串聯(lián)質(zhì)譜法檢測尿皮質(zhì)醇和唾液皮質(zhì)醇在庫欣綜合征診斷中的研究進(jìn)展

杜琴 趙蓓蓓 高玉婷 李冰玲 蔡國杰 蔡珂 李延兵 廖志紅

1中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣州 510000; 2廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司 510000

臨床上將僅有實(shí)驗(yàn)室檢查異常而無典型的高皮質(zhì)醇臨床表現(xiàn)(如皮膚紫紋、滿月臉、水牛背、向心性肥胖等)的類型稱為亞臨床庫欣綜合征(CS)，主要是指在腎上腺意外瘤中發(fā)現(xiàn)的高分泌功能性意外瘤，因?yàn)榘Y狀很輕微或不典型，在臨床上往往會被忽視，或混淆為代謝綜合征，隨著疾病進(jìn)展，部分患者可發(fā)展為比較典型的臨床CS[1]。亞臨床CS患者具有與CS患者類似的不良臨床結(jié)局，長期輕度的皮質(zhì)醇分泌異常，增加了心血管疾病、糖尿病、血脂代謝異常等其他疾病的發(fā)病率和死亡率，早篩查、早診斷、早治療很有意義[2]。而各種治療方案均有風(fēng)險(xiǎn)，CS在診斷不明確時(shí)，不建議進(jìn)行降低皮質(zhì)醇水平的治療[3]。

2018年Ben-Shlomo和Cooper[4]報(bào)道了來源于垂體的靜默型促腎上腺皮質(zhì)激素腺瘤，這類患者也因無典型的CS臨床表現(xiàn)或生化檢測結(jié)果，而被認(rèn)為是無功能垂體腺瘤，靜默型促腎上腺皮質(zhì)激素腺瘤可能會轉(zhuǎn)化為庫欣病垂體腺瘤、甚至靜默型促腎上腺皮質(zhì)激素垂體癌。研究者認(rèn)為，靜默型促腎上腺皮質(zhì)激素腺瘤的診斷也有可能是由于在疾病早期沒有CS的典型表現(xiàn)，或由于CS的診斷切點(diǎn)/診斷標(biāo)準(zhǔn)問題等原因，在早期時(shí)被認(rèn)為是靜默型、非庫欣病。

在正常人群/無功能性腎上腺意外瘤患者、亞臨床CS患者和CS患者中，皮質(zhì)醇水平呈“連續(xù)譜”，即從正常分泌到輕度高分泌再到過多分泌，三者之間的界限不明確，存在很大部分重疊[5]。臨床迫切需求敏感性和特異性都很高的區(qū)分患者和非患者的皮質(zhì)醇水平的檢測方法——液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)。

1 測定24 h尿游離皮質(zhì)醇(24 h UFC)和午夜唾液皮質(zhì)醇(MSC)的臨床意義

24 h UFC反映24 h內(nèi)皮質(zhì)醇的整體分泌水平，與血清皮質(zhì)醇相比，24 h UFC不受晝夜節(jié)律或血清皮質(zhì)醇結(jié)合蛋白的影響[6]。正常情況下，腎臟過濾并部分重新吸收未結(jié)合的皮質(zhì)醇，只有很小一部分(約1%～2%)以游離皮質(zhì)醇的方式排出尿液；與尿皮質(zhì)醇代謝產(chǎn)物不同，24 h UFC不受肝臟代謝變化的影響，更能反映內(nèi)源性皮質(zhì)醇濃度[7]。除嚴(yán)重腎功能損害患者外，24 h UFC與平均血清游離皮質(zhì)醇水平相關(guān)性良好，被廣泛用作CS篩查試驗(yàn)[7]。

唾液皮質(zhì)醇測定的也是游離皮質(zhì)醇，血游離皮質(zhì)醇通過擴(kuò)散進(jìn)入唾液，與唾液流速無關(guān)，與血皮質(zhì)醇相比，唾液皮質(zhì)醇能快速、可靠地反映血漿皮質(zhì)醇濃度的變化[7]，且不受皮質(zhì)醇結(jié)合蛋白的影響，對于篩查正在使用雌激素治療或者懷孕的、體內(nèi)皮質(zhì)醇結(jié)合蛋白升高的女性患者非常有價(jià)值。MSC反映皮質(zhì)醇的晝夜節(jié)律，近年來在CS的篩查中備受青睞，雖然部分指南未提及或推薦唾液皮質(zhì)醇作為亞臨床CS的一線篩查試驗(yàn)，但MSC作為一種簡便易行、效益高的檢測方法，在腎上腺皮質(zhì)軸功能異常評估及CS診斷中有重要地位[8-11]。MSC很敏感，如果CS的任何癥狀和體征出現(xiàn)或復(fù)發(fā)，無論癥狀是否輕微，MSC的測量將很快確認(rèn)復(fù)發(fā)。Carrasco等[12]研究表明，MSC是一種非?？煽康男g(shù)后監(jiān)測患者皮質(zhì)醇的方法。

2 皮質(zhì)醇的檢測方法

測定皮質(zhì)醇的方法有免疫分析法和色譜分析法。其中免疫分析法主要為熒光法、競爭性蛋白結(jié)合分析法、放射免疫分析法(RIA)、ELISA和化學(xué)發(fā)光免疫法(CLIA)，色譜分析法主要為氣相色譜法(GC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)、高效液相色譜法(HPLC)和LC-MS/MS[6-7,13]。表1匯總了免疫法、串聯(lián)質(zhì)譜法和GC-MS測定UFC和唾液皮質(zhì)醇的差異，串聯(lián)質(zhì)譜法檢測尿液和唾液皮質(zhì)醇具有較明顯的優(yōu)勢，詳細(xì)闡述如下。

表1 免疫法與色譜/質(zhì)譜法測定尿液/唾液皮質(zhì)醇的區(qū)別

注：RIA：放射免疫分析法；CLIA：化學(xué)發(fā)光免疫法；GC-MS：氣相色譜-質(zhì)譜法

2.1 UFC的檢測方法 免疫法可自動化操作，檢測快速、成本低，過去的20多年里，免疫法一直是臨床實(shí)際應(yīng)用中測定UFC的主流方法。但它存在諸多缺點(diǎn)：如檢測范圍較窄，低濃度的靈敏性欠佳；特異性差，容易受可的松、其他內(nèi)源性類固醇代謝物和外源性合成糖皮質(zhì)激素(如強(qiáng)的松)的干擾，引起不同程度的交叉反應(yīng)[14]。有研究報(bào)道顯示，采用免疫法測定UFC，其中不到1%～2%是真正的游離皮質(zhì)醇，其他皮質(zhì)醇前體和代謝產(chǎn)物(如11-脫氧皮質(zhì)酮、脫氧皮質(zhì)醇、四氫可的松、四氫皮質(zhì)醇、可的松、11-去氧可的松)占了大部分“檢測皮質(zhì)醇”的量，故存在檢測結(jié)果偏高的情況[6,14-15]。色譜法檢測尿24 h UFC的特異性較免疫法高，但需要較長的單樣本分析時(shí)間來保障足夠的分離度和方法特異性，因此檢測通量較低，早期僅被用于免疫分析前的凈化步驟，用于提高免疫法的特異性。通過將色譜法與質(zhì)譜聯(lián)用檢測UFC，可以大大縮短分析時(shí)間、提高檢測通量。近年來，GC-MS與LC-MS/MS由于其高靈敏性和高特異性，被認(rèn)為是檢測24 h UFC的“金標(biāo)準(zhǔn)”[7, 14, 16]。其中，LC-MS/MS在高特異性和高靈敏性的基礎(chǔ)上，具有分析時(shí)間短、自動化程度高、檢測通量高等優(yōu)勢，已日趨成為臨床實(shí)驗(yàn)室UFC檢測的首選。但選用LC-MS/MS方法時(shí)，需注意由于尿液或尿液提取物中大量的鹽類物質(zhì)和類固醇代謝物的存在，對24 h UFC的檢測造成離子抑制等干擾[7]。

當(dāng)患者在使用11β羥化酶抑制劑藥物(如美替拉酮、LCI699)治療CS時(shí)，由于皮質(zhì)醇前體物質(zhì)增多，為保證檢測皮質(zhì)醇的測試不與11-脫氧皮質(zhì)醇發(fā)生交叉反應(yīng)，只能用質(zhì)譜法來評估這些藥物的療效。

2.2 唾液游離皮質(zhì)醇的檢測方法 臨床對唾液皮質(zhì)醇的測定興趣始于20世紀(jì)60年代，但由于皮質(zhì)醇在唾液中的濃度極低，不足血清皮質(zhì)醇濃度的十分之一，因此對分析方法的靈敏性提出了很高的挑戰(zhàn)。1978年，唾液皮質(zhì)醇首次被RIA測定，但因唾液中較高濃度的可的松造成的嚴(yán)重交叉干擾反應(yīng)，以及MSC的極低濃度造成的靈敏性的挑戰(zhàn)，限制了免疫法測定唾液皮質(zhì)醇的發(fā)展[7]。2003年首次有報(bào)道采用LC-MS/MS測定唾液皮質(zhì)醇，該方法分析時(shí)間短，避免了在免疫法中常見的可的松等內(nèi)源性化合物和強(qiáng)的松龍等外源性藥物的干擾問題，且具有更好的靈敏性和特異性[7]。與靈敏性0.4～5.8 nmol/L的免疫法相比，LC-MS/MS的定量下限可達(dá)0.07～0.11 nmol/L[6]。隨著LC-MS/MS檢測唾液皮質(zhì)醇的發(fā)展，LC/MS-MS將成為衡量唾液皮質(zhì)醇的金標(biāo)準(zhǔn)[17]。雖然，與常規(guī)手工或自動免疫分析法相比，可以提高CS篩查的敏感性和特異性的研究尚未被完全證實(shí)[17]，但LC/MS-MS在評估唾液樣本的潛在污染或局部外用合成類固醇激素造成的干擾方面非常有用。如免疫法檢測MSC的測定值大于參考值上限的20倍，但患者臨床癥狀卻很輕，懷疑是潑尼松龍等合成類固醇或局部使用外用氫化可的松等外源性干擾，引起的交叉反應(yīng)所致測定值偏高，此時(shí)采用LC-MS/MS同時(shí)測定唾液游離皮質(zhì)醇和可的松濃度可區(qū)別干擾來源[17]。

3 24 h UFC和唾液皮質(zhì)醇的參考范圍

由于皮質(zhì)醇的檢測方法多樣，且沒有實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化和一致化，因此不同實(shí)驗(yàn)室之間檢測結(jié)果的一致性較差，基于不同檢測方法的參考區(qū)間也存在較大的差異。有指南推薦各實(shí)驗(yàn)室需建立基于對應(yīng)檢驗(yàn)方法的參考區(qū)間。目前關(guān)于LC-MS/MS檢測24 h UFC和MSC的中國人群的參考范圍，文獻(xiàn)鮮有報(bào)道，本文匯總了幾家采用LC-MS/MS檢測24 h UFC和MSC的實(shí)驗(yàn)室所使用的參考范圍，詳見表2和表3。

表2 LC-MS/MS檢測24 h UFC的參考范圍(1 μg=2.76 nmol)

注：LC-MC/MS：液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；24 h UFC：24 h尿游離皮質(zhì)醇

由于不同實(shí)驗(yàn)室的年齡劃分不一致，唾液皮質(zhì)醇采集的時(shí)間點(diǎn)不一致，不同實(shí)驗(yàn)室方法學(xué)也有差異，故在不同實(shí)驗(yàn)室間的質(zhì)譜法尿/唾液皮質(zhì)醇參考范圍存在差異。研究表明，在健康志愿者和肥胖者之間，MSC的濃度存在很大重疊，健康志愿者唾液皮質(zhì)醇的范圍為0.1～16 nmol/L，肥胖者唾液皮質(zhì)醇的范圍為0.11～17.7 nmol/L[18]。

4 24 h UFC和MSC診斷CS的切點(diǎn)值

指南推薦，以24 h UFC高于正常參考值上限作為CS的初篩標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合進(jìn)一步的檢查等確診CS[19]。由于在正常人群/無功能性腎上腺意外瘤患者、亞臨床CS患者和CS患者以及肥胖人群中，皮質(zhì)醇水平存在很大部分重疊，一些研究探討了使用24 h UFC和(或)MSC來診斷CS的切點(diǎn)，本文回顧了2014—2018年用免疫法和串聯(lián)質(zhì)譜法測定24 h UFC和MSC診斷CS切點(diǎn)值的相關(guān)文獻(xiàn)，歸納如表4。

表4中各項(xiàng)研究選取的CS研究組和對照組的研究對象不同，采用的24 h UFC和MSC檢測方法不同，所得的診斷CS的切點(diǎn)值不同，一般認(rèn)為LC-MS/MS檢測24 h UFC診斷CS的切點(diǎn)為170 nmol/24 h[15, 24, 29]，敏感性達(dá)97%～100%，特異性達(dá)91%～99%，這也與2017年新英格蘭雜志發(fā)表的綜述提到的診斷CS的24 h UFC切點(diǎn)60～62 μg/24 h(166～170 nmol/24 h)相一致[33]。但該切點(diǎn)可能造成一些亞臨床、輕微患者的漏診。對于妊娠中晚期患者，24 h UFC高于正常上限3倍即可提示CS[19, 34]。表4中還看到，免疫學(xué)方法的檢測24 h UFC切點(diǎn)值明顯高于LC-MS/MS和GC-MS，這與免疫學(xué)方法檢測結(jié)果高于質(zhì)譜法的情況相吻合。其中Aranda等[16]研究結(jié)果，相較于LC-MS/MS檢測結(jié)果的敏感性和特異性均較低，這可能與方法本身的不同或研究的入組人群差異有關(guān)，因?yàn)锳randa等入組的33例CS患者的UFC均不低于276 nmol/24 h，故可能出現(xiàn)了GC-MS檢測尿皮質(zhì)醇258 nmol/24 h的切點(diǎn)值明顯高于其他LC-MS/MS研究的切點(diǎn)值[15,24,29,31-32]。24 h UFC在區(qū)分CS和肥胖等皮質(zhì)醇分泌過多的患者時(shí)，需要較低的診斷切點(diǎn)值，但特異性不夠好。MSC診斷CS仍無較一致的切點(diǎn)值。免疫法檢測MSC診斷CS的切點(diǎn)值為2.76～16 nmol/L，LC-MS/MS檢測MSC的切點(diǎn)值在1.93～14.5 nmol/L，也與不同的研究、入組對象標(biāo)準(zhǔn)不同有關(guān)。

5 總結(jié)與展望

本文僅討論唾液皮質(zhì)醇或尿皮質(zhì)醇在診斷CS中的問題，沒有涉及抑制試驗(yàn)或興奮試驗(yàn)。這兩個指標(biāo)在每天的正常變異度比較大，需要多次測定，在皮質(zhì)醇的檢測方法未達(dá)到標(biāo)化、一致化之前，建議臨床選擇方法時(shí)要了解方法的全面信息，并采用固定的實(shí)驗(yàn)室方法。不典型到典型CS的不同階段中，血/尿/唾液皮質(zhì)醇水平是呈正常分泌到輕度高分泌再到過多分泌的“連續(xù)譜”，界限有一定的重疊。臨床上，伴有非創(chuàng)傷性皮膚瘀斑、皮膚薄、與年齡不相稱的骨量低等代謝綜合征患者，要注意對CS的篩查，對可疑亞臨床CS患者要長期隨訪、通過對干預(yù)治療的反應(yīng)等來進(jìn)一步明確臨床判斷。針對皮質(zhì)醇的檢測，質(zhì)譜法檢測24 h UFC和MSC較其他方法有較明顯的優(yōu)勢，對于LC-MS/MS檢測24 h UFC診斷CS的切點(diǎn)值多為170 nmol/24 h，但該切點(diǎn)值針對一些亞臨床、輕微患者的敏感性不足，可能存在漏診。MSC方面，尚無較一致的診斷CS切點(diǎn)值。目前臨床上可能需要同時(shí)采用質(zhì)譜法和免疫法檢測24 h UFC，但隨著MSC檢測的普及，同時(shí)檢測MSC和24 h UFC也是提高CS診斷的敏感性和特異性的有益方法。一些代謝綜合征患者在長期的疾病發(fā)展演變過程中是否會發(fā)展為CS，以及非典型、輕微、亞臨床CS情況下，不同干預(yù)對于長期預(yù)后的影響等問題仍然需要進(jìn)行大規(guī)模的前瞻性研究；不僅是質(zhì)譜法測定皮質(zhì)醇，未來用質(zhì)譜法檢測皮質(zhì)醇及其代謝產(chǎn)物或糖皮質(zhì)激素代謝組學(xué)的分析，也將為這些研究提供更好的支持。

表3 LC-MS/MS檢測唾液皮質(zhì)醇的參考范圍(1 μg/dl=27.6 nmol/L)

注：a與Mayo Medical Laboratories參考范圍相同；LC-MS/MS：液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

表4 24 h UFC和MSC在診斷CS的切點(diǎn)值文獻(xiàn)匯總

注：CLIA:化學(xué)發(fā)光免疫法；ECLIA:電化學(xué)發(fā)光免疫法；RIA:放射免疫分析法；ELISA:酶聯(lián)免疫吸附法；GC-MS:氣相色譜質(zhì)譜法；LC-MS/MS:液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；CS:庫欣綜合征；NOCS:非庫欣綜合征；SCS:亞臨床庫欣綜合征；NFA:腎上腺無功能腺瘤；HV：健康志愿者；OS:肥胖/超重;CDIR:達(dá)到緩解的庫欣??；NM:未提及；CD=CS