吲哚三甲醇對心肌細(xì)胞脂毒性損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

李 帥，鮑翠玉，李 晶

(湖北科技學(xué)院1. 藥學(xué)院、2. 糖尿病心腦血管病變湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 咸寧 437100)

糖尿病是一種對醫(yī)療保健系統(tǒng)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)影響的發(fā)病率越來越高的代謝性疾病[1]，近年來，糖尿病心血管病變在致病率及致死率方面受到了廣泛關(guān)注[2]，其中，糖尿病性心肌病的高發(fā)生率的防治成為了很多研究的重點(diǎn)內(nèi)容。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制與脂質(zhì)代謝異常相關(guān)[3]，經(jīng)常伴有相關(guān)的脂肪酸代謝失調(diào)。在糖尿病嚙齒動(dòng)物模型和肥胖患者中，盡管出現(xiàn)了高胰島素血癥和高血糖癥，但心肌的損害幾乎完全依賴于脂肪酸的利用，體內(nèi)葡萄糖氧化速率被過量的飽和脂肪酸所抑制，心肌的耗氧加劇，體內(nèi)出現(xiàn)氧化還原失衡，出現(xiàn)過量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，心肌內(nèi)出現(xiàn)脂質(zhì)堆積，導(dǎo)致心肌氧化損傷[4-5]。

吲哚三甲醇屬于如甘藍(lán)、白菜等十字花科蔬菜中的有效成分，在胃酸中吲哚三甲醇可以轉(zhuǎn)化成一系列寡聚物如3，3′-二吲哚甲烷，最終在體內(nèi)發(fā)揮生物效用。據(jù)報(bào)道，吲哚三甲醇具有抗腫瘤作用，其作用機(jī)制涉及到很多通路[6]。但吲哚三甲醇對心肌細(xì)胞脂毒性損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制目前尚無報(bào)道?；诖耍狙芯繉⒁訟MPK信號通路為切入點(diǎn)，探討吲哚三甲醇對心肌細(xì)胞脂毒性損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑 AMPKα(#2532)、p-AMPKα(Thr172，#2535)、mTOR(#2972)、p-mTOR(Thr172，#2971)、p70S6K(#9202)、p-p70S6K(Thr389，#9206)、Bcl-2(#15071)、Bax(#5023)、cleaved caspase-3(#9661)、β-actin(#3700)抗體，購自美國CST公司；棕櫚酸(palmitic acid，PA，#292125)、吲哚三甲醇(#17256)，購自美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基，購自美國HyClone公司；胎牛血清，購自浙江天杭生物科技股份有限公司；BCA蛋白定量試劑盒，購自VazymE公司；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，購自貝博生物；活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒，購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；MTT檢測試劑盒，購自碧云天公司。H9c2大鼠心肌細(xì)胞，購自上海通派生物有限公司。

1.1.2儀器 恒溫空氣浴搖床(上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；超凈工作臺(蘇州凈化公司)；細(xì)胞CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)；CKX41倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；電泳槽、電轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(英國Syngene公司)。

1.2 方法

1.2.1PA及吲哚三甲醇的配制 用0.1 mol·L-1的NaOH溶液，在70 ℃水浴中溶解一定量的PA，振蕩混勻10 min，過濾，配成100 mmol·L-1的PA儲存液。在55 ℃水浴中，用去離子水配制50 g·L-1的牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)溶液，過濾。用PA儲存液和BSA溶液制備混合液，體積比值為1 ∶ 19，經(jīng)振蕩和水浴后，室溫下冷卻過濾后，用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋制備工作液。吲哚三甲醇則溶解于DMSO，使母液濃度達(dá)到100 mmol·L-1，使用前將其融于DMEM(含血清、雙抗)達(dá)到工作液濃度，渦旋混勻后使用。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) DMEM培養(yǎng)基中加入雙抗、10%胎牛血清，用于培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞的貼壁密度處于70%～80%時(shí)，用含有0.25% EDTA的胰酶輕輕吹打消化、傳代至所需培養(yǎng)皿中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3MTT檢測細(xì)胞增殖 實(shí)驗(yàn)分組：① PA濃度梯度:control組(空白對照組加入同等體積的PBS)、PA(0.1、0.2、0.4、0.8 mmol·L-1)刺激24 h組，進(jìn)行MTT檢測。② PA時(shí)間梯度:control組(空白對照組加入同等體積的PBS)、PA(0.4 mmol·L-1)刺激0、12、24、48 h組，進(jìn)行MTT檢測。③ 吲哚三甲醇作用實(shí)驗(yàn)：control組(空白對照組加入同等體積的PBS)、PA 0.4 mmol·L-1組、PA 0.4 mmol·L-1+吲哚三甲醇50 μmol·L-1組、PA 0.4 mmol·L-1+吲哚三甲醇100 μmol·L-1組、PA 0.4 mmol·L-1+吲哚三甲醇200 μmol·L-1組、吲哚三甲醇200 μmol·L-1組，含吲哚三甲醇培養(yǎng)基預(yù)處理1 h后吸出培養(yǎng)基，再加入含PA+吲哚三甲醇的培養(yǎng)基。④吲哚三甲醇濃度梯度:control組(空白對照組加入同等體積的PBS)、吲哚三甲醇(25、50、100、200 μmol·L-1)刺激24 h組，進(jìn)行MTT檢測。

MTT檢測采用96孔板接種細(xì)胞，細(xì)胞密度為每毫升1×106個(gè)，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后給藥，進(jìn)行孵育，每孔加入20 μL MTT(5 g·L-1)，在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4 h，吸除上清，每孔加入 150 μL DMSO，振蕩混勻后，用酶標(biāo)儀檢測570 nm處的各孔OD值。細(xì)胞增殖率/%=OD處理孔/OD陰性對照孔×100%。

1.2.4ROS水平檢測 ROS水平檢測采用6孔板接種細(xì)胞，分為以下幾組：control組、PA 0.4 mmol·L-1組、PA 0.4 mmol·L-1+吲哚三甲醇50 μmol·L-1組、PA 0.4 mmol·L-1+吲哚三甲醇100 μmol·L-1組、PA 0.4 mmol·L-1+吲哚三甲醇200 μmol·L-1組、吲哚三甲醇200 μmol·L-1組，含吲哚三甲醇培養(yǎng)基預(yù)處理1 h后吸出培養(yǎng)基，再加入含PA+吲哚三甲醇的培養(yǎng)基。分組給藥后，在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱放置24 h，加入PBS后洗滌5 min，重復(fù)3次后，每孔加入DHE(10 mmol·L-1)，在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱放置30 min，加入PBS后洗滌5 min，重復(fù)3次后，熒光顯微鏡的激發(fā)波長設(shè)置為480～535 nm，發(fā)射波長設(shè)置為590～610 nm，并用ImageJ 1.41分析軟件選取5個(gè)不同的視野進(jìn)行平均熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5細(xì)胞凋亡檢測 采用6孔板接種細(xì)胞，分為以下幾組：control組、PA 0.4 mmol·L-1組、PA 0.4 mmol·L-1+吲哚三甲醇50 μmol·L-1組、PA 0.4 mmol·L-1+吲哚三甲醇100 μmol·L-1組、PA 0.4 mmol·L-1+吲哚三甲醇200 μmol·L-1組、吲哚三甲醇200 μmol·L-1組，含吲哚三甲醇培養(yǎng)基預(yù)處理1 h后吸出培養(yǎng)基，再加入含PA+吲哚三甲醇的培養(yǎng)基。分組給藥后，在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱放置24 h，加入PBS后洗滌5 min，重復(fù)3次后，每孔加入4%多聚甲醛，固定10 min后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5 min。每孔加入400 μL Annexin V-FITC 結(jié)合液，再向每孔加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱等待10 min，加入PBS后洗滌5 min，重復(fù)3次后進(jìn)行封片，用熒光顯微鏡檢測熒光，F(xiàn)ITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

1.2.6免疫印跡法檢測蛋白表達(dá) 細(xì)胞凋亡檢測采用培養(yǎng)皿接種細(xì)胞，分為以下幾組：control組、PA 0.4 mmol·L-1組、PA 0.4 mmol·L-1+吲哚三甲醇50 mmol·L-1組、PA 0.4 mmol·L-1+吲哚三甲醇100 μmol·L-1組、PA 0.4 mmol·L-1+吲哚三甲醇200 μmol·L-1組、吲哚三甲醇200 μmol·L-1組，含吲哚三甲醇培養(yǎng)基預(yù)處理1 h后吸出培養(yǎng)基，再加入含PA+吲哚三甲醇的培養(yǎng)基。分組給藥后，在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱放置24 h，加入PBS后洗滌5 min，重復(fù)3次后，每皿細(xì)胞進(jìn)行裂解，將細(xì)胞刮下，離心收集沉淀，蛋白含量檢測采用BCA試劑盒。定量后，取20 μL的蛋白樣品進(jìn)行上樣，采用5%～15%的SDS-PAGE分離膠進(jìn)行蛋白電泳，采用PVDF膜進(jìn)行2 h轉(zhuǎn)模，室溫下采用5%的脫脂奶粉進(jìn)行1 h的封閉，4 ℃下加入一抗孵育24 h，加入PBS后洗滌5 min，重復(fù)3次后，室溫下加入HRP標(biāo)記的二抗孵育1 h，用ECL化學(xué)發(fā)光顯影，然后凝膠成像系統(tǒng)檢測AMPKα、p-AMPKα、mTOR、p-mTOR、p70S6K、p-p70S6K、β-actin的表達(dá)水平，以及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 吲哚三甲醇對高脂誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖能力低下的影響體外培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞，用含PA(0.1、0.2、0.4、0.8 mmol·L-1)的DMEM培養(yǎng)基刺激24 h。如Fig 1A所示，心肌細(xì)胞增殖率隨著PA濃度的增加呈現(xiàn)下降趨勢，PA濃度在0.4 mmol·L-1時(shí)，降低明顯(P<0.05)。Fig 1B結(jié)果顯示，含PA 0.4 mmol·L-1的DMEM培養(yǎng)基刺激細(xì)胞0、12、24、48 h后，心肌細(xì)胞增殖率隨著PA刺激時(shí)間的延長呈現(xiàn)下降趨勢，尤其在24 h時(shí)，細(xì)胞增殖率開始明顯降低(P<0.05)。因此，我們將PA濃度定為0.4 mmol·L-1，刺激時(shí)間24 h開展下一步實(shí)驗(yàn)。如Fig 1C所示，PA組心肌細(xì)胞增殖率明顯下降，隨著預(yù)處理的吲哚三甲醇濃度的升高，PA+吲哚三甲醇組的細(xì)胞增殖率呈現(xiàn)濃度依賴性升高趨勢。尤其吲哚三甲醇在200 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞增殖率明顯恢復(fù)至正常水平，同時(shí)如Fig 1D所示，心肌細(xì)胞增殖率并未隨著吲哚三甲醇濃度的增加呈現(xiàn)下降趨勢。因此在下一步實(shí)驗(yàn)中吲哚三甲醇濃度設(shè)置為200 μmol·L-1。

2.2 吲哚三甲醇對高脂誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞內(nèi)ROS水平及凋亡水平的影響如Fig 2所示，PA組的紅色熒光明顯增強(qiáng)，而PA+吲哚三甲醇組的紅色熒光明顯弱于PA組，接近正常組。如Fig 3所示，0.4 mmol·L-1PA刺激24 h后，細(xì)胞內(nèi)Annexin V-FITC標(biāo)記的綠色熒光及PI 標(biāo)記的紅色熒光明顯增強(qiáng)，而吲哚三甲醇預(yù)處理組可以明顯逆轉(zhuǎn)上述熒光改變。

Fig 1 Viability of H9c2 cells treated with PA alone or combination of PA and indole-3-carbinol

A:Concentration-dependent cell damage induced by PA at 24 h stimulation time.*P<0.05vs0 mmol·L-1group. B:Time-dependent cell damage induced by PA at 0.4 mmol·L-1concentration.*P<0.05，**P<0.01vs0 h group. C:Viability of cells treated with varied drugs (culture time:24 h).*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPA group. D:Concentration-dependent cell damage induced by indole-3-carbinol at 24 h stimulation time.

Fig 2 Effect of indole-3-carbinol on PA-induced cardiomyocyte oxidative damage(scale bar:50 μm)

A:The intracellular level of ROS in H9c2 was estimated by DHE，a fluorescent probe; B:Fluorescence intensity of DHE.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPA group.

Fig 3 Effect of indole-3-carbinol on PA-induced cardiomyocyte apoptosis(scale bar:50 μm)

The intracellular apoptosis level in H9c2 was estimated by Annexin V-FITC/PI labelled fluorescent probe.

2.3 吲哚三甲醇對高脂誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞AMPK及凋亡通路的影響如Fig 4A所示，用含0.4 mmol·L-1PA的DMEM培養(yǎng)基刺激H9c2心肌細(xì)胞24 h時(shí)，p-AMPKα表達(dá)明顯下降(P<0.05)，而p-mTOR、p-p70S6K蛋白表達(dá)明顯升高；預(yù)處理吲哚三甲醇組可以明顯逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞內(nèi)高脂誘導(dǎo)的p-AMPKα蛋白的降低及p-mTOR、p-p70S6K蛋白表達(dá)的升高(P<0.05)。如Fig 4B所示，用含0.4 mmol·L-1PA的DMEM培養(yǎng)基刺激H9c2心肌細(xì)胞24 h時(shí)，Bcl-2水平明顯下降(P<0.05)，而Bax、cleaved caspase-3表達(dá)均明顯升高(P<0.05)。而預(yù)處理吲哚三甲醇組可以明顯逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞內(nèi)高脂誘導(dǎo)的Bcl-2蛋白表達(dá)的降低及Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的升高(P<0.05)。

3 討論

1972年，Rubler等在無明顯冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的糖尿病患者中觀察到一種心肌病。1974年，Hamby等通過病理研究，提出了糖尿病心肌病的概念，它是糖尿病引起心臟微血管病變和心肌代謝紊亂所致的心肌廣泛局灶性壞死，早期通常表現(xiàn)為心肌順應(yīng)性降低和舒張期充盈受阻為主的舒張功能不全，晚期以收縮功能不全為主，易發(fā)生充血性心力衰竭，是一種獨(dú)立的原發(fā)病，其發(fā)病不依賴于高血壓、冠狀動(dòng)脈疾病。

Fig 4 Effect of indole-3-carbinol on expression of AMPK/p70S6K pathway-related proteins(A) and apoptosis-related proteins(B) in cardiomyocytes induced by

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPA group.

糖尿病心肌病的發(fā)病因素較多，其中高脂毒性是重要原因之一[7]。高脂毒性是指血游離脂肪酸水平增高[8-9]，超過脂肪組織的儲存能力和非脂肪組織對游離脂肪酸的氧化能力，以三酰甘油的形式在脂肪組織、非脂肪組織過度沉積，引起脂質(zhì)異位貯存。血游離脂肪酸高水平上調(diào)數(shù)分鐘，就可使細(xì)胞的葡萄糖攝入、利用及糖原合成減少，可損害胰島素受體信號通路的活性，激活炎癥因子，引起胰島素抵抗，促進(jìn)血胰島素水平升高；可使線粒體產(chǎn)生ROS增多，激活終末糖基化產(chǎn)物通路、PKC通路、己糖胺通路等，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，高脂血癥可以導(dǎo)致心肌脂質(zhì)沉積、心室壁增厚、心室重構(gòu)、心臟收縮功能降低。本研究證實(shí)，高脂可以誘發(fā)心肌細(xì)胞增殖率明顯下降，而吲哚三甲醇可以明顯逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞脂毒性損傷。

心肌脂毒性損傷的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與多條信號通路相關(guān)，尤其是AMPK相關(guān)通路已成為近年來的研究熱點(diǎn)[10-12]。機(jī)體存在氧化-抗氧化的平衡機(jī)制，基于此，我們檢測了心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的生成和凋亡水平，發(fā)現(xiàn)高脂可以明顯增加心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，并促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，而吲哚三甲醇預(yù)處理可以明顯逆轉(zhuǎn)高脂誘導(dǎo)的上述指標(biāo)的變化。提示吲哚三甲醇可以明顯抑制高脂誘發(fā)的細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激。AMPK屬于關(guān)鍵的能量傳感器，據(jù)報(bào)道，2型糖尿病病人的骨骼肌中，磷酸化的AMPK表達(dá)明顯下降[13]。可見，AMPK的激活對慢性病的防治具有重要意義。mTOR及p70S6K屬于AMPK信號的下游特異性蛋白，AMPK磷酸化的抑制及mTOR、p70S6K磷酸化的增強(qiáng)，被視作疾病對AMPK通路調(diào)控機(jī)制之一[14-15]。本研究結(jié)果提示，高脂刺激組心肌細(xì)胞內(nèi)p-AMPKα的表達(dá)明顯降低，p-mTOR及p-p70S6K蛋白的表達(dá)明顯升高，而吲哚三甲醇預(yù)處理可以明顯逆轉(zhuǎn)高脂所致的p-AMPKα蛋白的表達(dá)降低及p-mTOR、p-p70S6K蛋白的表達(dá)升高。這些結(jié)果表明，吲哚三甲醇可以調(diào)控細(xì)胞內(nèi)AMPK信號通路，保護(hù)心肌細(xì)胞出現(xiàn)脂毒性損傷。本研究結(jié)果還提示，高脂誘發(fā)心肌細(xì)胞促凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3的表達(dá)明顯升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯降低，而吲哚三甲醇明顯逆轉(zhuǎn)高脂所致心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，吲哚三甲醇能成功逆轉(zhuǎn)高脂所致的心肌細(xì)胞增殖力下降，緩解氧化應(yīng)激損傷，通過調(diào)控AMPK信號通路，最終減少心肌細(xì)胞凋亡，起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用，目前吲哚三甲醇對心肌細(xì)胞脂毒性損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制國內(nèi)外尚無報(bào)道，本研究為吲哚三甲醇治療心肌細(xì)胞脂毒性損傷奠定了理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。