見(jiàn)，試驗(yàn)Ⅰ組與試驗(yàn)Ⅳ組和試驗(yàn)Ⅴ組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的極顯著差異（P<0.01），與試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異（P<0.05）。試驗(yàn)Ⅱ組與試驗(yàn)Ⅴ組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的極顯著差異（P<0.01），與試驗(yàn)Ⅲ組和試驗(yàn)Ⅳ組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異（P<0.05）。試驗(yàn)Ⅲ組與試驗(yàn)Ⅴ組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的極顯著差異? ? ? （P<0.01），與Ⅳ組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異（P<0.05）。

不同濃度藥物對(duì)大腸桿菌的抑制率見(jiàn)表4。

由表4可見(jiàn)，穿心蓮水提取物對(duì)大腸桿菌的抑制效果較好。培養(yǎng)3 d時(shí)，藥液濃度為5 mg/mL時(shí)的抑制率僅為14.95%;隨著藥液濃度的逐步增加，抑制率也隨之增加;當(dāng)藥液濃度達(dá)40 mg/mL時(shí)，抑制率達(dá)65.71%。

對(duì)抑制率數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，以其藥液濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，抑制率概率值為縱坐標(biāo)，得出穿心蓮對(duì)大腸桿菌抑制率的回歸曲線(xiàn)（圖1），其回歸方程為：

3? 討論

中藥穿心蓮植株的不同部位所含的活性成分不盡相同。穿心蓮葉中的穿心蓮甲素（去氧穿心蓮內(nèi)酯）、穿心蓮乙素（穿心蓮內(nèi)酯）和穿心蓮丙素（新穿心蓮內(nèi)酯）的含量分別為0.1%以上、1.5%以上和0.2%以上，還含有高穿心蓮內(nèi)酯、潘尼內(nèi)酯、穿心蓮?fù)?、穿心蓮?fù)?、穿心蓮甾醇和?谷甾醇-D-葡萄糖甙等成分。穿心蓮的根除含穿心蓮內(nèi)酯外，還含5-羥基-7，8，2'，3'-四甲氧基黃酮、5-羥基-7，8，2'-三甲氧基黃酮、5，2'-二羥基-7，8-二甲氧基黃酮、芹菜素-7，4'-二甲醚和α-谷甾醇等成分。穿心蓮的整棵植株含14-去氧-11-氧化穿心蓮內(nèi)酯和14-去氧-11，12-二去氫穿心蓮內(nèi)酯;另?yè)?jù)初步分析，穿心蓮還含甾醇皂甙、糖類(lèi)及縮合鞣質(zhì)等酚類(lèi)物質(zhì)。

在人醫(yī)上，炎琥寧注射液和喜炎平注射液的主要成分均來(lái)自中藥穿心蓮，其中炎琥寧注射液的主要成分是14-脫羥-11，12-二脫氫穿心蓮內(nèi)酯-3，19-二琥珀酸半酯鉀鈉鹽一水物，喜炎平注射液是由穿心蓮內(nèi)酯磺化物制成的中藥注射劑。這提示穿心蓮抗炎的有效成分是穿心蓮內(nèi)酯及其洐生物。據(jù)相關(guān)資料報(bào)道，炎琥寧注射液對(duì)急性咽炎有較好的治療作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)和抑制咽部病理改變的發(fā)生有關(guān)。喜炎平注射液的主要成分是穿心蓮內(nèi)酯總酯磺化物，對(duì)感染性疾病特別是肺炎有治療作用，作用機(jī)制為通過(guò)抑制炎性因子的釋放使抗炎因子與促炎因子趨向平衡，從而達(dá)到合理的抗炎作用。利用像喜炎平注射液這類(lèi)具有清熱解毒作用的中藥治療感染性疾病時(shí)，并不在于中藥能殺死多少種細(xì)菌或病毒，其更為重要的作用是阻斷感染后的炎癥反應(yīng)，對(duì)機(jī)體進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)。也就是說(shuō)，中藥是在綜合效應(yīng)之下，達(dá)到與抗菌藥物相同的治療目的。在本次試驗(yàn)中，穿心蓮對(duì)大腸桿菌具有明顯的抑制效果，其機(jī)理尚有待進(jìn)一步研究。