斷裂內(nèi)含肽介導(dǎo)的親和介質(zhì)與親和標(biāo)簽的應(yīng)用

杜夜星, 周挺峻, 陳浩然, 夏海鋒,2

(1. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 無(wú)錫 214122； 2. 江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 無(wú)錫 214122)

1 前 言

蛋白質(zhì)的表達(dá)與純化，是目前最重要的課題之一。親和標(biāo)簽的使用，簡(jiǎn)化了蛋白純化操作。但目前還沒(méi)有簡(jiǎn)單方法去除親和標(biāo)簽。將內(nèi)含肽應(yīng)用于親和層析中提供了一種解決這個(gè)問(wèn)題的方法[1]。內(nèi)含肽是位于未成熟蛋白中的一段多肽序列，可以在前體蛋白中發(fā)生自我剪接，將兩端外顯肽通過(guò)一個(gè)新形成的肽鍵連接在一起，這一過(guò)程稱為內(nèi)含肽的剪接反應(yīng)[2-5]。其剪接機(jī)制4步親核反應(yīng)組成[6-7]。由內(nèi)含肽不同的結(jié)構(gòu)特性，人為地將其分為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)含肽，微小內(nèi)含肽以及斷裂內(nèi)含肽3類[8-9]。其中，斷裂內(nèi)含肽為空間結(jié)構(gòu)上互不連續(xù)的兩段序列。在發(fā)生剪接反應(yīng)前，斷裂內(nèi)含肽2個(gè)片段需要先彼此識(shí)別組裝成完整內(nèi)含肽，然后按照標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)含肽剪接反應(yīng)完將兩端外顯肽通過(guò)一天然肽鍵連接，這一過(guò)程稱為反式剪接[10]。將斷裂內(nèi)含肽的一些特定的、起剪接活性的保守氨基酸進(jìn)行突變，則可阻止突變位點(diǎn)一端的反應(yīng)，只發(fā)生另一端的斷裂反應(yīng)，稱為N端或者C端斷裂反應(yīng)。

利用斷裂內(nèi)含肽可以將目的蛋白無(wú)標(biāo)簽純化的特點(diǎn)，使用Cfa斷裂內(nèi)含肽 (Consensus fast DnaE intein) 構(gòu)建了一種新型的親和層析介質(zhì)，來(lái)分離純化蛋白[11]。Cfa 斷裂內(nèi)含肽與Npu 斷裂內(nèi)含肽 (Nostoc punctiorme DnaE intein) 的序列有著高度相似性(82%)，N片段中含有101個(gè)氨基酸；C端片段較小，僅有25個(gè)氨基酸。與Npu斷裂內(nèi)含肽相比，Cfa斷裂內(nèi)含肽有以下優(yōu)點(diǎn)：1)剪接活性更快；2)更耐受高溫，80 ℃ 高溫條件下依然保持有剪接活性；3)在4 mol?L-1尿素與3 mol?L-1鹽酸胍下依然保持有活性，使得其在低溶蛋白中有潛在應(yīng)用；4)與目的蛋白融合后在細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)中表現(xiàn)出更高的表達(dá)量。

本研究以Cfa的N端片段作為親和配體(IN)，通過(guò)溴代法與瓊脂糖微球結(jié)合，制備出IN親和層析介質(zhì)。以C端片段作為融合標(biāo)簽(IC)，與目的蛋白融合(IC-GFP)。僅需上樣，平衡，洗脫3步即可將目的蛋白純化，純化后的目的蛋白幾乎不含其他雜質(zhì)，這使得Cfa斷裂內(nèi)含肽構(gòu)建的純化體系在商品化過(guò)程中有很大的潛力。

2 材料與方法

2.1 材料

E. coli JM109、E. coli BL21(DE3)菌株由本實(shí)驗(yàn)室所保藏。質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒、氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)等購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司； DL 100 DNA Marker 、Premixed Protein Marker (Broad)、限制性核酸內(nèi)切酶NdeⅠ和Hind Ⅲ、E Taq DNA 聚合酶、DNA連接酶購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；Epoxy Purose 4 Fast Flow購(gòu)自江蘇千純生物科技有限公司；其余化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；?KTA purifier層析系統(tǒng)購(gòu)自GE Healthcare公司，Bio-Rad公司的凝膠成像系統(tǒng)，核酸電泳儀購(gòu)自Bio-Rad公司；使用的引物、Cfa斷裂內(nèi)含肽的IN片段、IC片段均由蘇州鴻訊生物科技有限公司合成。

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒設(shè)計(jì)與構(gòu)建

根據(jù)ADAM等提供的Cfa序列[11]，以N端片段(IN)作為親和配體，C端片段(IC)為純化標(biāo)簽，對(duì)Cfa斷裂內(nèi)含肽進(jìn)行改造。每組基因片段的兩端引入ATG和TAA兩個(gè)密碼子, 并添加NdeⅠ(CATATG)和Hind Ⅲ(AAGCTT)兩個(gè)酶切位點(diǎn)。最終將設(shè)計(jì)好的IN、IC交由蘇州鴻訊生物科技有限公司合成。

2.2.1 IN片段的設(shè)計(jì)

首先突變了IN中所有的Cys(C1A,C29S,C60S)。其中，首位Cys的突變(C1A)用于阻止N端反應(yīng)的進(jìn)行；C28S、C59S的突變一方面避免二硫鍵的影響[12]，另一方面可以定向準(zhǔn)確地與活化瓊脂糖微球連接；將組氨酸標(biāo)簽添加到IN的C端，用于親和配體的純化；C末端引入Cys，以便與瓊脂糖微球連接。設(shè)計(jì)好的IN片段如圖1(A)。

2.2.2 IC片段的設(shè)計(jì) 由于IN片段中保守殘基的突變會(huì)抑制C端斷裂反應(yīng)，故需要將IC片段中117位天冬氨酸突變?yōu)?D117G)，以便解除抑制[13]；在IC末端添加C端斷裂必須的CFN三肽[14]。

2.2.3 IC-GFP與IC-GFP-D的設(shè)計(jì)

以IC作為純化標(biāo)簽，以綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，簡(jiǎn)稱GFP)作為模型蛋白，需要將IC與GFP通過(guò)PCR重組技術(shù)融合，形成IC-GFP(圖1B)。利用設(shè)計(jì)好的引物Fc、Fg、Rc、Rg(表1)，通過(guò)PCR將IC與GFP蛋白融合后，與載體pET30b連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)，得到重組菌E. coli BL21(DE3)/ pET30b-IC-GFP。

圖1 內(nèi)含肽的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)示意圖 Fig.1 Schematic diagram of the engineered intein pair

在測(cè)定構(gòu)建的新型親和層析介質(zhì)的吸附性能時(shí)，將IC末端Asn(N136)與CFN三肽中的Cys(C+1)均刪除，以阻止C端斷裂反應(yīng)的進(jìn)行。將C端斷裂所需的N136，C+1兩個(gè)保守位點(diǎn)通過(guò) Agilent technology公司的快速定點(diǎn)突變?cè)噭┖兄械姆椒▌h除。利用設(shè)計(jì)好的引物Fd、Rd(表1)，對(duì)IC-GFP進(jìn)行突變，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)，隨機(jī)挑取單個(gè)克隆菌培養(yǎng)，測(cè)序無(wú)誤后，得到的重組菌E. coli BL21(DE3)/ pET30b-IC-GFP-D。

2.3 重組蛋白的表達(dá)與純化

將構(gòu)建正確的重組菌涂布到含有kan(Amp)抗性的固體平板上過(guò)夜活化，然后擴(kuò)大培養(yǎng)。再將種子液轉(zhuǎn)接入含有相應(yīng)kan(Amp)的TB液體培養(yǎng)基中。測(cè)定菌液濃度(OD600)達(dá)到0.6時(shí)，添加IPTG低溫誘導(dǎo)表達(dá)16 h。誘導(dǎo)結(jié)束后，離心收集沉淀。使用PBS緩沖液(pH 7.4)反復(fù)清洗菌體至上清液無(wú)色，然后棄上清液，離心收集沉淀。收集的菌體-80 ℃ 超低溫冰箱凍存。

使用BufferA(10 mmol?L-1Tris-HCl; 0.5 mol?L-1NaCl; pH 8.0)重懸含有IN蛋白片段的菌體，Buffer B (50 m mol?L-1Na2HPO4; 50 mmol?L-1NaH2PO4; 0.5 mol?L-1NaCl；pH 6.0)來(lái)重懸含有IC-GFP和IC-GFP-D蛋白片段的菌體，分別在冰浴條件下破碎，離心的蛋白上清液使用0.22 μm的濾膜過(guò)濾，然后放入4 ℃冰箱中備用。

使用千純生物的Ni-NTA親和層析介質(zhì)將過(guò)膜后的蛋白純化。分別使用25、60、100、150、250和500 mmol?L-1濃度梯度的咪唑洗脫目的蛋白，收集破胞液，穿透液及不同梯度下的洗脫液。SDS-PAGE電泳分析，將條帶正確且純度較高的洗脫液脫鹽處理后低溫保存。

2.4 非介質(zhì)條件下的斷裂反應(yīng)

考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定IN與IC-GFP融合片段的蛋白濃度，設(shè)計(jì)IN與IC-GFP的物質(zhì)的量比例為4:1，然后以一定的體積混合。所有反應(yīng)均在室溫下進(jìn)行反應(yīng)。研究在非介質(zhì)條件下，Cfa內(nèi)含肽在不同時(shí)間點(diǎn)的斷裂反應(yīng)速率，通過(guò)電泳觀察斷裂情況，經(jīng)Image J軟件比較膠圖上初始IC-GFP與斷裂下來(lái)的GFP的條帶，估計(jì)各條帶所占的含量，計(jì)算其斷裂率。

表1 本文設(shè)計(jì)使用的引物 Table 1 Primers used in this study

2.5 層析介質(zhì)的制備

本研究以千純生物的環(huán)氧活化基質(zhì)Epoxy Purose 4 Fast Flow為載體，進(jìn)行IN片段的偶聯(lián)[15]。稱取一定量的抽干基質(zhì)于帶塞的小三角瓶中，并做好標(biāo)記。以1 g抽干基質(zhì)分別加入濃度為5、10、15、20 mg?mL-1的1.5 mL IN溶液中(0.1 mol?L-1Na2CO3/NaHCO3, pH11.5)充分混勻，于40 ℃，恒溫振蕩反應(yīng)24 h，反應(yīng)結(jié)束后，靜置15 min，測(cè)上清，通過(guò)測(cè)量偶聯(lián)前后蛋白濃度的差值來(lái)計(jì)算偶聯(lián)密度。然后將偶聯(lián)好的介質(zhì)使用大量去離子水反復(fù)沖洗幾次，加入幾滴去污劑，混勻振蕩幾分鐘，再用去離子水將去污劑沖洗干凈，然后將制備好的IN親和介質(zhì)抽干儲(chǔ)存于適量的20% 乙醇中。

2.6 層析介質(zhì)的性能研究

選用IC-GFP-D作為模型吸附蛋白，研究 IN親和層析介質(zhì)的靜態(tài)飽和載量與動(dòng)態(tài)載量。

2.6.1 靜態(tài)吸附測(cè)定

偶聯(lián)得到的IN親和層析介質(zhì)倒入布氏漏斗中，先通過(guò)去離子水清洗掉介質(zhì)中帶有的乙醇，然后將介質(zhì)置于平衡緩沖液中約15 min后，充分抽干，分別加入到6個(gè)25 mL帶有塞子的三角瓶中。并依次加入5 mL濃度為0.125、0.25、0.5、1、2、3 mg?mL-1的IC-GFP-D溶液，在搖床中震蕩(25 ℃，180 r?min-1)，待反應(yīng)停止后，靜置20 min，然后取上清，測(cè)定其中未完全吸附的IC-GFP-D的濃度。IN親和介質(zhì)的吸附量利用飽和吸附前后的上清液中的蛋白含量的差值來(lái)計(jì)算。通過(guò)Langmuir方程來(lái)評(píng)估IN介質(zhì)對(duì)IC-GFP-D的吸附性能，按式(1)計(jì)算介質(zhì)飽和吸附載量Qm和解離常數(shù)Kd[15-16]。

式中：Qm代表介質(zhì)飽和吸附載量(mg?mL-1)；Kd為解離常數(shù)(mg?mL-1)。Q*和C*分別為介質(zhì)的吸附量和平衡時(shí)體系中的蛋白濃度(mg?mL-1)。利用測(cè)得的幾組Q*和C*，通過(guò)非線性擬合，繪制飽和吸附曲線。得出吸附參數(shù)Qm和Kd。

2.6.2 動(dòng)態(tài)載量的測(cè)定[17]

將制備好的IN親和層析介質(zhì)裝于1 mL預(yù)裝柱中，先用過(guò)膜水沖洗10個(gè)柱體積，再用Buffer C (50 mmol?L-1Na2HPO4; 50 mmol?L-1NaH2PO4; 0.5 mol?L-1NaCl; pH 7.0)平衡5個(gè)柱體積左右，用配置好的1 mg?mL-1的IC-GFP-D上樣，流量為0.17 mL?min-1。通過(guò)紫外檢測(cè)儀記錄的OD280，繪制穿透曲線。當(dāng)流穿IC-GFP-D濃度超過(guò)初始上樣濃度的10% 時(shí)停止上樣。

式中：Q10%定義為動(dòng)態(tài)吸附載量(mg?mL-1介質(zhì))；C 和C0分別為流穿蛋白濃度和上樣蛋白濃度(mg?mL-1)；Vsolution,10% 為10% 穿透時(shí)上樣的蛋白溶液的體積(mL)；Vabsorbents為純化柱中介質(zhì)的體積(mL)。

2.7 層析介質(zhì)的再生條件的研究

任一商業(yè)化親和介質(zhì)，都需要能夠反復(fù)使用，以降低成本。因此，對(duì)于IN層析介質(zhì)的再生條件的探索是必要的。

使用1 mL的預(yù)裝柱(0.7 cm×2.5 cm)，如2.6.2節(jié)中的步驟，將其飽和上樣后，分別使用0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mol?L-1的NaOH，pH 2.2、 pH 3.0的檸檬酸-磷酸氫二納緩沖液將介質(zhì)再生。再生后，繼續(xù)按以上步驟將介質(zhì)飽和上樣，同樣條件再生，收集兩次再生液。分別測(cè)定不同再生條件下的兩次再生液中的蛋白濃度，及再生前后的動(dòng)態(tài)吸附載量。

2.8 層析介質(zhì)的純化應(yīng)用

將制備好的IN親和層析介質(zhì)裝于1 mL預(yù)裝柱，使用?KTA purifier 層析系統(tǒng)對(duì)GFP蛋白純化。層析流程圖如圖2所示。層析過(guò)程使用0.5 mL?min-1的流量，純化使用的所有溶液均0.22 μm濾膜過(guò)濾使用。收集表達(dá)后的IC-GFP重組蛋白，加入Buffer D (50 mmol?L-1Na2HPO4, 50 mmol?L-1Na2HPO4，0.5 mol?L-1NaCl, 1 mmol?L-1Zn2+, pH 6.5)，破胞后取上清。用Buffer D平衡介質(zhì)15個(gè)柱體積至基線平穩(wěn)，將IC-GFP蛋白溶液上樣，控制上樣量為1mL，然后用Buffer D沖洗雜蛋白，收集穿透液，至基線持平后，上斷裂緩沖液Buffer E (50 mmol?L-1Na2HPO4, 50 mmol?L-1Na2HPO4, 0.5 mol?L-1NaCl, 20 mmol?L-1EDTA, 50 mmol?L-1DTT, pH 7.0) 2 mL，然后靜置6 h。用洗脫緩沖液Buffer A (10 mmol?L-1Tris-HCl; 0.5 mol?L-1NaCl; pH 8.0)洗脫，收集洗脫液，使用0.1 mol?L-1NaOH將介質(zhì)再生后，用過(guò)膜水沖洗15個(gè)柱體積，再使用平衡緩沖液將介質(zhì)恢復(fù)至中性條件。

圖2 IN親和層析介質(zhì)的親和純化過(guò)程 Fig.2 Affinity purification process of the IN affinity chromatography resin POI: Protein of Interest

3 結(jié)果與討論

圖3 重組蛋白純化SDS-PAGE電泳圖 Fig.3 SDS-PAGE results of the affinity purification of recombinant protein

3.1 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

構(gòu)建好的重組菌 E. coli BL21(DE3)/pET-30b-IC-GFP，E. coli BL21(DE3)/pET-30b-IC-GFP-D和E. coli BL21(DE3)/pTXB1-IN經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，與所設(shè)計(jì)的序列100% 正確。然后將重組菌誘導(dǎo)表達(dá)，并使用不同濃度梯度的咪唑溶液將蛋白純化。IC-GFP與IN蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖3，兩蛋白的分子量分別為31.79和12.5 kD，這與電泳結(jié)果保持一致，重組蛋白在相應(yīng)位置均呈現(xiàn)出清晰的條帶。不同梯度的咪唑洗脫重組蛋白的結(jié)果如圖3所示，對(duì)于IN重組蛋白，隨著咪唑濃度的增加，在150 mmol?L-1咪唑濃度下有部分IN被洗脫，在咪唑濃度為250 mmol?L-1時(shí)，洗脫的目的蛋白已經(jīng)基本無(wú)其他雜帶；使用500 mmol?L-1的咪唑濃度洗脫時(shí)，仍然有目的蛋白被洗脫下來(lái)。故選用150 mmol?L-1咪唑濃度洗除雜蛋白，在500 mmol?L-1咪唑條件下洗脫IN目的蛋白。對(duì)于IC-GFP重組蛋白，由圖3(B)可知，在250 mmol?L-1咪唑濃度下無(wú)目的條帶出現(xiàn)，而500 mmol?L-1咪唑濃度下，則含有純度較高的目的條帶。故使用250 mmol?L-1咪唑洗除雜蛋白，在500 mmol?L-1咪唑條件下洗脫IC-GFP蛋白。由于IC-GFP與IC-GFP-D基本相同，故對(duì)于IC-GFP-D的純化也選用250 mmol?L-1咪唑洗雜，500 mmol?L-1咪唑洗脫。

3.2 非介質(zhì)條件下的斷裂反應(yīng)

在應(yīng)用Cfa斷裂內(nèi)含肽構(gòu)建的親和純化體系中，IN和IC片段結(jié)合后的斷裂速率對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程有重要影響。Cfa斷裂內(nèi)含肽本身具有較高的剪接反應(yīng)速率，圖4為其在非介質(zhì)條件下的斷裂反應(yīng)SDS-PAGE電泳圖。由圖5可得，反應(yīng)30 s后，斷裂率已超過(guò)50%；反應(yīng)4 h后取樣，測(cè)得的斷裂率已經(jīng)達(dá)到95%?；疽呀?jīng)斷裂完全。與其他內(nèi)含肽相比，Cfa內(nèi)含肽的斷裂極為高效的。盡管反應(yīng)6 h后，斷裂率升高到97.3%。但是，考慮到時(shí)間成本，選用斷裂時(shí)間為4 h。

圖 4 不同時(shí)間段內(nèi)含肽的斷裂反應(yīng) Fig.4 Cleavage reaction of intein at different time periods

圖5 Cfa內(nèi)含肽在不同時(shí)間段的斷裂反應(yīng) Fig.5 Cleavage reaction of intein at different time periods

3.3 層析介質(zhì)的制備與靜態(tài)載量測(cè)定

由于瓊脂糖有高比表面積，且對(duì)生物樣品影響較小，因此被用作偶聯(lián)IN配體的固相載體[18]，由于IN配體在設(shè)計(jì)時(shí)C末端引入了Cys，其Cys中帶有的巰基能夠與環(huán)氧活化后的基質(zhì)上的環(huán)氧基進(jìn)行結(jié)合，從而將IN配體成功的偶聯(lián)到瓊脂糖微球上。

在IN配體偶聯(lián)載體時(shí)，由于配體密度的不同，使得偶聯(lián)密度的不同，從而影響到靜態(tài)飽和載量。IC-GFP-D在不同IN濃度制備的親和層析介質(zhì)中靜態(tài)飽和吸附曲線如圖6所示。計(jì)算出的靜態(tài)吸附參數(shù)和測(cè)得的偶聯(lián)密度見(jiàn)表2。當(dāng)IN配體濃度較低時(shí)，隨著配體濃度的提高，偶聯(lián)密度也隨之升高，其飽和載量也在增加。在IN配體濃度達(dá)到15 mg?mL-1時(shí)，介質(zhì)偶聯(lián)密度達(dá)到16.02 mg?g-1左右，IN親和介質(zhì)的飽和吸附能力為66.78 mg?mL-1；IN配體的濃度繼續(xù)增大時(shí)，介質(zhì)的密度為16.98 mg?g-1，此時(shí)，偶聯(lián)密度增加較小，而此時(shí)的靜態(tài)飽和載量約為67.99 mg?mL-1，與配體濃度為15 mg?mL-1時(shí)的飽和載量相差不大。

當(dāng)瓊脂糖微球一定時(shí)，隨著IN配基濃度的提高，IN片段中的Cys上所含有的巰基與微球上的環(huán)氧基的碰撞機(jī)會(huì)也隨之增加，故層析介質(zhì)的偶聯(lián)密度也因此升高。當(dāng)偶聯(lián)的IN片段濃度進(jìn)一步提高時(shí)，偶聯(lián)密度增加不明顯?？赡苁怯捎诃h(huán)氧基量有限，隨著配基濃度增加，環(huán)氧基已全部與配基中巰基偶聯(lián)，配基中巰基處于空置狀態(tài)，所以偶聯(lián)密度增加不明顯。

圖6 不同IN濃度制備的親和介質(zhì)的飽和吸附曲線 Fig.6 Saturated adsorption curves of affinity resins with different IN concentrations

表2 不同IN濃度的親和層析介質(zhì)的飽和吸附量和解離常數(shù) Table 2 Saturated adsorption capacities and dissociation constants of affinity resins with different IN concentrations

綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)最終選取了15 mg?mL-1的IN配基濃度為最適的配基偶聯(lián)濃度。

3.4 動(dòng)態(tài)載量的測(cè)定與再生條件的優(yōu)化

不同于靜態(tài)吸附，動(dòng)態(tài)吸附通過(guò)模擬親和層析介質(zhì)在實(shí)際中的使用，故可以更加真實(shí)的反應(yīng)介質(zhì)的吸附量。動(dòng)態(tài)吸附曲線如圖7所示。由圖中可知，IN親和介質(zhì)首次使用時(shí)的動(dòng)態(tài)吸附載量Q10%為30.0 mg?mL-1，約為飽和吸附的44.9%。

由Cfa 斷裂內(nèi)含肽所構(gòu)建的新型親和介質(zhì)的載量已接近其他的一些商業(yè)化的親和介質(zhì)，這使得基于Cfa斷裂內(nèi)含肽的親和純化系統(tǒng)有潛在的商業(yè)價(jià)值對(duì)IN親和介質(zhì)分別在酸和堿的條件下進(jìn)行再生，再生液的蛋白濃度如表3，再生后介質(zhì)的動(dòng)態(tài)載量占初始介質(zhì)載量的百分比如圖8。在不同的再生條件下，第2次使用IN介質(zhì)，其動(dòng)態(tài)載量不同。IN在0.1 mol?L-1的NaOH條件下的再生效果最好，其再生液中蛋白含量為29 mg，接近結(jié)合于IN親和介質(zhì)上的IC-GFP-D含量，則可認(rèn)為在0.1 mol?L-1NaOH條件下，IN介質(zhì)再生完全。并且使用0.1 mol?L-1NaOH再生后，在第2次循環(huán)使用中，其動(dòng)態(tài)載量約為第1次的94%。雖然NaOH濃度提升，但再生液中蛋白濃度依然接近介質(zhì)動(dòng)態(tài)載量，而且其第2次使用介質(zhì)后，動(dòng)態(tài)載量顯著降低?？赡茉蚴瞧鋾?huì)使得IN介質(zhì)中的配體蛋白變性，破壞了介質(zhì)的結(jié)構(gòu)，因此動(dòng)態(tài)載量降低。而在酸性條件下，可以看出，再生液中蛋白濃度較低，則表明IN介質(zhì)并未完全再生。因此，IN介質(zhì)在0.1 mol?L-1NaOH的條件下再生。

圖7 IN層析介質(zhì)的動(dòng)態(tài)穿透曲線 Fig.7 Break through curve of the IN resin

表3 不同條件下再生的蛋白含量 Table 3 Protein contents under different regeneration conditions

圖8 不同條件下IN介質(zhì)再生后的載量占再生前的百分比Fig.8 Capacities of the resins as percentages of original after regeneration under different conditions

圖9 IN層析介質(zhì)純化GFP的 層析過(guò)程圖 Fig.9 Chromatogram of the IN resin for GFP purification

3.5 IN親和層析介質(zhì)的應(yīng)用

對(duì)GFP蛋白的親和層析純化過(guò)程圖如圖9所示。A表示穿透峰，B表示靜置反應(yīng)，C表示洗脫峰，D表示再生峰。

收集純化過(guò)程中不同時(shí)間段的流出液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析(圖10)。在純化過(guò)程中，先使用Zn2+抑制內(nèi)含肽的斷裂；再利用EDTA除去Zn2+，DTT誘導(dǎo)使其斷裂[19]。圖10可知，DTT誘導(dǎo)斷裂6 h后，洗脫得到的目的蛋白幾乎不含其他雜質(zhì)。通過(guò)Image J軟件掃描分析上樣的粗蛋白液和洗脫后的目的蛋白的純度，粗蛋白液中目GFP的純度為17.2%。洗脫峰收集的蛋白純度為96.7%，純化倍數(shù)為5.6倍。通過(guò)計(jì)算粗蛋白液及洗脫液的濃度和體積，測(cè)得粗蛋白液中GFP含量為7.5 mg，洗脫液中目的GFP含量為2.2 mg。使用該親和層析介質(zhì)回收率為29.3%。目標(biāo)蛋白回收率較低。從圖中可以看到在穿透液中已經(jīng)有部分GFP蛋白流穿，這可能因?yàn)椋?) 上樣時(shí)的流速較快，使得部分蛋白未來(lái)得及結(jié)合，就已經(jīng)流穿；2) Zn2+雖然可以抑制內(nèi)含肽的斷裂反應(yīng)，但是，這種抑制效果是有限的，對(duì)于斷裂反應(yīng)不能嚴(yán)格控制，使得部分目的蛋白提前斷裂下來(lái)；3) 由于IC-GFP位融合蛋白，其在表達(dá)過(guò)程中就已經(jīng)發(fā)生脫落。因此，使得穿透液中已包含部分目的蛋白，造成了洗脫液中回收率較低。

GFP被洗脫后，通過(guò)0.1 mol?L-1NaOH將親和層析介質(zhì)再生，解離掉與介質(zhì)上IN親和吸附的IC片段，進(jìn)行再次循環(huán)使用。由于 IC片段分子量低，從圖中難以直接觀察。

圖10 IN層析介質(zhì)對(duì)于GFP蛋白純化的SDS-PAGE圖 Fig.10 SDS-PAGE results of the IN resin for GFP protein purification

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建了由Cfa 斷裂內(nèi)含肽所介導(dǎo)的IN親和層析介質(zhì)。研究了非介質(zhì)條件下Cfa斷裂內(nèi)含肽的斷裂反應(yīng)。測(cè)定了該介質(zhì)的動(dòng)態(tài)載量及靜態(tài)載量。并優(yōu)化了介質(zhì)的最佳再生條件。利用Cfa斷裂內(nèi)含肽制備的層析介質(zhì)用于純化GFP能夠獲得96.7% 的純度。IN親和層析介質(zhì)有一定的商業(yè)應(yīng)用價(jià)值。但是，制備的新型介質(zhì)有著回收率較低，斷裂反應(yīng)控制不夠嚴(yán)格等缺點(diǎn)。因此，利用該介質(zhì)在純化蛋白過(guò)程中的條件控制還需要進(jìn)一步研究。

符號(hào)說(shuō)明：

C — 流穿蛋白濃度，mg?mL-1

C0— 上樣蛋白濃度，mg?mL-1

C*— 平衡時(shí)體系中的蛋白濃度，mg?mL-1

Kd— 解離常數(shù)，mg?mL-1

Q10%— 動(dòng)態(tài)吸附載量，mg?mL-1介質(zhì)

Qm—介質(zhì)的飽和吸附載量，mg?mL-1

Q*—介質(zhì)的吸附量，mg?mL-1

Vsolution,10%—?jiǎng)討B(tài)吸附載量，mg?mL-1介質(zhì)

Vabsorbents—純化柱中介質(zhì)的體積，mL