芬戈莫德對(duì)腎小管上皮細(xì)胞NLRP3炎性體激活的影響

丁麗紅，包 婷，李丹丹，倪海鋒，袁 亮，郝 麗，王德光

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科，安徽 合肥 230601；2. 東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院腎臟內(nèi)科，江蘇 南京 210009)

芬戈莫德(fingolimod)，又稱(chēng)FTY720，是從冬蟲(chóng)夏草培養(yǎng)液中提取、分離出來(lái)，并經(jīng)過(guò)一系列修飾加工而成的一種新開(kāi)發(fā)的免疫抑制劑[1]。芬戈莫德的作用機(jī)制不同于常規(guī)的免疫抑制劑，目前對(duì)芬戈莫德發(fā)揮其免疫抑制作用和免疫調(diào)控作用機(jī)制的研究主要集中在促進(jìn)淋巴細(xì)胞歸巢、誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡等，但到目前為止，其確切的作用機(jī)制仍不清楚。

NLRP3炎性體是由NLRP3、ASC和pro-caspase-1組成的多蛋白復(fù)合體，可以活化caspase-1，釋放IL-1β和IL-18，從而促進(jìn)各種炎癥性和免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展。我們之前體內(nèi)、外的研究發(fā)現(xiàn)，腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)的NLRP3炎性體激活在白蛋白導(dǎo)致的腎小管間質(zhì)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。本文擬通過(guò)體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)研究芬戈莫德是否通過(guò)抑制NLRP3炎性體激活而發(fā)揮抗炎免疫作用，從而探討芬戈莫德的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞健康♂， Wistar大鼠40只，清潔級(jí)，體重(130～160) g，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，生產(chǎn)許可證sexk(軍)2012-004。細(xì)胞來(lái)源：HK-2細(xì)胞株為人近端腎小管上皮細(xì)胞的永生系，購(gòu)自武漢大學(xué)細(xì)胞保藏中心。

1.2 藥物與試劑芬戈莫德粉劑(美國(guó)selleckchem 批號(hào)S500207)；SP試劑盒(福州邁新 Kit 9921)；NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18和β-actin(美國(guó)Santa Cruz)；TRIzol試劑(美國(guó)Invitrogen)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (日本TaKaRa)；本研究所用引物由南京金斯瑞科技有限公司設(shè)計(jì)及合成。

1.3 儀器石蠟切片機(jī)(德國(guó)萊卡公司)；顯微鏡(日本Olympus，BX41)；電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；7300型Real-time PCR儀(美國(guó)ABI公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、造模、給藥大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，行右腎切除術(shù)1周后隨機(jī)分為五組：對(duì)照組(n=8)，經(jīng)腹腔注射與牛血清白蛋白(BSA，5 g·L-1)等體積的0.9%生理鹽水；蛋白負(fù)荷腎病模型組(n=8)，經(jīng)腹腔注射BSA(5 g·L-1)；不同濃度芬戈莫德干預(yù)組(每組n=8)，經(jīng)大鼠腹腔注射BSA(5 g·L-1)的同時(shí)給予大鼠灌胃芬戈莫德(0.25，0.5，1 mg·kg-1)。

1.5 細(xì)胞分組及藥物處理HK-2細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)液為含5%胎牛血清的DMEM/F12。將HK-2細(xì)胞接種在6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)至部分融合或全部融合時(shí)，用無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)液洗2次后，去血清培養(yǎng)24 h，然后細(xì)胞分組如下：①加入正常培養(yǎng)液的正常對(duì)照組；②加入高濃度BSA(20 g·L-1)刺激的模型組；③高濃度BSA刺激HK-2細(xì)胞后加入不同濃度芬戈莫德(1，10，100 nmol·L-1)的干預(yù)組。

1.6 大鼠腎組織PAS和Masson染色大鼠腎臟組織用福爾馬林固定后，脫水、透明、石蠟包埋成蠟塊，切片(厚2～3 μm)，常規(guī)脫蠟至水后行PAS及Masson染色。每例切片顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)互不重疊的腎間質(zhì)視野進(jìn)行腎臟損傷評(píng)分。評(píng)分內(nèi)容包括：腎小管萎縮、小管間質(zhì)纖維化、有無(wú)蛋白管型、間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度等。小管間質(zhì)損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：正常；1分：皮質(zhì)損傷范圍<25%；2分：25%～50%；3分：>50%。

1.7 大鼠腎組織免疫組化染色蠟塊切片(厚3～4 μm)后常規(guī)脫蠟，水化，枸櫞酸鈉、微波修復(fù)后，用SP試劑盒(福州邁新 Kit 9921)檢測(cè)NLRP3 (1 ∶ 100)、caspase-1(1 ∶ 50)、IL-1β(1 ∶ 100)、IL-18(1 ∶ 100)，PBS作為陰性對(duì)照，顯微鏡下觀(guān)察拍照。

1.8 Western印跡取大鼠新鮮腎組織或收集培養(yǎng)板中的細(xì)胞，加適量RIPA裂解液，離心取上清液，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)蛋白濃度。取等量蛋白樣本變性后SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入NLRP3(1 ∶ 1 000)、caspase-1(1 ∶ 500)、IL-1β(1 ∶ 1 000)和IL-18(1 ∶ 1 000)一抗，放置4 ℃冰箱過(guò)夜。最后TBST洗膜，加入TBST稀釋的二抗 (1 ∶ 5 000)，室溫孵育2 h， ECL化學(xué)發(fā)光法曝光。以β-actin(1 ∶ 1 000)作為內(nèi)參。

1.9 熒光實(shí)時(shí)定量PCR用TRIzol試劑提取大鼠腎組織或培養(yǎng)細(xì)胞的總RNA，對(duì)總RNA進(jìn)行純度、濃度及完整性的測(cè)定。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。10 μL反應(yīng)體系，置于PCR儀中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以雙蒸水代替cDNA模板作為陰性對(duì)照。所用引物由南京金斯瑞科技有限公司設(shè)計(jì)及合成，引物序列如Tab 1所示。

2 結(jié)果

2.1 芬戈莫德對(duì)蛋白負(fù)荷腎病大鼠腎臟炎癥和纖維化的影響PAS及Masson染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，蛋白負(fù)荷腎病模型組腎小管上皮細(xì)胞顆粒變性或空泡變性明顯，小管腔內(nèi)可見(jiàn)蛋白管型，部分腎小管灶性萎縮，間質(zhì)中有較多的淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)有輕度纖維化，小管間質(zhì)損傷評(píng)分明顯升高；與模型組相比，0.25 mg·kg-1芬戈莫德組腎小管上皮細(xì)胞顆粒變性或空泡變性稍有改善，腎小管灶性萎縮減輕，間質(zhì)中淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)有所減少，小管間質(zhì)損傷評(píng)分較模型組稍有下降，0.5 mg·kg-1和1 mg·kg-1芬戈莫德組明顯減弱了蛋白尿?qū)е碌哪I小管間質(zhì)炎癥和纖維化，且小管間質(zhì)損傷評(píng)分明顯下降(Fig 1)。

2.2 芬戈莫德對(duì)蛋白負(fù)荷腎病大鼠腎臟組織中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18表達(dá)的影響免疫組化結(jié)果顯示，NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18在對(duì)照組的腎小管上皮細(xì)胞中僅有少量表達(dá)，在模型組中的表達(dá)均較對(duì)照組增強(qiáng)。與模型組相比，0.25 mg·kg-1芬戈莫德可抑制腎小管上皮中的NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的表達(dá)，0.5 mg·kg-1和1 mg·kg-1芬戈莫德組則抑制作用更加明顯(Fig 2)。

2.3 芬戈莫德對(duì)蛋白負(fù)荷腎病大鼠腎臟組織中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白和mRNA表達(dá)的影響Western印跡結(jié)果顯示(Fig 3A)，與對(duì)照組相比，模型組腎組織NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白的表達(dá)均明顯升高；與模型組相比，0.25 mg·kg-1芬戈莫德組NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白的表達(dá)均有所減少，而0.5 mg·kg-1和1 mg·kg-1芬戈莫德組則明顯降低。熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示(Fig 3B)，模型組腎組織中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA的表達(dá)均高于對(duì)照組；與模型組相比，0.25 mg·kg-1芬戈莫德可抑制NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA的表達(dá)，0.5 mg·kg-1和1 mg·kg-1芬戈莫德可明顯抑制上述mRNA的表達(dá)。組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

1：Control;2:Model;3: Fingolimod 0.25 mg·kg-1;4: Fingolimod 0.5 mg·kg-1; 5: Fingolimod 1 mg·kg-1. A: PAS and Masson staining of the rat renal tissues ( × 200); B: Tubulointerstitial injury score.*P<0.05vsControl group;#P<0.05vsModel group.

Tab 1 Primer sequences of several genes for real-time PCR

Fig 2 Expression of NLRP3, caspase-1, IL-1β and IL-18 in rat renal tissues by immunohistochemical staining(× 200)

2.4 芬戈莫德對(duì)白蛋白刺激的HK-2細(xì)胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白和mRNA的表達(dá)的影響在體外實(shí)驗(yàn)中，收集各組細(xì)胞分別做Western印跡和熒光實(shí)時(shí)定量PCR，檢測(cè)各組細(xì)胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白和mRNA的表達(dá)情況。Western印跡結(jié)果顯示(Fig 4A)，模型組細(xì)胞NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白的表達(dá)均較對(duì)照組明顯升高，用不同濃度的芬戈莫德干預(yù)后，與模型組相比，1 nmol·L-1芬戈莫德可抑制NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白的表達(dá)，10 nmol·L-1和100 nmol·L-1芬戈莫德可抑制各蛋白的表達(dá)。熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示(Fig 4B)，與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA的表達(dá)均升高；而與模型組相比，1 nmol·L-1芬戈莫德可抑制NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA的表達(dá)，10 nmol·L-1和100 nmol·L-1芬戈莫德組有明顯的抑制作用，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

芬戈莫德是1995年日本Fujita教授從冬蟲(chóng)夏草(子囊菌亞門(mén)赤僵菌)培養(yǎng)液中提取并分離出的一種鞘氨醇樣抗生素——多球殼菌素 (又名嗜熱菌殺酵母素)，化學(xué)名：2-amino-2[-2-(4-octyophenyI)ethyI]-1,3-propanedioI hydrochIoride；分子式：C19H33NO2·HCl；分子量：343.94 道爾頓。芬戈莫德是一種新型免疫抑制劑，該制劑從結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制上不同于傳統(tǒng)的免疫抑制劑，如他克莫司、環(huán)孢素以及雷帕霉素等[2]。芬戈莫德具有較強(qiáng)的免疫抑制作用，且毒副作用小，生物利用度高，并與常規(guī)免疫抑制劑具有協(xié)同作用，在2010年9月22日被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)為自身免疫性疾病多發(fā)性硬化癥的一線(xiàn)口服藥物，其免疫抑制效果明顯優(yōu)于其他免疫抑制劑[3]。

Fig 3 In uence of fingolimod on expression of NLRP3, caspase-1, IL-1β, and IL-18 in rat renal

A: Western blot; B:real-time PCR. 1: Control; 2: Model; 3: Fingolimod 0.25 mg·kg-1; 4: Fingolimod 0.5 mg·kg-1; 5: Fingolimod 1 mg·kg-1.*P<0.05vsControl group;#P<0.05vsModel group.

芬戈莫德藥理作用獨(dú)特，目前研究認(rèn)為其免疫抑制機(jī)制可能有3種：①“歸巢”學(xué)說(shuō)：芬戈莫德可能通過(guò)調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的分化、遷移以及炎性因子的產(chǎn)生，使淋巴細(xì)胞歸巢并“滯留”在淋巴結(jié)及腸道集合淋巴結(jié)等次級(jí)淋巴器官中，抑制淋巴組織內(nèi)淋巴細(xì)胞的游出，從而減少外周血中淋巴細(xì)胞的數(shù)量[4]。芬戈莫德在發(fā)揮免疫抑制和免疫調(diào)控作用的同時(shí)并不影響淋巴細(xì)胞的激活和增殖，也不損害機(jī)體的免疫記憶功能和免疫應(yīng)答[5]。②“細(xì)胞凋亡”學(xué)說(shuō)：芬戈莫德可以誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的凋亡，可能與Bcl-2家族[6]、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+引起鈣超載、Fas/FasL等有關(guān)[7]，還有研究表明，芬戈莫德誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與其抑制Akt-NF-κB信號(hào)，促進(jìn)抗凋亡蛋白Mcl-1的蛋白酶體降解以及增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成的能力有關(guān)[8]。③通過(guò)作用神經(jīng)鞘氨醇-1-磷酸(Sphingosine-1-phosphate，S1P)抑制淋巴細(xì)胞外流：研究表明，芬戈莫德主要是通過(guò)拮抗S1P與淋巴細(xì)胞表面的S1P1受體，使淋巴細(xì)胞滯留在淋巴器官內(nèi)，減少淋巴細(xì)胞外流而發(fā)揮相應(yīng)的免疫抑制作用[9]。但到目前為止，上述作用機(jī)制并不能很好的解釋芬戈莫德在體內(nèi)的相關(guān)現(xiàn)象和全部作用機(jī)理，仍需尋找芬戈莫德的其他作用機(jī)制。

Fig 4 In uence of fingolimod on expression of NLRP3, caspase-1, IL-1β, and IL-18 in HK-2

A: Western blot; B:real-time PCR.1: Control; 2: Model; 3: Fingolimod 1 nmol·L-1; 4: Fingolimod 10 nmol·L-1; 5: Fingolimod 100 nmol·L-1.*P<0.05vsControl group;#P<0.05vsModel group.

炎性體是機(jī)體固有免疫及應(yīng)激系統(tǒng)的重要防御成分，其中NLRP3炎性體是目前研究最為深入且在多種細(xì)胞中表達(dá)的炎性體，各種內(nèi)源性或外源性的刺激可通過(guò)不同的信號(hào)通路激活NLRP3炎性體，使caspase-1活化，引起IL-1β、IL-18等促炎細(xì)胞因子成熟分泌，進(jìn)而促進(jìn)炎癥的發(fā)生[10]，多種藥物通過(guò)調(diào)節(jié)NLRP3炎性體激活而發(fā)揮抗炎等作用[11]。我們既往的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明，蛋白尿可導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞NLRP3炎性體激活，IL-1β和IL-18水平升高，使間質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤(rùn)，最終導(dǎo)致慢性腎小管間質(zhì)炎癥和纖維化的發(fā)生，從而導(dǎo)致慢性腎臟病的進(jìn)展[12]。在體外實(shí)驗(yàn)中，我們用高濃度BSA體外長(zhǎng)時(shí)間刺激HK-2細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)白蛋白是通過(guò)刺激Cathepsin B釋放和ROS生成這兩種途徑激活腎小管上皮細(xì)胞中的NLRP3炎性體[13]。因此NLRP3炎性體激活在腎小管間質(zhì)炎癥的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用，抑制NLRP3炎性體激活可以抑制腎小管間質(zhì)炎癥。

芬戈莫德在腎臟疾病研究領(lǐng)域中除了在腎移植中的免疫抑制作用研究較多外，在其他腎臟疾病中也有廣泛研究，如芬戈莫德可改善5/6腎大部切除大鼠的炎癥和纖維化程度[14]，通過(guò)不同的機(jī)制對(duì)腎臟缺血/再灌注、腎小球腎炎及糖尿病腎病等動(dòng)物模型均有腎臟保護(hù)作用，保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞及足細(xì)胞避免凋亡、抗纖維化等作用，減緩腎缺血/再灌注損傷并發(fā)癥等[15]。而Scheiblich等[16]在神經(jīng)酰胺對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP3炎性體激活的研究中發(fā)現(xiàn)，芬戈莫德可以使脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP3炎性體激活后caspase-1和IL-1β的水平升高。但是本研究發(fā)現(xiàn)芬戈莫德可抑制蛋白負(fù)荷大鼠腎組織中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的表達(dá)，從而改善大鼠腎臟炎癥和纖維化的程度。這可能與芬戈莫德作為S1P受體調(diào)節(jié)劑，與存在不同細(xì)胞表面的5種S1P受體之間有不同的相互作用有關(guān)，尤其是神經(jīng)細(xì)胞，芬戈莫德作為多發(fā)性硬化癥的一線(xiàn)口服藥物，對(duì)不同的神經(jīng)細(xì)胞作用可能更為復(fù)雜，其機(jī)制目前尚未完全清楚。而我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于白蛋白引起的腎小管間質(zhì)的非免疫性炎癥，芬戈莫德同樣可發(fā)揮抗炎作用，而且與抑制腎小管上皮細(xì)胞中NLRP3炎性體激活有關(guān)。另外，本實(shí)驗(yàn)為了排除存在芬戈莫德對(duì)淋巴細(xì)胞的歸巢、凋亡、抑制外流影響的可能，我們又設(shè)計(jì)了體外實(shí)驗(yàn)，在體外沒(méi)有淋巴細(xì)胞的影響下，芬戈莫德同樣可抑制白蛋白導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞中NLRP3炎性體的激活，使IL-1β和IL-18的表達(dá)減少，這提示芬戈莫德可能是通過(guò)抑制NLRP3炎性體激活而抑制炎癥的發(fā)生和發(fā)展，這可能是芬戈莫德發(fā)揮抗炎的另一個(gè)作用機(jī)制。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)芬戈莫德可抑制腎小管上皮細(xì)胞NLRP3炎性體激活，從而減輕腎小管間質(zhì)炎癥和纖維化。雖然芬戈莫德抗炎免疫作用的具體機(jī)制目前仍不明確，本實(shí)驗(yàn)表明芬戈莫德可能通過(guò)抑制腎小管上皮細(xì)胞NLRP3炎性體激活而發(fā)揮作用，這為芬戈莫德作為抗炎免疫藥物在腎臟疾病的治療中發(fā)揮作用提供了新的思路和實(shí)驗(yàn)證據(jù)。