云南疣粒野生稻抗白葉枯病多菌系鑒定分析

邢佳鑫 陳玲 柯學(xué) 鐘巧芳 張敦宇 付堅 陳越 肖素勤 王玲仙 王波 殷富有 陳麗娟 程在全*

（1 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，昆明650201；2 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所/云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，昆明650205；*通訊作者：650205czquan-99@163.com）

水稻白葉枯?。╞acterial blight）是世界范圍內(nèi)最嚴(yán)重的水稻細(xì)菌性病害，也是我國水稻三大病害之一。實踐證明，水稻白葉枯病沒有特效的化學(xué)防治試劑，而種植抗病品種是最為經(jīng)濟、安全和有效的防治措施。為了在水稻白葉枯病害常發(fā)區(qū)獲得理想的水稻產(chǎn)量，需要不斷培育攜有不同抗白葉枯病基因的品種，尤其是對廣譜抗病基因的發(fā)掘與利用，以抵御白葉枯病菌的變異[1]。

野生稻是現(xiàn)代栽培稻的始祖，由于長期處于野生狀態(tài)，經(jīng)受了各種災(zāi)害和不良環(huán)境的自然選擇，蘊含了大量的優(yōu)良基因，是天然的基因?qū)殠靃2]。全世界稻屬中有22 個野生種，從中發(fā)掘可利用的抗病新基因并進(jìn)行育種利用，是近年來研究的熱點。迄今從野生稻中克隆的抗白葉枯病基因有 3 個，即 Xa21[3]、Xa23[4]和 Xa27（t）[5]。 另 外 ，Xa29（t）[6]、Xa30（t）[7]、Xa32（t）[8]、xa32（t）[9]和Xa35（t）[10]等5 個抗白葉枯病基因分別來自藥用野生稻、普通野生稻、澳洲野生稻、疣粒野生稻和小粒野生稻。這5 個抗白葉枯病基因已被定位在不同的染色體上，但目前尚未被克隆。可見，野生稻中的抗白葉枯病基因的發(fā)掘應(yīng)用還處于初級階段，從中開發(fā)利用廣譜高抗白葉枯病基因的前景廣闊，對改良栽培稻抗性、擴寬其遺傳基礎(chǔ)具有重大意義。

疣粒野生稻是中國現(xiàn)有三種野生稻資源之一，主要分布在云南和海南，擁有許多優(yōu)良性狀，具有很高的利用價值。過去一些研究表明，疣粒野生稻對白葉枯病抗性良好，發(fā)現(xiàn)其抗性從高抗到接近免疫[11-12]。然而，程在全等[13]利用 C1、X1、BD8438 和 CN9404 共 4 個菌株鑒定云南疣粒野生稻對白葉枯病的抗性時發(fā)現(xiàn)，部分植株感供試菌株?？梢姡颇橡嗔Ｒ吧緦Π兹~枯病菌的抗性并不一致。為了解云南疣粒野生稻對不同白葉枯病小種的抗性，尤其是對近年在云南部分稻區(qū)流行的白葉枯病菌的抗性，本研究利用本實驗室從2013 年至2017 年間收集的云南不同地區(qū)水稻白葉枯病菌株，以及國內(nèi)外部分標(biāo)準(zhǔn)強致病菌系，對云南疣粒野生稻12 個居群共36 份材料進(jìn)行了抗性鑒定，以為開發(fā)和利用云南疣粒野生稻抗白葉枯病基因提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料和菌株

供試的疣粒野生稻材料取自云南省不同地區(qū)的12 個居群，每個居群分別隨機采樣3 株，共36 份，其詳細(xì)來源見表1。金剛30 為感病對照材料。所有研究材料均種植于本實驗室溫室中。

供試水稻白葉枯病菌株：本研究中用到的菌株包括本實驗室從2013 年至2017 年間收集的18 個在云南省部分稻作區(qū)流行的白葉枯病菌，以及6 個國內(nèi)外部分標(biāo)準(zhǔn)強致病菌系，共24 個，詳細(xì)信息見表2。

表2 不同白葉枯病菌詳細(xì)信息

表3 接種水稻白葉枯病發(fā)病程度分級標(biāo)準(zhǔn)

1.2 供試材料的培養(yǎng)

對選取的疣粒野生稻材料進(jìn)行割茬處理，分栽到直徑為20 cm、高為15 cm 的花盆中，每份材料分栽24盆，進(jìn)行編號，澆透水，放置在溫室陰涼處，每隔1 周澆1 次水，待植株長至孕穗期時進(jìn)行接種鑒定。同時播種金剛30 種子于24 個直徑為21 cm、高為21 cm 的花盆中，進(jìn)行編號，放置在溫室中進(jìn)行正常水肥培養(yǎng)至孕穗期。將各材料相同編號的花盆放在一起，利于接種同一菌株。

1.3 抗病性鑒定

本研究采用剪葉接種的方法進(jìn)行鑒定。接種前將在-20℃保存的菌種于NA 培養(yǎng)基上復(fù)壯，28℃～30℃培養(yǎng)48 h 后，用無菌水洗脫菌株，懸浮均勻，將菌懸液濃度調(diào)節(jié)為 3×108cfu/mL（OD600=0.5），用于接種試驗。手術(shù)剪滅菌后，蘸取制備好的病菌懸浮液，將供試材料葉片葉尖剪去1～3 cm，每株植株接種3 片以上葉片，以感病水稻金剛30 作為對照，并做好標(biāo)記。接種21 d 左右當(dāng)參試材料的病情發(fā)展趨于穩(wěn)定時，量取病斑長度，鑒定供試植株的抗病性，同時進(jìn)行拍照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

整理測量得到的數(shù)據(jù)，抗性分級參考表3。根據(jù)對照材料金剛30 的發(fā)病等級，分析水稻白葉枯病菌的致病力，并按照抗性分級標(biāo)準(zhǔn)對供試植株進(jìn)行抗感分級，并利用Microsoft Excel 2010 進(jìn)行常規(guī)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用SPSS 19.0 進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析疣粒野生稻的抗菌譜，以及計算眾數(shù)值、最小值、最大值、求和值、均值和均值標(biāo)準(zhǔn)差，進(jìn)行疣粒野生稻對白葉枯病抗性的量化分析，其中眾數(shù)值是指一組數(shù)據(jù)中，出現(xiàn)次數(shù)最多的標(biāo)志值，即為最普遍、最常見的標(biāo)志值，可了解疣粒野生稻哪種抗病類型最普遍；最小值是指樣本中取值最小的數(shù)據(jù)、最大值是指樣本中取值最大的數(shù)據(jù)，根據(jù)最小值和最大值，可了解疣粒野生稻抗病類型的范圍；求和值是指一組數(shù)據(jù)所有取值的總和，均值表示某變量所有取值的集中趨勢或平均水平，根據(jù)求和值和均值，有利于挑選出抗性最優(yōu)的參試材料；均值標(biāo)準(zhǔn)差（Standard Error of Mean, SE.mean）是描述這些樣本均值與總體均值之間平均差異的統(tǒng)計量，可分析樣本間抗性差異程度。

表4 感病對照材料金剛30 接菌情況

圖1 36 份疣粒野生稻對白葉枯病菌抗性結(jié)果聚類分析

2 結(jié)果與分析

2.1 接種菌株致病力

根據(jù)感病對照材料金剛30 的病斑長度，對其進(jìn)行抗感等級劃分，由等級劃分判斷接種菌株致病力。接種后14～21 d，金剛30 的發(fā)病病情趨于穩(wěn)定。接種后21 d調(diào)查發(fā)現(xiàn)，金剛30 接種24 個白葉枯病菌的植株病斑長度都超過了20 cm（表4），葉片枯黃，而未接種病菌的植株葉片沒有發(fā)生任何變化，說明用于接種的白葉枯病病菌致病力沒有喪失，可用于接種參試材料。

2.2 云南疣粒野生稻對白葉枯病的抗性反應(yīng)

疣粒野生稻接種后第21 d，出現(xiàn)了3 類癥狀5 種病斑。第一類癥狀為急性癥狀，像開水燙傷一樣，病斑有1 種，呈灰綠色。第二類癥狀為典型癥狀，病斑有4種：第1 種呈黃白色，第2 種呈淡黃白色，這兩種病斑部分病菌都向下蔓延，病斑往往較長；第3 種呈黃色，少數(shù)病菌向下蔓延，病斑稍短；第4 種呈褐色，病菌不蔓延，病斑長度一般為0.00～0.30 cm。第三類無病癥，癥狀與接種清水一樣，只有一個割傷的傷口痕跡。參試的材料中大部分材料表現(xiàn)第二類第4 種病斑。量取病斑長度進(jìn)行統(tǒng)計分析，根據(jù)抗性反應(yīng)的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，將36 份云南疣粒野生稻對供試菌株的抗性反應(yīng)進(jìn)行分級，結(jié)果顯示，絕大部分野生稻對參試的24 個菌株的抗性表型基本都處于高抗到免疫程度，抗性表現(xiàn)良好（表5）。

2.3 云南疣粒野生稻對多菌系的抗性分析

通過系統(tǒng)聚類法分析36 份疣粒野生稻的抗譜，可分為抗譜寬和抗譜窄兩大類，除居群5 中的3 份材料抗譜較窄之外，其余為抗譜寬類型，即相對于OM5-1、OM5-2 和OM5-3，其余33 份參試疣粒野生稻抗譜都較寬（圖 1）。

根據(jù)量取的每份疣粒野生稻的病斑長度，統(tǒng)計參試材料分別對24 個菌株抗性反應(yīng)的病斑長度的眾數(shù)值、極小值、極大值、求和值、均值及均值標(biāo)準(zhǔn)差，統(tǒng)計結(jié)果見表6。從表6 可見，眾數(shù)值最大為1.00 cm（高抗），最小為 0.00 cm（免疫），除 OM4-3、OM6-1 和OM6-2 這3 份材料眾數(shù)值稍大外，大部分的參試植株眾數(shù)值都為0.00 cm，說明對24 個菌株的抗性表現(xiàn)免疫的材料最為普遍。從最小值和最大值可知，參試材料的抗病范圍有4 種，第1 種是最小值到最大值在0.00～1.40 cm 之間（I～HR），第 2 種在 0.00～3.00 cm 之間（I～R），第 3 種在 0.00～6.00 cm 之間（I～MR），第 4 種在0.00～9.00 cm 之間（I～MS），其中第 1 種類型最多（占比44.44%），第4 種類型最少（占比僅2.78%）。從均值可看出，OM5-1 抗性最差，其平均病斑最長；18 份參試材料的均值小于等于0.20 cm（I），抗性較好，進(jìn)一步從求和值可看出，這18 份材料中OM2-1、OM8-2 和OM7-3的抗性表現(xiàn)特別突出，它們對24 個菌株抗性反應(yīng)的病斑長度相加起來的總和小于等于1.50 cm，而OM2-1的求和值最小，僅為0.68 cm，說明OM2-1 的抗性最優(yōu)。從標(biāo)準(zhǔn)差可看出，OM2-1 的標(biāo)準(zhǔn)差亦最小，說明OM2-1 對24 個菌株的抗性反應(yīng)差異最小，結(jié)合表5 可知，該份材料除對XOO5 菌株表現(xiàn)為高抗之外，對其余菌株的抗性反應(yīng)都為免疫，表明OM2-1 的抗譜最為廣泛；反之，OM5-1 的標(biāo)準(zhǔn)差最大，說明 OM5-1 對 24 個菌株的抗性反應(yīng)差異最大，抗譜最窄。

表5 疣粒野生稻對白葉枯病菌的抗感反應(yīng)

綜合以上結(jié)果說明，參試的疣粒野生稻對白葉枯病菌的整體抗性水平較好，44.44%野生稻對參試菌株表型處于高抗到免疫水平，并且抗病類型為免疫的表型最為普遍；OM5-1、OM5-2 和 OM5-3 這 3 份材料抗譜較窄，尤其是OM5-1，其余33 份參試材料抗譜都較寬，特別是OM2-1。

表6 參試材料對24 個菌株抗性反應(yīng)的量化指標(biāo)

2.4 云南疣粒野生稻對單一菌株的抗性分析

統(tǒng)計疣粒野生稻對單一菌株不同抗性反應(yīng)類型的份數(shù)，建立柱狀圖（圖2）。從圖2 可知，無論對哪個單一菌株的抗性，I 型和HR 型材料所占比例均較大，除對XOO3 菌株HR 型材料比I 型材料多外，參試材料對其余單一菌株的抗性反應(yīng)以I 型材料最多，具體表現(xiàn)如下：I 型材料中，免疫XOO3 菌株的材料最少，免疫XOO23 菌株的材料最多；HR 型材料中，高抗XOO23菌株的材料最少，高抗XOO3 菌株的材料最多；R 型材料中，抗XOO3 菌株材料最多，有4 個單一菌株（XOO9、XOO14、XOO23 和 XOO24）對參試材料沒有 R類型的抗性反應(yīng)，即對于這4 個單一菌株的抗性反應(yīng)而言，R 型材料最少，為0 份；MR 型材料中，中抗XOO2 菌株稍多外，有一半以上的菌株對參試材料沒有MR 類型的抗性反應(yīng)；MS 型材料中，只有1 份參試材料對XOO8 菌株出現(xiàn)MS 類型的抗性反應(yīng)。以上結(jié)果表明，參試的云南疣粒野生稻，除有1 份中感XOO8菌株外，其余參試材料對各單一菌株抗性良好，大多數(shù)達(dá)到了高抗到免疫的程度。

圖2 疣粒野生稻對單一菌株抗性反應(yīng)

圖3 不同居群的疣粒野生稻對白葉枯病菌抗性結(jié)果聚類分析

2.5 不同居群的疣粒野生稻抗性比較分析

根據(jù)每個居群中3 份植株的病斑求取平均值，依據(jù)抗性反應(yīng)的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計12 個居群對參試菌株的抗性反應(yīng)，結(jié)果見表7。12 個居群對大多數(shù)菌株抗性都達(dá)到了高抗到免疫程度，根據(jù)其抗病特性，進(jìn)一步進(jìn)行系統(tǒng)聚類，如圖 3 所示，可分為 A、B、C 和 D 四大類，其中 OM5 為 A 類，OM6 為 B 類，OM4、OM10、OM11 和OM12 為 C 類，OM1、OM2、OM3、OM7、OM8 和 OM9 為D 類。結(jié)合表7 可知，A 類的抗譜最窄，此類型對參試的白葉枯病菌的抗性表現(xiàn)為中抗到免疫，B 類較A 類抗譜稍寬，對參試白葉枯病菌的抗性表現(xiàn)為抗到免疫，C 類較A 和B 類抗譜更寬，對參試白葉枯病菌的抗性表現(xiàn)為高抗到免疫，D 類抗性程度雖與C 類一致，但對更多的參試菌株具有免疫能力，此類抗譜較C 類更寬，然而在D 類中，OM7 免疫的菌株更多，即OM7 的抗譜最廣。

以上結(jié)果顯示，除OM5 中抗部分參試菌株外，其余居群都是抗參試菌株。從表7 可見，OM5 對XOO2、XOO5、XOO8 和 XOO16 菌株中抗，病斑都在 3.1 cm 以上，其中對XOO8 菌株抗性反應(yīng)的病斑最長，達(dá)4.28 cm，即XOO8 對OM5 具有一定的致病力。

野生稻植株往往是遺傳雜合體，個體之間也存在遺傳背景差異。本研究以標(biāo)準(zhǔn)差的大小作為考核指標(biāo)，評估接種同一菌株同一居群的3 份野生稻抗病能力的差異，標(biāo)準(zhǔn)差大，說明3 株間的病斑長度差異大，則抗病能力差異大，反之亦然。從表7 可看出，除OM3 外，其余疣粒野生稻居群對菌株抗性反應(yīng)的病斑長度標(biāo)準(zhǔn)差都有超過 1.0 的，其中，OM1、OM2、OM7、OM8、OM9、OM11 對1 個菌株的抗性反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)差超過1.0；OM4 和OM6 對 2 個菌株的標(biāo)準(zhǔn)差超過 1.0；OM5、OM10 和OM12 分別對10 個、7 個和6 個參試菌株的標(biāo)準(zhǔn)差超過1.0。由此說明，OM3 純合度高，植株之間抗病差異小，而其余11 個居群具有一定的雜合度，尤其OM5、OM10 和OM12，它們個體之間抗病能力差異較大，這3個居群雜合度相對較高。

綜上所述，云南12 個居群的疣粒野生稻對大多數(shù)白葉枯病菌抗性表現(xiàn)較好，除OM5 和OM6 之外，其余居群對參試的24 個菌株抗性都達(dá)到了高抗到免疫程度，特別是耿馬孟定（OM7）野生稻的抗性較其他居群好，景洪景訥（OM5）對在云南會澤流行的菌株（XOO8）抗性不強。同時，本研究也表明了大部分云南疣粒野生稻居群雜合度高，同一居群不同植株對白葉枯病的抗性差異大。

3 結(jié)論與討論

3.1 云南疣粒野生稻是寶貴的抗白葉枯病資源

根據(jù)分析結(jié)果可知，無論以植株為單位還是以居群為單位，大部分疣粒野生稻對白葉枯病高抗甚至免疫，說明云南大部分疣粒野生稻攜有豐富的優(yōu)良白葉枯病抗性基因。特別是OM2-1 在抗性和抗譜方面都較其它供試材料好，該材料可能含有1 個甚至多個高抗白葉枯病基因。這些豐富的基因資源對遺傳研究和品種改良具有重要的價值。本研究還發(fā)現(xiàn)，少部分疣粒野生稻中感個別菌株，這與程在全等[13]的研究結(jié)果一致，但據(jù)其報道的感病疣粒野生稻病斑長度最長為3.2

cm，若按本文的評價標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)為中抗，本文鑒定的最長平均病斑為6.85 cm，即到目前為止，未見相關(guān)文獻(xiàn)報道疣粒野生稻病斑特別長的，為此，筆者繼續(xù)同等條件種植培養(yǎng)管理，進(jìn)行接種，發(fā)現(xiàn)該份疣粒野生稻的病斑長度變化不大，推測溫室種植可能使疣粒野生稻自身的抗病能力下降，后續(xù)還需將該材料種植于室外，經(jīng)過多年種植之后再進(jìn)行接種鑒定，了解其是否感病。

表7 云南疣粒野生稻不同居群對24 個菌株的抗感反應(yīng)

3.2 評價疣粒野生稻抗性存在的問題

由于寄主與病原菌之間存在互作關(guān)系，互作關(guān)系為親和關(guān)系時，植物寄主表現(xiàn)感病，互作關(guān)系為非親和關(guān)系時，植物寄主表現(xiàn)抗病[14]。所以，評價寄主抗性時，應(yīng)采用不同的生理小種進(jìn)行鑒定，以便最大限度鑒定出抗相應(yīng)小種的抗源，同時能較清楚抗源的抗譜，為充分發(fā)掘抗病基因奠定基礎(chǔ)。野生稻含有優(yōu)良的抗性基因，為了篩選出廣譜抗性基因，本研究選用不同的生理小種評價疣粒野生稻的抗性，從中篩選出多份廣譜高抗白葉枯病抗源。寄主與病原菌之間還存在協(xié)同進(jìn)化的關(guān)系，當(dāng)一個新的抗病品種大量推廣后，病菌方面就有相應(yīng)的新小種產(chǎn)生和流行，并導(dǎo)致抗病品種的抗性“喪失”，因而監(jiān)測抗病品種的抗性也必須堅持不懈地進(jìn)行[15]。疣粒野生稻對過去的菌株處于高抗到免疫的程度，了解疣粒野生稻是否對最近幾年流行的小種具有抗性尤其重要。從本研究結(jié)果可見，值得慶幸的是，云南疣粒野生稻對目前在云南流行的小種基本都還處于非親和關(guān)系。

目前，疣粒野生稻的抗性評價標(biāo)準(zhǔn)存在爭議。章琦等[12]認(rèn)為，病斑占葉面積百分率較能反應(yīng)試材的實際抗性水平，然而疣粒野生稻同一株葉片長短差異較大，短的才5 cm 左右，長的有20 cm 左右，若病斑都是2 cm，對于短的葉片來說就是高感，對于長的葉片就是中抗，那很難判定其抗感性。程在全等[13]以病斑長度為3 cm 作為抗感界限評價疣粒野生稻抗性，而其文中的病斑最長才3.2 cm，就被認(rèn)為感病。所以，筆者認(rèn)為，疣粒野生稻抗性評價標(biāo)準(zhǔn)還是應(yīng)以國際分級標(biāo)準(zhǔn)更為合理，即病斑長度小于0.2 cm 為免疫，0.2～1.5 cm 為高抗，1.6～3.0 cm 為抗，3.1～6.0 cm 為中抗，6.1～9.0 cm 為中感，9.1～20.0 cm 為感，大于 20.0 cm 為高感，同時應(yīng)在對照品種的病情發(fā)展趨于穩(wěn)定時進(jìn)行調(diào)查。然后，根據(jù)相應(yīng)結(jié)果優(yōu)先選取高抗的材料用于遺傳研究和品種改良，從而最大限度避免以上存在的問題。

本研究發(fā)現(xiàn)，云南疣粒野生稻對白葉枯病的抗性與地理位置無關(guān)，同一居群的材料有高抗甚至免疫的材料，也存在抗性稍差的材料。其余野生稻，如普通野生稻也存在類似情況[12，16]，可能因為大多數(shù)的野生稻柱頭大而外露，異交結(jié)實率較高，造成同一地點采集的材料并不是1 個抗性純合體[12]。這提示我們，在野生稻接種鑒定時，同一居群應(yīng)選取3 株以上進(jìn)行考察，或首先應(yīng)對參試材料進(jìn)行親緣關(guān)系分析，分類之后再開展抗性鑒定試驗，從而充分的發(fā)掘出新的抗源。