盤狀結(jié)構(gòu)域受體1對(duì)高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮凋亡的影響

趙為陳，沈炳香，何春遠(yuǎn)，王法財(cái)，江俊麟

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬六安醫(yī)院藥學(xué)部，安徽 六安 237005；2.中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院藥理學(xué)系，湖南 長沙 410078)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種慢性代謝性疾病，是繼心血管疾病、腫瘤之后的第三大健康殺手，預(yù)計(jì)到2030年，全球糖尿病患者將達(dá)到4億3900萬，約占世界人口的7.7%[1]。糖尿病易引發(fā)血管并發(fā)癥，可導(dǎo)致心、腦、腎等器官功能損傷和衰竭[2]。血管內(nèi)皮損傷被認(rèn)為是糖尿病血管病變的起始階段，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致內(nèi)皮損傷的主要原因。因此，如何阻止和減少血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，對(duì)于改善糖尿病患者血管內(nèi)皮功能，預(yù)防和治療糖尿病血管病變具有重要意義。

細(xì)胞凋亡是以caspase-3誘導(dǎo)細(xì)胞主動(dòng)的程序性、非炎癥性細(xì)胞死亡，主要表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核固縮、DNA及核酸酶裂解、凋亡小體形成，但是保留細(xì)胞質(zhì)膜的完整性[3]。研究表明，高糖可通過上調(diào)Bax蛋白，下調(diào)Bcl-2蛋白，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷[4]。盤狀結(jié)構(gòu)域受體1(discoidin domain receptor 1，DDR1)是一種非整合素膠原受體，為受體酪氨酸激酶家族成員之一，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)激酶區(qū)3部分組成，參與包括細(xì)胞炎癥、增殖、分化在內(nèi)的病理生理過程[5-6]。研究表明[7]，DDR1在上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，可促進(jìn)E鈣粘蛋白介導(dǎo)細(xì)胞間黏附，維持上皮細(xì)胞的完整以及促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖。但是關(guān)于DDR1在糖尿病血管內(nèi)皮損傷中的研究尚不清楚。本研究擬從動(dòng)物和細(xì)胞水平，探究DDR1在糖尿病血管內(nèi)皮損傷中的作用及其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動(dòng)物學(xué)部，體質(zhì)量為(200±20) g，♂，SPF級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠40只(合格證號(hào)：43004700029598)。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)購自美國模式菌種收集中心(ATCC)(貨號(hào)：CAL-1730)。

1.3 抗體與試劑DDR1(#3917)、caspase-3(#9662)、Bax(#2772)和Bcl-2(#3498)抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；β-actin抗體(AF0003)、HRP標(biāo)記兔二抗(A0277)和鼠二抗(A0286)均購自江蘇碧云天公司；一抗稀釋液(P0023A-100ml)、二抗稀釋液(P0023D-100ml)以及Hoechst 3342染色試劑盒(C1026)均購自江蘇碧云天公司；兔SP試劑盒(兔鏈卵白素-生物素法檢測系統(tǒng))(SP-9001)購自北京中杉生物技術(shù)公司；D-glucose溶液(G3285)購自美國Sigma公司；DMEM低糖培養(yǎng)基(C11885500BT)購自以色列BI公司。

1.4 儀器小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)(加拿大Visual Sonics公司)；倒置相差熒光顯微鏡(日本尼康公司)；ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；Western blot裝置(美國 Bio-Rad公司)；組織勻漿儀(武漢維塞爾生物科技有限公司)；恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；高速冷凍離心機(jī)(美國 Beckman-Coulter 公司)；細(xì)胞裂解破碎儀(寧波新芝生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 糖尿病大鼠模型構(gòu)建健康♂，SD大鼠，體質(zhì)量為(200 ±20)g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，一次性腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(60 mg·kg-1，用0.05 mol·L-1檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液新鮮配制)，對(duì)照組的大鼠腹腔注射等容積的檸檬酸緩沖液。在注射STZ后d 3檢測血糖，大鼠尾靜脈取血，血糖連續(xù)3 d≥16.7 mmol·L-1歸為糖尿病模型組。實(shí)驗(yàn)期間定期檢測體重、血糖、血脂、空腹胰島素等。

2.2 血管多普勒超聲對(duì)正常組大鼠(n=6)和糖尿病大鼠(n=6)進(jìn)行主動(dòng)脈血管多普勒超聲檢測。獲取大鼠二維主動(dòng)脈M型超聲、彩色血流、血流頻譜圖像。測定M型血管超聲圖像中內(nèi)中膜厚度(IMT)和管腔內(nèi)徑大小(AD)，血流頻譜圖像中主動(dòng)脈收縮最大血流速度(PSV)和主動(dòng)脈舒張末期血流速度(EDV)大小，并對(duì)血管阻力指數(shù)(RI=PSV-EDV/PSV)進(jìn)行計(jì)算。以上實(shí)驗(yàn)開展均由同一人員進(jìn)行操作，所有實(shí)驗(yàn)參數(shù)測定3次，取平均值為最終檢測結(jié)果。

2.3 蘇木精-伊紅(HE)染色大鼠心臟取血完成后，剪開左心耳并采用4%多聚甲醛持續(xù)灌流至心臟、肺呈乳白色，隨后完全打開大鼠胸腔并沿連接心臟主動(dòng)脈弓位置處緊貼著大鼠脊柱方向剪取主動(dòng)脈，隨后放置于預(yù)冷的生理鹽水內(nèi)并剔除血管外周結(jié)締組織，主動(dòng)脈組織4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，HE染色。

2.4 免疫組化主動(dòng)脈血管切片經(jīng)過脫蠟、清洗后按照北京中杉金橋公司兔SP-9001檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作：① 組織抗原修復(fù)：于90 ℃條件下，水浴25 min；② 阻斷：室溫條件下，滴加3% H2O2溶液阻斷劑，孵育15 min；③ 封閉：5% BSA溶液封閉30 min；④ 孵育一抗：4 ℃ 條件下，DDR1一抗(1∶ 200)孵育過夜；⑤ 孵育二抗：室溫條件下，孵育二抗約30 min；⑥ 顯色，拍照：滴加DAB顯色液，染色約5 min，顯微鏡下觀察DDR1表達(dá)與分布并拍照。

2.5 細(xì)胞培養(yǎng)與處理HUVECs用含10% FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基(5.5 mmol·L-1)培養(yǎng)，隔天換液，待細(xì)胞生長融合至90%時(shí)采用胰酶(含0.25%胰酶和0.01% EDTA)消化、傳代、種板。在CO2含量5%，溫度為37 ℃條件下，培養(yǎng)細(xì)胞。待培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞生長密度達(dá)到40%～50%時(shí)，同步化(含1% FBS的DMEM低糖培基)處理24 h。實(shí)驗(yàn)分組、處理情況如下： ① 高糖處理HUVECs 實(shí)驗(yàn)：Control組(5.5 mmol·L-1)、HG組(33 mmol·L-1D-glucose)；② DDR1 siRNA干擾處理實(shí)驗(yàn)：Control組(5.5 mmol·L-1)、HG組(33 mmol·L-1D-glucose)、DDR1 siRNA+HG組(轉(zhuǎn)染DDR1 siRNA 24 h，后高糖處理48 h)、NC+Control組(轉(zhuǎn)染DDR1無關(guān)片段24 h，后正常糖濃度下培養(yǎng)48 h)。

2.6 Hoechst染色采用Hoechst法檢測HUVECs凋亡，按照江蘇碧云天公司Hoechst染色試劑盒說明書進(jìn)行操作：① 24孔板培養(yǎng)的HUVECs，處理結(jié)束后，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS潤洗2次，每次3 min；② 加入細(xì)胞固定液，室溫固定10 min；③ 去除細(xì)胞固定液，PBS潤洗2次，每次3 min；④ 吸盡液體，每孔加入250 μL Hoechst 3342染色液，避光染色5 min；⑤ 去除染色液，PBS潤洗2次，每次3 min，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.7Westernblot大鼠主動(dòng)脈血管組織和HUVECs使用組織細(xì)胞裂解液裂解后，高速離心機(jī)4 ℃，12 000×g離心15 min，收集各自上清液，采用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度定量檢測。按照每孔上樣量為30 μg進(jìn)行蛋白質(zhì)凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。根據(jù)目的蛋白分子量大小以及蛋白marker指示進(jìn)行切膠，濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，脫脂牛奶封閉2 h，孵育對(duì)應(yīng)一抗(1 ∶ 1 000)4 ℃過夜，含吐溫磷酸鹽緩沖液(TPBS)洗滌3次，每次5 min，孵育二抗(1 ∶ 5 000)1 h，TPBS洗膜后加入發(fā)光聚合物(ECL)，使用膠片曝光，圖片掃描后用 Image J 軟件計(jì)算各條帶的灰度值，以各目標(biāo)條帶灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 糖尿病血管內(nèi)皮損傷模型建立為了探究高血糖對(duì)血管內(nèi)皮損傷的影響，我們通過大鼠腹腔注射STZ造模12周。結(jié)果顯示，糖尿病大鼠血糖異常增高(P<0.01)、血漿胰島素含量和體重均顯著降低(P<0.01)(Tab 1)。血管多普勒超聲結(jié)果顯示，糖尿病大鼠主動(dòng)脈血管IMT和RI顯著增加(P<0.01)，AD、PSV和EDV均顯著降低(P<0.01)(Tab 1、Fig 1A)。HE染色結(jié)果顯示，糖尿病大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮粗糙，出現(xiàn)明顯隆起，褶皺且排列紊亂，呈現(xiàn)波浪形(Fig 1B)。以上研究表明，糖尿病血管內(nèi)皮損傷模型建立成功。

Tab 1 Comparison of general index levels between two groups of

**P<0.01vscontrol

Fig 1 Effects of hyperglycemia on vascular endothelial structure and function in

A: Detection of rat aortic endothelial function by vascular Doppler ultrasound. B: Detection of rat aortic vascular endothelial structure by HE staining.

3.2 高糖對(duì)血管內(nèi)皮凋亡的影響為探究糖尿病血管內(nèi)皮損傷時(shí)，是否有內(nèi)皮細(xì)胞凋亡發(fā)生。我們通過動(dòng)物與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相結(jié)合進(jìn)行驗(yàn)證。Western blot檢測結(jié)果顯示，糖尿病大鼠主動(dòng)脈組織Bax和caspase-3表達(dá)均顯著增加(P<0.01，P<0.05)，Bcl-2表達(dá)顯著降低(P<0.05)(Fig 2A)。高糖處理HUVECs 48 h可誘導(dǎo)Hoechst陽性細(xì)胞增加(P<0.01)，促進(jìn)Bax和caspase-3表達(dá)(P<0.01)，抑制Bcl-2表達(dá)(P<0.05)(Fig 2B、2D、2E、2F)。上述結(jié)果表明，細(xì)胞凋亡參與了糖尿病血管內(nèi)皮損傷過程。

3.3 高糖對(duì)血管內(nèi)皮DDR1蛋白表達(dá)的影響為探究血管內(nèi)皮凋亡的發(fā)生機(jī)制，我們通過Western blot和免疫組化檢測DDR1表達(dá)與分布情況。結(jié)果顯示，糖尿病大鼠主動(dòng)脈組織DDR1蛋白表達(dá)顯著增加(Fig 3A、3B)(P<0.01)。通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高糖處理HUVECs 48 h可顯著上調(diào)DDR1蛋白表達(dá)(Fig 3D)(P<0.01)。提示DDR1可能參與高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷。

3.4 抑制DDR1對(duì)高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響為確證DDR1與高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系，我們通過轉(zhuǎn)染DDR1 siRNA 24 h后，高糖處理HUVECs 48 h。Hoechst染色法檢測細(xì)胞凋亡情況，Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，抑制DDR1可顯著降低高糖誘導(dǎo)HUVECs Hoechst陽性細(xì)胞率增加(P<0.05)(Fig 4A、4B)，Bax和caspase-3表達(dá)的上調(diào)(P<0.05)，Bcl-2表達(dá)的下調(diào)(P<0.05)(Fig 4C、4D)。提示抑制DDR1可以降低高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮凋亡，緩解內(nèi)皮損傷。

4 討論

糖尿病的微血管和大血管并發(fā)癥可引起心、腦、腎、眼底、下肢等重要組織器官供血不足和功能喪失，是導(dǎo)致糖尿病患者高致殘率和高死亡率的主要原因[8]。血管內(nèi)皮損傷是糖尿病血管病變的始動(dòng)因素。內(nèi)皮細(xì)胞是血液與血管壁之間最重要的一層保護(hù)屏障，高糖可加速內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，引發(fā)血管病變[9-11]。在本研究中，我們通過STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠和高糖處理HUVECs 48 h，觀察糖尿病環(huán)境下血管內(nèi)皮凋亡情況。在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠(12周)，我們通過主動(dòng)脈血管多普勒超聲和HE染色檢測血管內(nèi)皮損傷情況，Western blot檢測大鼠主動(dòng)脈組織凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、Bax和Bcl-2表達(dá)變化。結(jié)果顯示，相比正常對(duì)照組大鼠，糖尿病組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度增厚、管腔內(nèi)徑變小、主動(dòng)脈收縮最大血流速度和主動(dòng)脈舒張末期血流速度明顯減小，同時(shí)出現(xiàn)血管內(nèi)膜粗糙，褶皺顯著且排列紊亂，表明血管內(nèi)皮功能損傷；Western blot結(jié)果顯示，Bax和caspase-3表達(dá)顯著上調(diào)，Bcl-2表達(dá)顯著下調(diào)。進(jìn)一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高糖處理HUVECs 48 h可增加Hoechst陽性細(xì)胞率，且Bax和caspase-3表達(dá)顯著上調(diào)，Bcl-2表達(dá)顯著下調(diào)。上述動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果共同證實(shí)，高糖環(huán)境可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致糖尿病血管內(nèi)皮損傷。

Fig 2 Effect of high glucose on vascular endothelial

DDR1為受體酪氨酸蛋白激酶，廣泛存在于腦、肺、腎、脾和胎盤等多種組織中，參與了包括細(xì)胞遷移、增殖、生存、分化以及細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)在內(nèi)的一系列生理和病理過程[12]。研究證實(shí)，在頸動(dòng)脈球囊損傷內(nèi)皮的小鼠模型，頸動(dòng)脈中DDR1表達(dá)明顯上調(diào)，并伴隨平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和膠原(I和VIII型)合成增加[13]。在基底膜成分α5(IV)敲除的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，DDR1表達(dá)降低，并伴隨著內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和小管形成的減少[14]。在人胚腎細(xì)胞膜上，高糖可促進(jìn)DDR1蛋白的表達(dá)[15]。既往研究提示DDR1可能參與高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷。因此，在本研究中，我們通過Western blot和免疫組化共同檢測12周糖尿病大鼠主動(dòng)脈組織DDR1蛋白表達(dá)與分布，結(jié)果顯示，相比正常對(duì)照組大鼠，糖尿病大鼠主動(dòng)脈組織DDR1表達(dá)顯著升高。在培養(yǎng)的HUVECs，高糖處理48 h,結(jié)果顯示，相比對(duì)照組，高糖處理組可以顯著上調(diào)DDR1。基于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果高糖可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)DDR1表達(dá)。我們推測，糖尿病發(fā)生時(shí)，DDR1可能通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，引起血管內(nèi)皮功能損傷。為了確定DDR1在高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用，在本實(shí)驗(yàn)中，我們進(jìn)一步檢測siRNA DDR1對(duì)高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，在培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞，DDR1 siRNA能顯著降低高糖誘導(dǎo)的Hoechst陽性細(xì)胞率增加，抑制Bax、caspase-3表達(dá)上調(diào)和Bcl-2表達(dá)下調(diào)。

Fig 3 Effect of hyperglycemia on DDR1 protein expression in vascular endothelial

Fig 4 Inhibition of DDR1 on high glucose-induced apoptosis of endothelial

A: Effect of DDR1 siRNA on the rate of apoptosis induced by high glucose in HUVECs. B: Percentage of Hoechst positive cells. C: Effect of DDR1 siRNA on high glucose-induced apoptosis-related proteins(Bax, Bcl-2, caspase-3) in HUVECs. D: Quantification of C. NC: DDR1 negative control.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsHG

綜上所述，本研究通過探討DDR1對(duì)高糖誘血管內(nèi)皮凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖可通過促進(jìn)DDR1表達(dá)，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能損傷。以上研究結(jié)果揭示了糖尿病血管內(nèi)皮損傷的部分分子機(jī)制，為進(jìn)一步靶向DDR1藥物治療奠定了理論基礎(chǔ)。