肝細(xì)胞癌超聲造影灌注參數(shù)與ANGPTL4表達(dá)水平相關(guān)性的初步研究

吳林德,浙江省德清縣人民醫(yī)院超聲科 浙江省湖州市 313200

蒿業(yè)紅,徐珊珊,浙江蕭山醫(yī)院超聲科 浙江省杭州市 311200

方苑仲,杭州市余杭區(qū)婦幼保健院檢驗(yàn)科 浙江省杭州市 311100

0 引言

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一種發(fā)病率較高的肝臟惡性腫瘤[1].HCC惡性生物學(xué)行為與其微血管新生狀態(tài)密切相關(guān),深入研究其微血管生成有著重要臨床意義[2].血管生成素樣蛋白4(angiopoietin like 4,ANGPTL4)作為一種血管生成素樣蛋白家族中的分泌型糖蛋白,其在促進(jìn)腫瘤血管生成、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)中發(fā)揮著重要作用[3],而目前其評(píng)估方法需采用具有創(chuàng)傷性的病理學(xué)檢查.本研究運(yùn)用超聲造影(contrastenhanced ultrasound,CEUS)定量分析HCC的血流灌注參數(shù),探討其與ANGPTL4表達(dá)水平的相關(guān)性,旨在探討CEUS在評(píng)估活體HCC組織的ANGPTL4表達(dá)水平及血管生成中的價(jià)值.

1 材料和方法

1.1 材料 選擇2018-09/2019-12期間,在浙江蕭山醫(yī)院行手術(shù)切除的84例HCC患者作為研究對(duì)象.納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均病理證實(shí)為HCC;(2)術(shù)前均未曾行任何形式放化療及藥物治療;(3)無(wú)合并其它惡性腫瘤;(4)患者能配合CEUS檢查.其中男68例,女16例,年齡29-70歲,平均年齡50.83歲±11.02歲.病灶共計(jì)84個(gè),直徑1.87-6.19 cm,平均直徑4.23 cm±1.10 cm.根據(jù)ANGPTL4表達(dá)結(jié)果分為：ANGPTL4陽(yáng)性表達(dá)組,48例,男38例,女10例,年齡29-70歲,平均年齡51.53歲±10.47歲,直徑2.11-6.19 cm,平均直徑4.29 cm±1.09 cm,其中高分化12例、中分化10例、低分化26例;ANGPTL4陰性表達(dá)組,36例,男30例,女6例,年齡32-67歲,平均49.90歲±11.80歲,直徑1.87-5.53 cm,平均4.15 cm±1.12 cm,其中高分化9例、中分化8例、低分化19例.兩組間年齡(t=0.666,P=0.507)、性別(χ2=0.232,P=0.630)、直徑(t=0.568,P=0.571),病理分級(jí)(χ2=0.026,P=0.987)比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05).

1.2 方法

1.2.1 CEUS檢查：CEUS采用Acuson S2000超聲診斷儀,配有4C1探頭(頻率4.0 MHz),隨機(jī)配備對(duì)比脈沖系列成像技術(shù).造影劑采用聲諾維(sono Vue),按照說(shuō)明書(shū)配備成混懸液.CEUS由一名高年資且經(jīng)驗(yàn)豐富的超聲醫(yī)師進(jìn)行操作分析.首先對(duì)病灶進(jìn)行常規(guī)超聲檢查,明確腫瘤位置、大小、內(nèi)部回聲、邊界、血供等情況.啟動(dòng)CEUS,經(jīng)肘部淺靜脈推注造影劑2.4 mL,同步計(jì)時(shí),觀(guān)察并存儲(chǔ)造影全過(guò)程.選取病灶區(qū)域作為感興趣區(qū),繪制時(shí)間-強(qiáng)度曲線(xiàn),獲得病灶的增強(qiáng)強(qiáng)度、達(dá)峰時(shí)間(圖1).

1.2.2 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子水平、ANGPTL4、微血管密度測(cè)定：ANGPTL4表達(dá)測(cè)定：術(shù)后組織標(biāo)本采用兔抗人ANGPTL4 多克隆抗體(美國(guó)Sigma公司),滴度為1：200,按照SABC法常規(guī)步驟行免疫組化.隨機(jī)選取每張切中的5個(gè)視野,根據(jù)視野中陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：0分,陽(yáng)性細(xì)胞＜5%;1分,5%-25%;2分,25%-50%;3分,≥50%.染色強(qiáng)弱評(píng)分：僅細(xì)胞核染藍(lán)色為陰性;胞核、胞漿以及胞膜染成棕黃色為陽(yáng)性.0分,陰性;1分,弱陽(yáng)性;2分,陽(yáng)性;3分,強(qiáng)陽(yáng)性.ANGPTL4 表達(dá)結(jié)果判定：兩項(xiàng)之和≤3分判定為陰性表達(dá);＞3分判定為陽(yáng)性表達(dá).

微血管密度(microvessel density,MVD)測(cè)定：術(shù)后組織標(biāo)本經(jīng)甲醛固定,石蠟包埋切片,采用ElivisionTM兩步法免疫組化染色.參照Weidner等[4]的校正方法測(cè)定MVD.

血清血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)水平測(cè)定：清晨,空腹?fàn)顟B(tài),采集患者5 mL肘部靜脈血,3000 r/min離心15 min分離血清,-20 ℃冰箱存儲(chǔ).按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)進(jìn)行操作,測(cè)定血清VEGF水平.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù).計(jì)量資料以mean±SD表示,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用方差分析;計(jì)數(shù)資料以(%)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn).相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析.P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 兩組間CEUS參數(shù)比較 ANGPTL4陽(yáng)性表達(dá)組病灶的增強(qiáng)強(qiáng)度(enhancement intensity,EI)明顯高于ANGPTL4陰性表達(dá)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);ANGPTL4陽(yáng)性表達(dá)組病灶的達(dá)峰時(shí)間(peak to time,TTP)明顯短于ANGPTL4陰性表達(dá)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(表1).高分化HCC的EI低于中分化HCC及低分化HCC,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);中分化HCC的EI低于低分化HCC,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);高分化HCC的TTP長(zhǎng)于中分化HCC及低分化HCC,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);中分化HCC的TTP長(zhǎng)于低分化HCC,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(表2).

2.2 兩組間ANGPTL4、VEGF、MVD水平比較ANGPTL4陽(yáng)性表達(dá)組的ANGPTL4、MVD及VEGF水平明顯高于ANGPTL4陰性表達(dá)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(表3).高分化HCC的ANGPTL4、MVD及VEGF水平低于中分化HCC及低分化HCC,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);中分化HCC的ANGPTL4、MVD及VEGF水平低于低分化HCC,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(表4).

2.3 CEUS參數(shù)與ANGPTL4表達(dá)水平的相關(guān)性 HCC的EI與ANGPTL4表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.753,R2=567,P＜0.05),HCC的TTP與ANGPTL4表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.730,R2=0.532,P＜0.05)(圖2).

3 討論

HCC為富血供肝臟惡性腫瘤,其發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)與血管新生密切相關(guān)[5].血管新生是一系列在多因子調(diào)控作用下發(fā)生的有序而復(fù)雜的生物過(guò)程.因此,全面了解HCC血管新生狀態(tài)對(duì)于臨床制定治療方案,評(píng)估預(yù)后有著重要意義.

ANGPTL4作為一種血管生成素樣蛋白家族中的分泌型糖蛋白,不僅參與葡萄糖代謝以及脂質(zhì)代謝,而且在缺氧誘導(dǎo)因子作用下表達(dá)上調(diào),促進(jìn)腫瘤血管新生、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)以及細(xì)胞分化[6].MVD常被應(yīng)用于評(píng)估腫瘤的微小血管增殖狀態(tài),是目前臨床評(píng)估腫瘤血管生成的“金標(biāo)準(zhǔn)”,在惡性腫瘤中MVD數(shù)值越高,腫瘤侵襲能力越強(qiáng)、預(yù)后越差[7].VEGF 即是目前所知的特異性最高、作用最強(qiáng)的腫瘤血管生成正向調(diào)節(jié)因子.本研究結(jié)果中,ANGPTL4陽(yáng)性表達(dá)組的ANGPTL4、MVD及VEGF水平明顯高于ANGPTL4陰性表達(dá)組(P＜0.05).證實(shí)了隨著HCC組織中ANGPTL4表達(dá)上調(diào),VEGF合成分泌增加,HCC微小血管生成能力增強(qiáng),促使HCC內(nèi)微血管大量增殖,為其提供生長(zhǎng)發(fā)展所需的血供及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì).

表1 兩組間超聲造影參數(shù)比較

表2 不同病理分級(jí)肝細(xì)胞癌超聲造影參數(shù)比較

表3 兩組間血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、ANGPTL4、微血管密度水平比較

表4 不同病理分級(jí)肝細(xì)胞癌間血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、ANGPTL4、微血管密度水平比較

圖1 肝細(xì)胞癌的時(shí)間-強(qiáng)度曲線(xiàn)示意圖.

圖2 散點(diǎn)圖.A：增強(qiáng)強(qiáng)度與ANGPTL4表達(dá)水平;B：達(dá)峰時(shí)間與ANGPTL4表達(dá)水平.ANGPTL4：血管生成素樣蛋白4;EI：增強(qiáng)強(qiáng)度;TTP：達(dá)峰時(shí)間.

目前,臨床評(píng)估ANGPTL4表達(dá)率以及表達(dá)強(qiáng)度需通過(guò)獲取組織標(biāo)本行病理學(xué)檢查實(shí)現(xiàn).該方法存在創(chuàng)傷性、準(zhǔn)確取材依賴(lài)性等缺點(diǎn),應(yīng)用受到一定限制.隨著超聲技術(shù)的不斷發(fā)展,CEUS為腫瘤微循環(huán)血流灌注檢測(cè)開(kāi)辟了一條全新途徑.CEUS時(shí)所采用的新型造影劑Sono Vue不會(huì)滲透至細(xì)胞間隙,具有血池示蹤劑的藥代動(dòng)力學(xué)特性[8].CEUS能通過(guò)時(shí)間-強(qiáng)度曲線(xiàn)定量分析目標(biāo)組織的血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài)變化.本研究結(jié)果中,ANGPTL4陽(yáng)性表達(dá)組病灶的EI顯高于ANGPTL4陰性表達(dá)組(P＜0.05);而ANGPTL4陽(yáng)性表達(dá)組的TTP明顯短于ANGPTL4陰性表達(dá)組.說(shuō)明ANGPTL4陽(yáng)性表達(dá)的HCC組織能在更短的時(shí)間內(nèi)獲得更充足的血流灌注量.原因可能是[9,10]：ANGPTL4陽(yáng)性表達(dá)HCC組織通過(guò)ANGPTL4、VEGF的表達(dá)上調(diào)及分泌,誘導(dǎo)組織生成大量微小血管,使單位體積內(nèi)微小血管數(shù)量增多,血流灌注量增大,增強(qiáng)強(qiáng)度增大.同時(shí),由于ANGPTL4陽(yáng)性表達(dá)HCC組織內(nèi)存在的大量新生微小血管具有基底膜發(fā)育不全,血管平滑肌缺失、動(dòng)靜脈短路等特點(diǎn),使微小血管阻力進(jìn)一步下降,血流灌注速度增加,達(dá)峰時(shí)間縮短.本研究結(jié)果中,HCC的EI與ANGPTL4表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.753,P＜0.05),而TTP與ANGPTL4表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.730,P＜0.05).提示CEUS可在一定程度上反映ANGPTL4表達(dá)水平狀態(tài),即EI越大或TTP越短,ANGPTL4表達(dá)水平越高.

本研究結(jié)果顯示,高分化HCC的EI、ANGPTL4、MVD及VEGF水平低于中分化HCC及低分化HCC,且中分化HCC的EI、ANGPTL4、MVD及VEGF水平低于低分化HCC(P＜0.05),而高分化HCC的TTP長(zhǎng)于中分化HCC及低分化HCC,且中分化HCC的TTP長(zhǎng)于低分化HCC,(P＜0.05).提示隨著HCC惡性程度增加,其微小血管生成狀態(tài)越旺盛,其EI、ANGPTL4、MVD及VEGF水平呈上升趨勢(shì),而TTP呈下降趨勢(shì).證實(shí)了HCC惡性程度與其血管新生狀態(tài)密切相關(guān).

總之,HCC的CEUS灌注參數(shù)與ANGPTL4表達(dá)水平具有一定相關(guān)性,能無(wú)創(chuàng)性評(píng)估活體HCC組織的ANGPTL4表達(dá)水平情況,間接反映其血管新生狀態(tài).

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

準(zhǔn)確評(píng)估肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)組織的血管生成素樣蛋白4(angiopoietin like 4,ANGPTL4)表達(dá)水平,有助于臨床診治及預(yù)后評(píng)估.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

運(yùn)用超聲造影(contrast-enhanced ultrasound,CEUS)定量分析HCC的血流灌注參數(shù),探討其與ANGPTL4表達(dá)水平的相關(guān)性,以期為臨床評(píng)估活體HCC血管新生狀態(tài)提供參考.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

本篇論文研究的主要目標(biāo)是探討HCC的血流灌注參數(shù)與ANGPTL4表達(dá)水平的相關(guān)性.結(jié)果顯示CEUS能客觀(guān)反映HCC微循環(huán)特點(diǎn),其血流參數(shù)增強(qiáng)強(qiáng)度(enhancement intensity,EI)和達(dá)峰時(shí)間(peak to time,TTP)與ANGPTL4表達(dá)水平具有較好相關(guān)性,可間接反映HCC血管新生狀態(tài).

實(shí)驗(yàn)方法

本篇論文為了達(dá)到目標(biāo)運(yùn)用CEUS觀(guān)察HCC微循環(huán)血供特征.CEUS能實(shí)時(shí)顯示腫瘤組織的微循環(huán)血流灌注狀態(tài),從而間接反映其血管新生情況.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本篇論文研究達(dá)到了實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo),研究結(jié)果顯示ANGPTL4陽(yáng)性表達(dá)組病灶的EI、MVD、VEGF水平明顯高于ANGPTL4陰性表達(dá)組,而TTP明顯短于ANGPTL4陰性表達(dá)組(P＜0.05);HCC的EI與ANGPTL4表達(dá)水平呈正相關(guān),而TTP與ANGPTL4表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān).本研究結(jié)果說(shuō)明CEUS能敏感反映HCC血流灌注狀態(tài),間接反映ANGPTL4表達(dá)情況,有助于臨床評(píng)估活體HCC的血管新生情況.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

HCC的微循環(huán)血流狀態(tài)與ANGPTL4、MVD及VEGF水平密切相關(guān).CEUS作為一種無(wú)創(chuàng)性的微循環(huán)血流監(jiān)測(cè)手段,不僅有助于腫瘤良惡性質(zhì)的鑒別診斷,而且能動(dòng)態(tài)觀(guān)察以及定量分析腫瘤的微循環(huán)灌注特征,間接反映腫瘤血管新生情況.本研究運(yùn)用CEUS分析HCC微循環(huán)灌注特征,探討其與ANGPTL4表達(dá)水平的相關(guān)性,以期間接反映HCC血管新生情況.本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),HCC的EI、TTP均與ANGPTL4表達(dá)水平具有良好相關(guān)性.證實(shí)了CEUS可用于無(wú)創(chuàng)性評(píng)估活體HCC的ANGPTL4表達(dá)水平,進(jìn)而間接評(píng)估活體HCC血管新生情況.

展望前景

HCC病灶位置較深時(shí),不利于CEUS分析評(píng)估,而HCC病灶靠近膈頂或靠近胃腸道時(shí),易受氣體干擾而影響CEUS評(píng)估.未來(lái)研究的方向?yàn)镃EUS在HCC抗血管生成治療中的臨床應(yīng)用價(jià)值,最佳方法是運(yùn)用動(dòng)態(tài)三維CEUS分析HCC的微循環(huán)血流狀態(tài).