自擬中藥湯劑聯(lián)合百令膠囊對慢性腎臟病大鼠腎臟炎癥及p38 MAPK信號通路的影響*

郭亞平，郭補林**，趙亞峰，劉旭琴，魯小慶，趙東艷，閆隱隱

(1.榆林市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 榆林 719000； 2.陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710003)

慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)是指由多種原因引起的腎功能下降和腎實質(zhì)損害、短期或長期不可逆轉(zhuǎn)的一類腎臟疾病，其病理表現(xiàn)為腎小球和腎間質(zhì)內(nèi)的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的腎臟纖維化，故抑制炎癥反應(yīng)對治療CKD具有重要意義[1]。有文獻報道，p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activatedprotein kinase，p38 MAPK)信號通路參與了腎臟炎癥反應(yīng)，其可將外界刺激轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和IL-8等多種炎癥因子，導(dǎo)致腎臟損害及腎纖維化，故阻斷p38 MAPKs信號通路對緩解CKD進展有重要的作用[2]。中醫(yī)藥在CKD等多種慢性疾病治療中有獨特的優(yōu)勢[3]。百令膠囊為人工合成的冬蟲夏草，是我國有名的滋補強壯中藥，研究已證實其對CKD患者的腎功能指標(biāo)有一定的改善效果[4]。本研究采用自擬中藥湯劑聯(lián)合百令膠囊對CKD模型大鼠進行治療，探討這兩類中藥對CKD的治療機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 40只SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，購自成都達碩生物科技有限公司[質(zhì)量合格證號為SCXKC(111)2008-24]大鼠自由攝食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.1.2藥物與試劑 腺嘌呤(批號0183)購自美國 Amresco公司，百令膠囊(批號Z10910036)購自杭州中美華東制藥有限公司，生黃芪、茯苓、黨參、蒼術(shù)、炒白術(shù)、巴戟天、澤蘭葉、六月雪、紅花、桃仁、莪術(shù)、酒大黃和水蛭粉均購自成都杏林大藥房，大鼠Ⅰ型膠原C端肽(CTX-Ⅰ)ELISA試劑盒(批號ZC-35983)和大鼠Ⅲ型膠原(Col Ⅲ)ELISA試劑盒(批號ZC-36009)均購自上海茁彩科技有限公司，RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司，SYBR Green Gene Expression Assay購自大連Takara公司，p-p38 MAPK多克隆抗體(批號44-684G)、p38 MAPK單克隆抗體(批號33-1300)、p-JNK單克隆抗體(批號PA1-9594)、JNK單克隆抗體(批號AHO1362)、p-ERK1/2單克隆抗體(批號MA5-15174)、ERK1/2單克隆抗體(批號MA5-15134)、IL-6多克隆抗體(批號ARC0062)、IL-8單克隆抗體(批號MA5-24081)、干擾素-γ(IFN-γ)單克隆抗體(批號ARC4033)和β-actin單克隆抗體(批號MA5-15739)均購自Thermo Fisher公司，HRP標(biāo)記山羊抗兔、山羊抗鼠抗體均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1模型建立及給藥 將大鼠隨機分為空白組、CKD組、百令膠囊組和中藥湯劑聯(lián)合百令膠囊組4組，每組10只?？瞻捉M大鼠灌胃生理鹽水，其他組灌胃2.5%腺嘌呤混懸液(300 mg/kg)，連續(xù)4周，建立大鼠CKD模型。第5周，空白組和CKD組灌胃生理鹽水，百令膠囊組按0.625 g/kg劑量灌胃百令膠囊，中藥湯劑聯(lián)合百令膠囊組在百令膠囊基礎(chǔ)上加服中藥湯劑，根據(jù)大鼠和成人用藥計量換算系數(shù)6.25，計算得大鼠用中藥湯劑的劑量為20.94 g/kg。所有大鼠均按體質(zhì)量每100 g給予1 mL劑量給藥，每天灌胃1次。自擬中藥湯劑制備方法：將生黃芪30 g，茯苓20 g，黨參、蒼術(shù)、炒白術(shù)、巴戟天、澤蘭葉各15 g，六月雪30 g、紅花、桃仁、莪術(shù)各12 g，酒大黃7 g，水蛭粉3 g，加入2 000 mL蒸餾水煎煮60 min，濃縮至96 mL，濃縮液中藥含量為2.09×103g/L。

1.2.2標(biāo)本采集 末次給藥后大鼠置于代謝籠收集尿液樣本，并禁食24 h，按照30 mg/kg劑量腹腔注射戊巴比妥鈉進行麻醉，麻醉后取腹主動脈血于抗凝采血管，靜置1 h后，于3 000 r/min離心10 min，收集血清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。采血結(jié)束后處死大鼠，摘取大鼠腎臟組織，生理鹽水清洗殘余血液后，將組織分為3部分，一部分置于4%多聚甲醛固定 24 h，制作HE病理切片；一部分腎臟組織置于液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80 ℃保存保用；另一部分制備勻漿液，3 000 r/min離心10 min取上清液，-80 ℃保存。

1.2.3腎功能指標(biāo)及Col-Ⅰ和Col-Ⅲ檢測 采用全自動生化儀檢測各組大鼠血清中血肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)含量，檢測24 h尿白蛋白(UAlb/24 h)和尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(NAG)酶含量。采用ELISA試劑盒檢測腎組織勻漿液上清中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的含量。

1.2.4腎臟組織學(xué)觀察 腎臟組織固定24 h后進行脫水、透明、包埋和切片，HE染色后觀察各組大鼠腎臟組織組織學(xué)變化。

1.2.5腎組織中IL-6、IL-8和INF-γ mRNA的表達 使用總RNA提取試劑提取各組大鼠腎臟組織總RNA，并使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit合成cDNA，以cDNA樣品為模板，對IL-6、IL-8和INF-γ mRNA表達量進行檢測，引物由上海生工生物有限公司合成。IL-6引物：F端為5′-GAC TGA TGT TGT TGA CAG CCA CTG C -3′，R端為5′-AGC CAC TCC TTC T GT G AC TC T AAC T -3′。IL-8引物：F端為5′-TGG TCT CAG CCA CCCGC-3′，R端為5'-CCC TGT GGC TTG GCG G-3′。INF-γ引物：F端為5′-ATG AGT GCT ACA CGC CGC GTC TTG G-3′，R端為5′-GAG TTC ATT GAC AGC TTT GTG CTG G-3′。β-actin引物：F端為5′-GAC TGA TGT TG T TGA CAG CCA CT G C -3′，R端為5′-TAG CCA CTC CTT CTG TGA CTC TAA CT-3′。反應(yīng)體系12.5 μL：SYBR Premix Ex TaqTMII 6 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，模板5 μL，ddH2O補足。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，25個循環(huán)。以β-actin為參照，用2-ΔΔCt法計算組織中各基因的相對表達量。

1.2.6腎組織中IL-6、IL-8、INF-γ、p38 MAPK、p-p38 MAPK、JNK、p-JNK、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達 取100 mg腎組織剪碎后，根據(jù)蛋白提取試劑盒操作說明提取各組大鼠腎臟組織總蛋白，并用二喹啉甲酸(BCA)法進行定量。使用等量蛋白質(zhì)上樣，蛋白變性后選擇10%SDS-PAGE進行分離，分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗(IL-6、IL-8、INF-γ、p38 MAPK、p-p38 MAPK、JNK、p-JNK、ERK1/2和p-ERK1/2和β-actin均按1 ∶400稀釋)，4 ℃孵育過夜后用TBST清洗3次，每次10 min，然后用相應(yīng)二抗IgG(稀釋比例均為1 ∶5 000)室溫孵育1 h，再用TBST清洗3次，ECL暗室顯色。Bio-Rad全功能成像系統(tǒng)采集圖像后，用Image-ProPlus分析灰度值密度，以β-actin為內(nèi)參，計算各組大鼠腎臟組織中相關(guān)蛋白的相對表達量，重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血清BUN、Scr及UAlb/24 h及尿NAG酶

與空白組相比，CKD組大鼠血清中BUN、Scr含量、UAlb/24 h以及尿NAG酶明顯升高(P<0.01)，表明CKD模型復(fù)制成功；與CKD組比較，百令膠囊組和中藥湯劑聯(lián)合百令膠囊組大鼠上述指標(biāo)均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與百令膠囊組相比，中藥湯劑聯(lián)合百令膠囊組BUN和Scr含量均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠腎功能相關(guān)指標(biāo)Tab.1 Related indexes of renal function of rats in each

注：(1)與空白組比較，P<0.01;與CKD組比較，(2)P<0.01，(3)P<0.05；與百令膠囊組比較，(4)P<0.01，(5)P<0.05。

2.2 腎組織中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ表達

與空白組相比，CKD組大鼠腎組織中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ含量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與CKD組相比，百令膠囊組和中藥湯劑聯(lián)合百令膠囊組大鼠腎組織中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見圖1。

注：(1)與空白組比較，P<0.01;與CKD組比較，(2)P<0.01，(3)P<0.05；(4)與百令膠囊組比較，P<0.05。圖1 各組大鼠腎組織中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的表達Fig.1 The expression of Col-Ⅰ and Col-Ⅲ in renal tissue of rats in each group

2.3 腎組織學(xué)觀察

各組大鼠腎臟組織學(xué)結(jié)果顯示，對照組和百令膠囊組大鼠腎小管排列正常，腎小球結(jié)構(gòu)完整；CKD組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)紊亂，腎小管壞死，囊性擴張，同時伴纖維增生及大量炎性細(xì)胞浸潤；與CKD組比較，百令膠囊組和中藥湯劑聯(lián)合百令膠囊組大鼠腎組織完整，腎小球數(shù)目增多，腎小管擴張程度降低，炎性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，而中藥湯劑聯(lián)合百令膠囊組腎小管擴張程度、炎性細(xì)胞數(shù)量減少更明顯。見圖2。

圖2 各組大鼠腎臟組織學(xué)變化(HE)Fig.2 Changes of renal histology of rats in each group(HE)

2.4 腎組織中炎性因子

CKD組大鼠腎組織中IL-6、IL-8和INF-γmRNA和蛋白表達量均顯著性上升，與空白組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與CKD組相比，百令膠囊組和中藥湯劑聯(lián)合百令膠囊組大鼠的IL-6、IL-8和INF-γmRNA和蛋白含量均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；與百令膠囊組比較，中藥湯劑聯(lián)合百令膠囊組大鼠腎組織中IL-6、IL-8和INF-γmRNA和蛋白含量降低更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

注：A、B為 Western blot結(jié)果，C～E為Real-time PCR 結(jié)果；(1)與空白組比較，P<0.01;與CKD組比較，(2)P<0.01、(3)P<0.05；(4)與百令膠囊組比較，P<0.05。圖3 各組大鼠腎組織中IL-6、IL-8和INF-γ mRNA和蛋白表達Fig.3 The expression of IL-6, IL-8, INF-γ mRNA and protein expressions in renal tissue of rats in each group

2.5 腎組織中p-p38MAPK、p-JNK、JNK、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白的表達

與空白組相比，CKD組大鼠腎組織中p-p38MAPK、p-JNK、JNK、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白均明顯升高(P<0.01)，而百令膠囊組大鼠腎組織中上述蛋白表達量均降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與CKD組相比，中藥湯劑聯(lián)合百令膠囊組的p-p38 MAPK、p-JNK、JNK、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白表達量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。與百令膠囊組相比，中藥湯劑聯(lián)合百令膠囊組p-JNK蛋白表達明顯降低(P<0.05)，其余蛋白表達量也減少，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

3 討論

最新CKD流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，我國CKD的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，對我國人民的生命健康造成了極大的危害，已是腎臟疾病領(lǐng)域的研究熱點[5]。雖然研究已證實腎組織的炎癥反應(yīng)及其相關(guān)的組織損傷是導(dǎo)致其進展至終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)的重要因素，但目前尚缺乏能有效抑制腎臟炎癥反應(yīng)和改善腎組織損傷的藥物[6-7]。

中醫(yī)認(rèn)為CKD病性為本虛標(biāo)實和虛實夾雜，病機為人體腑臟功能失調(diào)、氣血虧損、陰陽失衡、脾腎虧虛、濁毒內(nèi)蘊以及清濁不合等特點[8]。本研究采用自擬中藥湯劑聯(lián)合百令膠囊治療，方中生黃芪補氣升陽、益氣固表、利水消腫[9]，茯苓利水滲濕、健脾益胃，黨參和炒白術(shù)補中益氣、健脾益肺[10]，蒼術(shù)燥濕健脾，巴戟天溫腎壯陽、益精血、強筋骨、祛風(fēng)濕，紅花、澤蘭葉、桃仁、莪術(shù)和水蛭粉均有活血化瘀、行水消腫的功效，配酒大黃活血泄?jié)幔卵┦栾L(fēng)、清熱、利濕、舒筋活絡(luò)、解毒行淤，巧配巴戟天以溫腎祛濕，疏通經(jīng)脈，化散瘀滯?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明，生黃芪[11]、酒大黃[12]、蒼術(shù)[13]、莪術(shù)[14]具有調(diào)節(jié)免疫功能，黨參、巴戟天具有抗氧化、防衰老、抗炎、抗疲勞、增強記憶和抗腫瘤功能[15-16]。百令膠囊與天然冬蟲夏草藥理活性相似，主要成分包括D-甘露醇、麥角醇、蟲草酸、載體生物堿、多種氨基酸、維生素和微量元素等，在中醫(yī)理論上具有補益肺腎和止血化痰之功效[17]?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明，百令膠囊具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎和抗腫瘤等多種藥理學(xué)活性，對腎臟、肺臟和肝臟均有保護效果[18]。研究發(fā)現(xiàn)，百令膠囊能改善CKD患者臨床癥狀、提高生活質(zhì)量[19]。因此，本文聯(lián)合自擬中藥湯劑和百令膠囊對CKD大鼠進行干預(yù)，評價治療效果和可能機制。

注：(1)與空白組比較，P<0.01；與CKD組比較，(2)P<0.01、(3)P<0.05；(4)與百令膠囊組比較，P<0.05。圖4 各組大鼠腎組織中p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-JNK、JNK、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白表達Fig.4 The expression of p-p38 MAPK, p38 MAPK, p-JNK, JNK, p-ERK1/2 and ERK1/2 protein expression in renal tissue of rats in each group

Scr和BUN是反映腎功能損害的常規(guī)檢測指標(biāo)。UAlb/24h與尿NAG酶被認(rèn)為是早期腎損傷的主要標(biāo)志物，而Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的過度沉積也是腎臟損傷的標(biāo)志性病理特征[20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CKD模型大鼠出現(xiàn)了典型的腎功能損傷癥狀，包括Scr、BUN、UAlb/24h、尿NAG、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ含量增加；經(jīng)百令膠囊治療后，升高的上述腎損傷指標(biāo)均被明顯抑制。同時，HE染色顯示，百令膠囊能改善CKD大鼠腎小球結(jié)構(gòu)紊亂、腎小管壞死、腎小管間質(zhì)纖維化和炎性細(xì)胞浸潤等病理變化，提示百令膠囊有保護腎臟的藥理學(xué)活性。用中藥湯劑聯(lián)合百令膠囊治療后，大鼠腎功能損傷指標(biāo)被進一步降低，而腎臟組織病理學(xué)損傷也被進一步改善。表明中藥湯劑能增強百令膠囊對CKD大鼠的治療效果。Yang等[21]認(rèn)為炎癥反應(yīng)既是導(dǎo)致CKD的主要原因，又是CKD發(fā)生發(fā)展導(dǎo)致的結(jié)果。本研究進一步驗證了CKD中炎癥因子的變化及百令膠囊對炎癥因子的調(diào)控作用。結(jié)果表明，CKD模型大鼠腎組織中IL-6、IL-8和INF-γmRNA表達量顯著性增加，百令膠囊可顯著降低腎組織中IL-6、IL-8和INF-γmRNA的含量，而中藥湯劑能增強百令膠囊對促炎因子的抑制，提示中藥湯劑聯(lián)合百令膠囊能通過調(diào)節(jié)IL-6、IL-8和INF-γ等炎癥因子，從而減輕炎癥反應(yīng)和腎臟損害。

腎組織炎癥反應(yīng)的病理特征主要指腎組織炎性細(xì)胞浸潤、活化以及相關(guān)信號通路的激活。多條炎癥信號通路及細(xì)胞因子的活化參與了腎組織炎癥反應(yīng)的調(diào)控，其中，p38MAPK作為重要的炎癥調(diào)控因子，其激活后進入細(xì)胞核調(diào)控多種轉(zhuǎn)錄因子的表達，從而促進炎癥細(xì)胞的浸潤與活化，加劇腎組織損傷[22]。研究發(fā)現(xiàn)，坎地沙坦和表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯通過p38-MAPK途徑改善慶大霉素誘導(dǎo)的大鼠腎臟損傷[23]。為了進一步探討百令膠囊抑制大鼠腎組織炎癥反應(yīng)的可能作用機制，本研究檢測了p38 MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達情況。研究結(jié)果表明，CKD模型大鼠腎組織中的p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-JNK、JNK、p-ERK1/2和ERK1/2均明顯顯著增加，表明CKD模型大鼠腎組織中p38 MAPK信號通路被激活，百令膠囊能抑制大鼠p38 MAPK磷酸化蛋白(p-p38MAPK)及其下游的JNK和ERK通路的激活，但并無顯著性差異，而用中藥湯劑聯(lián)合百令膠囊干預(yù)后，激活的p38 MAPK信號通路被顯著性抑制。研究結(jié)果提示，模型鼠腎臟p38MAPK信號通路被激活后，p-p38MAPK進入細(xì)胞內(nèi)，通過促進核內(nèi)多種炎癥因子的表達，導(dǎo)致腎組織發(fā)生炎癥損傷。推測中藥湯劑聯(lián)合百令膠囊可通過下調(diào)p-p38MAPK的表達，從而改善CKD模型大鼠腎組織炎癥損傷。

綜上所述，中藥湯劑聯(lián)合百令膠囊可降低CKD大鼠BUN、Scr、UAlb/24 h、尿NAG酶、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ含量，改善腎臟組織病理變化和減輕炎癥損傷，其機制可能與抑制p38MAPK信號通路的激活有關(guān)。但中藥湯劑聯(lián)合百令膠囊調(diào)控p38MAPK信號通路，改善CKD大鼠腎損傷的上游通路還有待進一步研究。