HPLC法測定工業(yè)大麻花葉中的CBD和THC的含量

劉勝貴，馬海悅*，李智高，付彬彬，孔令羽

（云南綠新生物藥業(yè)有限公司，云南 曲靖 655000）

工業(yè)大麻為一年生草本植物，又名大麻、漢麻、火麻[1]，是指種子、莖、花梢（開花結(jié)果的梢）、花、葉及根部中的四氫大麻酚 (THC)含量小于0.3%的大麻屬植物。2003年1月，云南省公安廳制定了《云南省工業(yè)用大麻管理暫行規(guī)定》，規(guī)定四氫大麻酚 (THC)含量小于0.3%的大麻品種為允許種植的工業(yè)大麻。主要應(yīng)用于食品、制藥、紡織、化妝品等行業(yè)，具有重大的潛在社會和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2-4]。

大麻素是大麻中特有的萜類次生代謝產(chǎn)物，目前報(bào)道的大麻素就有120多種，主要聚集在大麻植株的腺體毛中（主要在苞葉與嫩葉部位），最主要且含量較高的是大麻二酚（以下簡稱CBD） 和四氫大麻酚 (以下簡稱 THC）[4-5]。THC是大麻致幻物質(zhì)的主要成分，也是導(dǎo)致許多國家禁種大麻的原因；CBD則能阻礙THC對人體神經(jīng)系統(tǒng)影響，有“反毒品化合物”的美稱[4-6]。CBD具有抗炎、抗驚厥、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗凋亡和抗癌作用，在治療癲癇、多種癌癥、多發(fā)性動脈硬化與帕金森病、預(yù)防心肌梗死、抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和抑制性激素分泌等具有一定療效。目前CBD已被FDA批準(zhǔn)用于治療難治性癲癇，是近年來的研究熱點(diǎn)[5、7-8]。

目前，CBD主要來源于工業(yè)大麻，主要從工業(yè)大麻花苞及嫩葉中提取，CBD含量是評價(jià)工業(yè)大麻質(zhì)量的重要指標(biāo)，故準(zhǔn)確測定工業(yè)大麻花葉原料中的CBD含量十分重要。盡管種植的是工業(yè)大麻品種，仍需關(guān)注THC的含量，這對大麻毒品的監(jiān)測和控制有重要意義。目前，國內(nèi)外關(guān)于CBD與THC的檢測主要利用HPLC、GC-MS、LC-MS等，為此，本文研究參考相關(guān)文獻(xiàn)[3、8-12]，建立了一種HPLC檢測方法，用于測定工業(yè)大麻花葉中CBD和THC的含量，具有準(zhǔn)確、穩(wěn)定等特點(diǎn)，可用于工業(yè)大麻的品質(zhì)判定，對工業(yè)大麻質(zhì)量控制具有重要意義。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

樣品：工業(yè)大麻花葉樣品，置于鼓風(fēng)干燥箱干燥至恒重（水分小于5%），粉碎（細(xì)度≤0.425mm），混勻置于自封袋中保存，待測。（樣品來源：公司內(nèi)部樣品，本公司具備《云南省工業(yè)大麻種植許可證》）

儀器：Agilent 1260高液相色譜儀（包括G7111A四元泵，G7127A自動進(jìn)樣器，G7116A柱溫箱，G7115A二極管陣列檢測器，OpenLab CDS2色譜工作站，美國Agilent公司）；Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱 （150 mm×4.6 mm，5μm，美國 Agilent公司）；電子天平（FA1004B型，上海市安亭電子儀器廠）；超聲波清洗器（G-100S，深圳市歌能清洗設(shè)備有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE52-99，上海亞榮生化儀器廠）；純水儀（Master-S15/30UVF型，上海和泰儀器有限公司）；0.22μm有機(jī)相微孔針筒過濾膜（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

試劑：甲醇（色譜純，美國Thermo Fisher公司）；乙腈（色譜純，美國Thermo Fisher公司）；水為自制超純水。四氫大麻酚（THC）和大麻二酚（CBD） 標(biāo)準(zhǔn)品（1mg/mL，1mL，美國Sigma-Aldrich公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工作曲線制作

將CBD及 THC標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) （1mg/mL，1mL）分別轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，得100μg/mL的CBD或THC標(biāo)準(zhǔn)溶液，移取一定量100μg/mL CBD或THC母液，逐級稀釋用甲醇定容，分別得CBD和THC濃度范圍約為1～100μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 樣品分析

稱取1g工業(yè)大麻花葉樣品于錐形瓶中，加入10mL甲醇，超聲提取30 min，然后過濾收集濾液，濾渣再用10mL甲醇超聲提取兩次，合并三次濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（溫度40℃）濃縮除去部分溶劑，然后將濃縮液轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶，用甲醇定容，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后，進(jìn)HPLC分析。若樣品處理液濃度超過標(biāo)準(zhǔn)工作曲線濃度范圍，則稀釋后再檢測。

HPLC條件：色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱；流速：1mL/min，流動相A為水，流動相B為乙腈，等度洗脫， V（乙腈）：V（水） =65∶35；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積10 μL；檢測波長220nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

本試驗(yàn)選擇了甲醇、乙醇、正己烷+乙酸乙酯（9+1）為提取溶劑，取同一個樣品，分別用不同溶劑提取，其余按本方法進(jìn)行分析，采用樣品中CBD及THC的含量進(jìn)行樣品提取評價(jià)，結(jié)果如表1。結(jié)果顯示，用正己烷+乙酸乙酯作為提取溶劑時(shí)，樣品中在THC標(biāo)品出峰處未出峰，未檢出THC。但用甲醇和乙醇提取時(shí)均能夠檢出THC，故不使用正己烷+乙酸乙酯（9+1） 作為提取溶劑；甲醇和乙醇相比甲醇溶液提取效率最好。因此，本方法選擇甲醇作為提取溶液。

2.2 提取次數(shù)的選擇

充分提取目標(biāo)物是定量分析中的重要因素，本實(shí)驗(yàn)考察了提取次數(shù)對CBD和THC含量的影響。用甲醇提取四次，每次的提物液分別定容后進(jìn)HPLC分析，其余按本方法進(jìn)行處理，結(jié)果如表2。結(jié)果顯示，隨著提取次數(shù)的增加，CBD和THC的含量逐次減小，第四次的提取液中CBD和THC的含量均已非常低，可忽略，說明三次提取能夠充分將工業(yè)大麻花葉的CBD和THC成分提取，故本實(shí)驗(yàn)選擇用甲醇提取三次。

表1 不同提取溶劑對CBD和THC提取效果的影響Tab.1 effects of different solvents on extraction of CBD and THC

表2 不同提取次數(shù)對CBD和THC提取效果的影響Tab.2 effects of different extraction times on extraction of CBD and THC

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限

按照1.2.1制作工作曲線，分別得CBD和THC濃度范圍為1～100μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，進(jìn)行HPLC分析。以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液目標(biāo)物的色譜峰面積對其相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)濃度進(jìn)行回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；以EPA方法計(jì)算方法的檢出限（LOD），結(jié)果見表3?？梢姡?～100μg/mL范圍內(nèi)線性好，R2＞0.9997。CBD、THC標(biāo)準(zhǔn)品譜圖見圖1、圖2。

表3 方法線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限Table 3 linear regression equation,Correlation Coefficient,detection limit

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

取工業(yè)大麻花葉樣品，用本實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測定，做6個平行樣品，以評價(jià)本方法的精密度。結(jié)果見表4。結(jié)果表明，CBD和THC的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） 均小于3%。表明本方法可靠穩(wěn)定，重復(fù)性好。

2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

圖1 CBD標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC CHROMATOGRAM OF CBD Standard substance

圖2 THC標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖Fig.2 HPLC CHROMATOGRAM OF THC standard substance

表4 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.4 precision test results（n=6）

分別加入高、中、低 （2μg/mL、5μg/mL、20μg/mL） 三個質(zhì)量濃度水平的CBD和THC標(biāo)準(zhǔn)品溶液于空白樣品（不含CBD和THC的樣品）中，用本實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測定，求得CBD和THC的回收率，結(jié)果見表 5。回收率為82.0%～102.8%，表明本方法回收率好，準(zhǔn)確可靠。

表5 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.5 experimental results of recovery rate

2.6 樣品分析

按本試驗(yàn)方法對3個工業(yè)大麻花葉樣品進(jìn)行分析，結(jié)果見表6。樣品典型色譜圖（見圖3）。

3 結(jié)論

本方法采用HPLC同時(shí)測定工業(yè)大麻花葉中的 CBD和 THC，CBD的檢出限為 0.12μg/mL，THC的檢出限為0.08μg/mL，回收率在82.0%～102.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）≤2.64%，可滿足工業(yè)大麻花葉中CBD和THC的準(zhǔn)確測定。

表6 樣品分析結(jié)果Tab.6 results of sample analysis

圖3 工業(yè)大麻花葉典型樣品色譜圖Fig.3 chromatogram of typical samples of industrial hemp flowers and leaves