miR-10b通過(guò)抑制KLF4表達(dá)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥

易弼順,馬柏強(qiáng),李冰震,田鋒,麗水市人民醫(yī)院創(chuàng)傷/急腹癥、疝外科 浙江省麗水市 323000

0 引言

胃癌(gastric cancer,GC)是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)腫瘤.早期GC癥狀與一些胃病(如：胃炎和胃潰瘍等)類(lèi)似,容易被忽視,多數(shù)患者確診時(shí)已是中晚期GC[1].對(duì)GC化療主要是以鉑類(lèi)為主的聯(lián)合化療方案,但是藥物化療常出現(xiàn)耐藥,導(dǎo)致治療效果不佳[2].

miRNAs可參與調(diào)控胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、化療耐藥和代謝等眾多生理和病理過(guò)程[3-5].而,大多數(shù)miRNAs的生物學(xué)功能尚未完全闡明,且多數(shù)miRNAs在調(diào)節(jié)化療耐藥性中的作用以及其中涉及的分子機(jī)制未被報(bào)道.順鉑(cisplatin,DDP)是一種臨床上常用的化療藥物,可對(duì)多種腫瘤(如：肺癌和食管癌等)發(fā)揮治療效應(yīng)[6,7].盡管DDP通常在初始的治療中表現(xiàn)出明顯的療效,但是由于耐藥性的產(chǎn)生,則不可避免地導(dǎo)致后續(xù)化療效果不理想.因此克服DDP的化療抗性仍然是當(dāng)前面臨的重大挑戰(zhàn).已有研究[8,9]報(bào)道,miR-10b能促進(jìn)食管癌和鼻咽癌細(xì)胞DDP耐藥.另外,多篇文獻(xiàn)[9-11]顯示,miR-10b能通過(guò)下調(diào)Krueppel樣因子4(Krueppel-like factor 4,KLF4)表達(dá)來(lái)促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移與侵襲.據(jù)報(bào)道[12,13],miR-10b在GC組織中高表達(dá),且其與腫瘤分期和預(yù)后不良呈正相關(guān);而在GC中其與DDP化療敏感性的關(guān)系并不清楚.因此本研究通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞內(nèi)分子水平的改變,推斷出GC可能的DDP耐藥產(chǎn)生機(jī)制;并試圖探究miR-10b與KLF4的相互作用在GC細(xì)胞對(duì)DDP耐藥性的影響,為臨床治療提供新思路.

1 材料和方法

1.1 材料 GC細(xì)胞SGC-7901和MGC-803(上海雅吉生物科技有限公司).DDP和MTT試劑盒(Sigma,美國(guó));青霉素-鏈霉素混合溶液、RPMI-1640培養(yǎng)基(Thermo Fisher Scientific,美國(guó));ECL試劑(Millipore,美國(guó));BCA蛋白測(cè)定試劑盒和Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司,中國(guó))KLF4抗體和II 抗(Abcam,美國(guó));MiRNeasy mini試劑盒、miScript II RT試劑盒和miScript SYBR Green PCR試劑盒(Qiagen,德國(guó)).酶標(biāo)儀(Bio-Rad,美國(guó));流式細(xì)胞儀(Bio-Rad,美國(guó));ABI StepOne TM實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems,美國(guó)).

1.2 方法

1.2.1 GC的DDP耐藥細(xì)胞系構(gòu)建：以SGC-7901和MGC-803為親本細(xì)胞,誘導(dǎo)DDP耐藥細(xì)胞.首先用MTT法測(cè)定DDP對(duì)GC親本細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度為7.5 μmol/L和8.4 μmol/L.首次加藥濃度為2 μmol/L,每48 h換液一次,并反復(fù)加入同種濃度DDP,待細(xì)胞在含DDP濃度的培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長(zhǎng)時(shí),再按照2、3、5、8、12和16 μmol/L DDP濃度遞增方法,直到細(xì)胞可在16 μmol/L的DDP濃度中穩(wěn)定生長(zhǎng),至此建立SGC-7901/DDP和MGC-803/DDP細(xì)胞.在后續(xù)實(shí)驗(yàn)前,SGC-7901/DDP和MGC-803/DDP細(xì)胞在無(wú)DDP條件下培養(yǎng)2 wk.

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：SGC-7901、MGC-803、SGC-7901/DDP和MGC-803/DDP細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基,置于37 ℃、飽和濕度、5% CO2的恒溫箱中培養(yǎng),培養(yǎng)基中添加10% FBS及青霉素-鏈霉素混合溶液(含青霉素、鏈霉素各100 U/mL).培養(yǎng)基每周更換2-3次,用0.25%的胰蛋白酶消化傳代,傳代比1：4.

1.2.3 慢病毒感染：miR-10b過(guò)表達(dá)的慢病毒載體(lentivirus-miR-10b,miR-10b)、陰性對(duì)照l(shuí)entivirus-miRNC(NC)、lentivirus-KLF4(KLF4)以及慢病毒空載體lentivirus-Vector(Vector)由廣州銳博生物科技公司合成,其中NC為亂碼序列,與人已知的miRNAs序列無(wú)同源性,作為miR-10b的陰性對(duì)照;Vector作為KLF4的陰性對(duì)照.

分別將SGC-7901和MGC-803細(xì)胞以2×104細(xì)胞/孔接種在24孔板上,然后10 MOI miR-10b或NC感染SGC-7901和MGC-803細(xì)胞48 h,構(gòu)建miR-10b組和NC組.

取miR-10b組或NC組的細(xì)胞,再分別感染10 MOI Vector或KLF4 48 h,構(gòu)建NC+Vector組、miR-10b+Vector組和miR-10b+KLF4組.

1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力：分別將SGC-7901、MGC-803、SGC-7901/DDP和MGC-803/DDP細(xì)胞和已經(jīng)病毒感染的細(xì)胞以1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種在96孔板上,然后采用不同濃度(0、10、20、30、40 μmol/L)DDP處理24 h.吸除培養(yǎng)基后,然后在37 ℃下與100 μL 5 mg/mL MTT一起孵育3 h,棄孔內(nèi)上清液.隨后,在室溫下加入400 μL DMSO并搖動(dòng)15 min.通過(guò)酶標(biāo)儀讀取590 nm處各孔吸光度.

1.2.5 細(xì)胞凋亡分析：分別取已感染的細(xì)胞,以2×104個(gè)細(xì)胞/孔接種在24孔板上,然后采用20 μmol/L DDP處理24 h.然后收集細(xì)胞,按照Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟,用碘化丙錠(propidium iodide,PI)和膜聯(lián)蛋白V(annexin V)-FITC對(duì)細(xì)胞共染色.通過(guò)流式細(xì)胞儀分選計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞.

1.2.6 RT-qPCR分析：對(duì)于miR-10b分析采用使用MiRNeasy mini試劑盒按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行分析.對(duì)于KLF4 mRNA檢測(cè),采用TRIzol試劑盒提取總RNA,測(cè)定RNA濃度后,將(1 μg)的總RNA轉(zhuǎn)化為cDNA.將稀釋的cDNA與含有通用引物和SYBR Green染料的miScript SYBR Green PCR Kit混合,并加入含有凍干引物于PCR板的孔中.

miR-10b的正向引物為5’-ACATCATACCCTGTAGAACCGAA-3’,反向引物為5’-GATTGGATGT T C T C C A C A G T C T C-3’;K L F4的正向引物為5’-CGAACCCACACAGGTGAGAA-3’,反向引物為5’-TACGGTAGTGCCTGGTCAGTTC-3’;U6的正向引物為5’-GCTTCGGCACATATACTAAAAT-3’,反向引物為5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’;GAPDH的正向引物為5’-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3’,反向引物為5’-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3’.用ABI StepOne TM實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè),并測(cè)定的Ct值,miR-10b以U6為內(nèi)參,KLF4以GAPDH為內(nèi)參,采用2-△△Ct法分析基因的相對(duì)表達(dá)量.

1.2.7 蛋白質(zhì)免疫印跡：細(xì)胞以4×105個(gè)/孔的密度接種在6孔培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)24 h后,用1 mL PBS/孔洗滌細(xì)胞,并通過(guò)胰蛋白酶消化收集細(xì)胞.在冰上,將細(xì)胞在RIPA裂解緩沖液中孵育30 min,然后在4 ℃下1.2×105g離心30 min收集總蛋白.使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度.隨后,取50 μg總蛋白使用8%-15%十二烷基SDS-PAGE凝膠電泳,并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上.將膜用含5%脫脂奶粉的TBST中封閉2 h,并孵育Ⅰ抗(KLF4抗體,1：2000稀釋)4 ℃過(guò)夜.洗滌膜3次,并與Ⅱ抗一起溫育,洗滌膜3次后用ECL試劑顯影.用凝膠成像設(shè)備對(duì)膜進(jìn)行成像,并用Image J軟件進(jìn)行半定量分析.

1.2.8 異種移植腫瘤模型：6周齡SPF級(jí)雄性裸鼠(18-21 g)購(gòu)自溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(浙)2015-0001],飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心S P F級(jí)動(dòng)物房[SYXK(浙)2018-0017].12只小鼠隨機(jī)分成兩組,每組6只,分別為陰性對(duì)照(NC)組和miR-10b過(guò)表達(dá)組.將NC組或miR-10b組的SGC-7901細(xì)胞(3×106個(gè)細(xì)胞)重懸于100 μL培養(yǎng)基中,并以體積比1：1的比例與基質(zhì)膠混合,然后皮下注射到每只小鼠的右腹皮下.在第2周末,觀察小鼠成瘤情況,其中miR-10b組有一只小鼠未成瘤,剔除本研究.第3周起,每日腹腔注射5 mg/kg(體重)DDP 1次,持續(xù)4 wk.在第6周末,用斷頸法處死小鼠,解剖并取出腫瘤測(cè)量稱重.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)表示為mean±SD.使用Graphpad Prism 7.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析.兩組數(shù)據(jù)的比較行雙尾t檢驗(yàn),多組數(shù)據(jù)的兩兩比較行單因素方差分析后Bonfferoni檢驗(yàn).P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 GC的DDP耐藥細(xì)胞鑒定 MTT結(jié)果顯示(圖1),不同濃度DDP處理后,與SGC-7901或MGC-803細(xì)胞比較,SGC-7901/DDP和MGC-803/DDP細(xì)胞的細(xì)胞活力降低較慢(P＜0.01).以上結(jié)果表明構(gòu)建的SGC-7901/DDP和MGC-803/DDP細(xì)胞株具有DDP耐藥性.

2.2 GC的DDP耐藥細(xì)胞中miR-10b表達(dá)增加 圖2結(jié)果顯示,與SGC-7901或MGC-803細(xì)胞比較,SGC-7901/DDP和MGC-803/DDP細(xì)胞中miR-10b的表達(dá)顯著增加(P＜0.01).提示,miR-10b可能是GC細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的重要分子.

2.3 過(guò)表達(dá)miR-10b導(dǎo)致GC細(xì)胞對(duì)DDP耐藥 對(duì)GC細(xì)胞進(jìn)行慢病毒感染miR-10b或miR-NC,結(jié)果如圖3所示,與NC組相比,miR-10b組的SGC-7901細(xì)胞(圖3A)和MGC-803(圖3B)中miR-10b表達(dá)顯著增加(P＜0.01),結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)miR-10b的細(xì)胞構(gòu)建成功.對(duì)已過(guò)表達(dá)miR-10b的GC細(xì)胞進(jìn)行不同濃度的DDP處理,再進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),與NC組比較,miR-10b組的SGC-7901細(xì)胞(圖3C)和MGC-803(圖3D)細(xì)胞活力顯著增加(P＜0.01).隨后,本研究檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-10b對(duì)20 μmol/L DDP誘導(dǎo)的凋亡的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與NC+20 μmol/L DDP組比較,miR-10b+20 μmol/L DDP組的SGC-7901細(xì)胞(圖3E、F)和MGC-803(圖3E、G)細(xì)胞凋亡比例顯著降低(P＜0.01).

2.4 過(guò)表達(dá)miR-10b抑制體內(nèi)DDP化療效果 用NC組或miR-10b組的SGC-7901細(xì)胞構(gòu)建異位GC移植瘤模型,并使用DDP進(jìn)行化療.結(jié)果顯示,與NC+DDP組相比,miR-10b+DDP組SGC-7901細(xì)胞形成的腫瘤明顯變大(圖4A),腫瘤質(zhì)量顯著增加(圖4B)(P＜0.01).表明miR-10b高表達(dá)促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞產(chǎn)生DDP耐藥性.

2.5 上調(diào)KLF4的表達(dá)可以抑制miR-10b介導(dǎo)的DDP耐藥 首先分析KLF4在GC的DDP耐藥細(xì)胞中表達(dá),結(jié)果(圖5A-F)顯示,與SGC-7901或MGC-803細(xì)胞比較,SGC-7901/DDP和MGC-803/DDP細(xì)胞中KLF4的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低(P＜0.01).進(jìn)一步對(duì)GC細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-10b,檢測(cè)KLF4的表達(dá),結(jié)果顯示,與NC組比較,在miR-10b組的SGC-7901細(xì)胞中KLF4的mRNA(圖5G)和蛋白(圖5H、I)表達(dá)均顯著降低(P＜0.01);在MGC-803細(xì)胞中也見(jiàn)類(lèi)似的結(jié)果(圖5J-L).

構(gòu)建miR-10b和KLF4共過(guò)表達(dá)的GC細(xì)胞,Western blot結(jié)果(圖6A-D)顯示,與miR-10b+Vector組比較,miR-10b+KLF4組的SGC-7901和MGC-803細(xì)胞中KLF4蛋白表達(dá)均顯著增加(P＜0.01).用不同濃度的DDP處理細(xì)胞,MTT結(jié)果顯示,與miR-10b+Vector組比較,miR-10b+KLF4組SGC-7901細(xì)胞(圖6E)和MGC-803細(xì)胞的細(xì)胞活力顯著增加(P＜0.05).提示,miR-10b可能通過(guò)抑制KLF4的表達(dá)導(dǎo)致GC細(xì)胞對(duì)DDP耐藥.

3 討論

GC常以鉑類(lèi)藥物為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方式進(jìn)行化療,但化療能產(chǎn)生耐藥性[2].而探索GC化療耐藥產(chǎn)生的機(jī)制,有助于提高今后對(duì)GC的化療效果.

miRNA是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼的RNA小分子,可通過(guò)堿基互補(bǔ)結(jié)合多個(gè)靶mRNA的3′UTR區(qū)調(diào)控靶基因mRNA表達(dá),從而在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控生物學(xué)功能[5].miR-10b作為miRNA家族中的成員之一,定位于2號(hào)染色體短臂3區(qū)l帶l亞帶的HOXD4與HOXD8基因之間[14].除了作用于翻譯抑制外,研究[15]發(fā)現(xiàn)miR-10結(jié)合含有末端寡嘧啶基序的一組轉(zhuǎn)錄物并誘導(dǎo)它們的翻譯,從而為miRNA家族添加新功能.miR-10b在乳腺癌中表達(dá)下調(diào)[16],其下調(diào)能促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展;而在GC[12,13]、食管癌[8]和黑色素瘤[17]等惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào),且其上調(diào)增強(qiáng)上述腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲[9-11].這體現(xiàn)了miR-10b在不同腫瘤中表達(dá)和功能的多樣性.另外,miR-10b能促進(jìn)食管癌和鼻咽癌細(xì)胞DDP耐藥[8,9],而其在GC中與DDP化療敏感性的關(guān)系并不清楚.本研究發(fā)現(xiàn)miR-10b過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致體外GC細(xì)胞DDP耐藥性的產(chǎn)生,且體內(nèi)SGC-7901細(xì)胞移植瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)了這一現(xiàn)象.KLF4在機(jī)體廣泛表達(dá),主要表達(dá)于消化道、口腔、食管上皮、皮膚表皮、血管內(nèi)皮和胸腺上皮細(xì)胞中[18].據(jù)報(bào)道[19],敲除KLF4可促進(jìn)GC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移,而過(guò)表達(dá)KLF4則可抑制轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn),促進(jìn)細(xì)胞凋亡.在線靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)顯示miR-10b在KLF4的mRNA在295-301位點(diǎn)存在結(jié)合區(qū)域.且已有文獻(xiàn)[10,20]指出KLF4是miR-10b的靶基因之一.在多種腫瘤細(xì)胞中,敲除KLF4能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的多種化療藥物耐藥,而過(guò)表達(dá)KLF4能增強(qiáng)化療藥物敏感性[21,22].本研究發(fā)現(xiàn),DDP耐藥的GC細(xì)胞(miR-10b過(guò)表達(dá)的GC細(xì)胞)中KLF4也處于低表達(dá)狀態(tài),通過(guò)慢病毒過(guò)表達(dá)KLF4,發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)KLF4能部分逆轉(zhuǎn)miR-10b誘導(dǎo)的DDP耐藥.

圖1 SGC-7901/DDP和MGC-803/DDP細(xì)胞的順鉑耐藥性鑒定.A、B：分別用0、10、20、30和40 μmol/L DDP處理細(xì)胞24 h后,MTT法檢測(cè)SGC-7901/DDP(A)和MGC-803/DDP(B)細(xì)胞的細(xì)胞活力.n=4,bP＜0.01 vs SGC-7901細(xì)胞;dP＜0.01 vs MGC-803細(xì)胞.DDP：順鉑.

圖2 miR-10b在胃癌順鉑耐藥細(xì)胞中高表達(dá).A、B：RT-qPCR檢測(cè)SGC-7901/DDP(A)和MGC-803/DDP(B)細(xì)胞中miR-10b表達(dá).n=4,bP＜0.01 vs SGC-7901細(xì)胞;dP＜0.01 vs MGC-803細(xì)胞.DDP：順鉑.

綜上所述,本研究表明上調(diào)miR-10b會(huì)使GC細(xì)胞對(duì)DDP產(chǎn)生耐藥性,并且這一作用可能是通過(guò)下調(diào)KLF4的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的,通過(guò)上調(diào)KLF4的表達(dá)能在一定程度上降低GC細(xì)胞對(duì)DDP的耐藥性.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

胃癌(gastric cancer,GC)在化療程序中會(huì)產(chǎn)生獲得性化療耐藥,最終導(dǎo)致化療失敗.已有研究顯示miRNAs可參與調(diào)節(jié)GC的化療耐藥,而miRNAs數(shù)量眾多,多數(shù)miRNAs在調(diào)節(jié)GC化療耐藥中的作用尚未被鑒定.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

上調(diào)miR-10b能增加食管癌和鼻咽癌細(xì)胞對(duì)順鉑(cisplatin,DDP)的耐藥性.miR-10b在GC中高表達(dá).而目前尚無(wú)關(guān)于GC中miR-10b與DDP化療敏感性的關(guān)系的報(bào)道.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

研究miR-10b與GC細(xì)胞DDP化療敏感性的關(guān)系,并探討其中的機(jī)制.

實(shí)驗(yàn)方法

比較GC細(xì)胞與DDP耐藥細(xì)胞中miR-10b的表達(dá)差異.觀察過(guò)表達(dá)miR-10b對(duì)體外和體內(nèi)DDP化療敏感性的影響.分析過(guò)表達(dá)miR-10b對(duì)KLF4表達(dá)的影響,并通過(guò)修復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-10b、KLF4與DDP敏感性三者之間的內(nèi)在聯(lián)系.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

miR-10b在GC的DDP耐藥細(xì)胞中高表達(dá).上調(diào)GC細(xì)胞中miR-10b表達(dá)能導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)DDP敏感性降低,并下調(diào)KLF4表達(dá).上調(diào)KLF4能廢除過(guò)表達(dá)miR-10b對(duì)GC細(xì)胞DDP耐藥的促進(jìn)作用.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

上調(diào)miR-10b表達(dá)能通過(guò)負(fù)調(diào)控靶基因KLF4促進(jìn)GC細(xì)胞DDP化療耐藥.

圖3 過(guò)表達(dá)miR-10b對(duì)順鉑誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞活力及凋亡的影響.A：SGC-7901細(xì)胞中miR-10b過(guò)表達(dá)效率鑒定,n=4,bP＜0.01 vs NC組;B：MGC-803細(xì)胞中miR-10b過(guò)表達(dá)效率鑒定,n=4,bP＜0.01 vs NC組;C：SGC-7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-NC或miR-10b后,接著再分別用0、10、20、30和40 μmol/L DDP處理細(xì)胞24 h,MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力,n=4,bP＜0.01 vs NC組;D：MGC-803細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-NC或miR-10b后,接著再分別用0、10、20、30和40 μmol/L DDP處理細(xì)胞24 h,MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力,n=4,bP＜0.01 vs NC組;E-G：SGC-7901和MGC-803細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-NC或miR-10b后,接著再用20 μmol/L DDP處理細(xì)胞24 h,Annexin V-FITC/PI染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡(E：代表性流式細(xì)胞散點(diǎn)圖;F：SGC-7901細(xì)胞凋亡統(tǒng)計(jì)結(jié)果,n=4,dP＜0.01 vs NC+DDP組;G：MGC-803細(xì)胞凋亡統(tǒng)計(jì)結(jié)果,n=4,dP＜0.01 vs NC+DDP組).DP：順鉑;PI：碘化丙錠;annexin V：膜聯(lián)蛋白V.

圖4 miR-10b過(guò)表達(dá)導(dǎo)致SGC-7901細(xì)胞移植瘤對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥性.A：瘤體的宏觀圖像;B：瘤體重量的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),bP＜0.01 vs NC+DDP組.DDP：順鉑.

圖5 KLF4在胃癌順鉑耐藥細(xì)胞中表達(dá)和miR-10b對(duì)KLF4表達(dá)的影響.A-C：SGC-7901和SGC-7901/DDP細(xì)胞中KLF4的mRNA (A)和蛋白(B和C)的表達(dá)水平,n=4,bP＜0.01 vs SGC-7901細(xì)胞;D-F：MGC-803和MGC-803/DDP細(xì)胞中KLF4的mRNA (D)和蛋白(E和F)的表達(dá)水平,n=4,dP＜0.01 vs MGC-803細(xì)胞;G-I：過(guò)表達(dá)miR-10b后,SGC-7901細(xì)胞中KLF4的mRNA (G)和蛋白(H和I)的表達(dá)水平,n=4,fP＜0.01 vs NC組;J-L：過(guò)表達(dá)miR-10b后,MGC-803細(xì)胞中KLF4的mRNA (J)和蛋白(K和L)的表達(dá)水平,n=4,fP＜0.01 vs NC組.DDP：順鉑.

圖6 上調(diào)KLF4的表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)miR-10b介導(dǎo)的順鉑耐藥.A和B：三組的SGC-7901細(xì)胞中KLF4的蛋白表達(dá)水平,n=4,bP ＜0.01 vs NC+Vector組,dP＜0.01 vs miR-10b+Vector組;C和D：三組的MGC-803細(xì)胞中KLF4的蛋白表達(dá)水平,n=4,bP＜0.01 vs NC+Vector組;dP＜0.01 vs miR-10b+Vector組;E：三組的SGC-7901細(xì)胞的細(xì)胞活力,n=4,bP＜0.01 vs NC+Vector組;cP＜0.05 vs miR-10b+Vector組;F：三組的MGC-803細(xì)胞的細(xì)胞活力,n=4,bP＜0.01 vs NC+Vector組;cP＜0.05 vs miR-10b+Vector組.DDP：順鉑.

展望前景

本研究探明了miR-10b促進(jìn)GC的DDP耐藥調(diào)控機(jī)制,并為GC的DDP耐藥的治療提供了參考靶點(diǎn).