小鼠子宮中TRPC6通道在離體子宮收縮中的作用

馮 娜，呂偉禎，陳興娟

(1. 天津市東麗區(qū)東麗醫(yī)院藥劑科， 天津 300300；2. 西北工業(yè)大學醫(yī)學研究院，陜西 西安 070012)

子宮過度收縮與年輕女性的原發(fā)性月經痛和孕婦的早產密切相關。據(jù)統(tǒng)計，在年輕女性中需要使用藥物來減輕原發(fā)性痛經疼痛的比率高達55%[1]；孕婦早產的發(fā)生率在5%～15%之間[2]。子宮的收縮依靠肌層平滑肌的收縮。子宮平滑肌的收縮機制和分子通路與其它平滑肌相似——包括Ca2+的調控、肌動蛋白與肌球蛋白的相互作用等。Ca2+作為細胞的第二信使，參與許多重要的生命活動，如細胞收縮、代謝、分泌和分化等。平滑肌細胞的Ca2+濃度的變化在子宮收縮過程中具有關鍵性的調控作用。其中細胞外Ca2+通過鈣離子通道內流是平滑肌細胞升高胞內Ca2+濃度的重要途經，與子宮平滑肌層收縮密切相關[3]。

經典瞬時感受器電位通道6(transient receptor potential canonical 6, TRPC6)是一種對Ca2+具有通透性的非選擇性陽離子通道。TRPC6通道可以被細胞內的第二信使二乙酰甘油(DAG)直接激活，而DAG來自于受體激活PLC水解PIP2而來，因此TRPC6屬于受體門控通道(receptor-operated channel, ROC)[4]。研究證據(jù)表明，TRPC6通道蛋白在腦組織，含有平滑肌的組織、腎臟組織以及一些免疫細胞中均有分布，并參與相關的生理活動[5-8]。盡管在平滑肌細胞中，引起收縮的Ca2+內流主要是通過細胞膜去極化激活電壓依賴性鈣離子通道來實現(xiàn)的，但是近年來一些研究表明TRPC6通道在血管平滑肌收縮過程中發(fā)揮重要作用，包括小血管、主動脈血管和肺動脈血管等[9]。而在子宮平滑肌層TRPC6通道蛋白也有明顯的分布，那么TRPC6通道在子宮收縮過程中扮演怎樣角色？

本研究以小鼠離體子宮為研究對象，使用藥理實驗技術和基因敲除技術，研究TRPC6通道在小鼠離體子宮收縮過程中的作用；并進一步分離小鼠子宮平滑肌細胞，在細胞水平驗證TRPC6介導的Ca2+內流在子宮收縮過程中作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物本研究使用TRPC6-KO小鼠的種鼠購自Jackson Lab(Stock #37345-JAX)，實驗使用的2～4個月小鼠，♀，體質量(20±2)g，在西北工業(yè)大學SPF級動物房由種鼠繁殖而來。由于TRPC6-KO小鼠的基因背景是C57BL/6和129S小鼠雜交，因此對照實驗中的野生型小鼠(wildtype， WT)是野生型C57BL/6和129S小鼠雜交的第二代。C57BL/6和129S小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK(京)2016-0006。使用異氟醚吸入麻醉小鼠后，斷頭處死。取出小鼠的子宮，清理子宮周圍的結締組織和脂肪。將子宮組織從子宮角的中部開始切割成3 mm長的子宮小環(huán)。小鼠子宮角的近端部分用于所有實驗。按照參考文獻所述，在取出子宮之前通過檢查PBS沖洗陰道液中的細胞含量和形態(tài)來確定小鼠發(fā)情周期階段[10]。

1.2 藥物與溶液標準Krebs緩沖液(單位：mmol·L-1)：130 NaCl、5 KCl、2 CaCl2、1.2 NaH2PO4、0.56 MgCl2、25 NaHCO3和5葡萄糖。70 mmol·L-1KCl溶液含有(單位：mmol·L-1)：65 NaCl、70 KCl、2 CaCl2、1.2 NaH2PO4、0.56 MgCl2、25 NaHCO3和5葡萄糖。

鈣成像和膜片鉗的細胞外液(單位：mmol·L-1)：145 NaCl，2.5 KCl，1.2 CaCl2、1 MgCl2、10 HEPES和5葡萄糖(用NaOH調節(jié)pH 7.2)。

OT，美國Sigma公司，批號：03251；His，美國Sigma公司，批號：59964。

1.3 等張張力檢測將子宮小環(huán)安裝在兩個平行支撐金屬絲上：一個起固定作用，另一個連接張力轉換器(FSG-01張力傳感器)。開始等張張力測試之前將子宮小環(huán)置于充滿6 mL Krebs液體的恒溫浴槽(37 °C，TSZ-04離體組織灌流系統(tǒng))中。通過調節(jié)金屬絲的位置給予每個實驗子宮小環(huán)約0.5 g的負荷[11]。在Krebs液中平衡30 min至1 h，待子宮收縮平穩(wěn)，開始實驗，使用Digidata 1440數(shù)字轉化儀記錄子宮小環(huán)的收縮。在記錄收縮力的同時，將所有藥物直接添加到組織浴中。本實驗使用了離體的子宮小環(huán)而不是切開的子宮條去觀察子宮的收縮，一定程度保持子宮的完整。另外我們之前的實驗結果顯示子宮條和子宮小環(huán)對催產素(oxytocin，OT)的反應沒有明顯的區(qū)別。

1.4 細胞培養(yǎng)子宮平滑肌的分離培養(yǎng)： 將分離的子宮角縱向切開，在解剖顯微鏡下去除內膜層，將肌層剪碎。移置含有collagenase P (1 g·L-1)，0.2 mmol·L-1CaCl2和0.125% BSA的消化液中，37 ℃消化40 min。吹打消化液至看不見明顯的組織塊，過濾移除沒有消化的子宮組織。用PBS清洗消化下來的子宮平滑肌細胞，培養(yǎng)過夜后用于鈣成像實驗。

過表達TRPC6通道的HEK細胞：使用Lipofectamine 3000 reagent (Invitrogen)，將TRPC6和H1受體的cDNA質粒轉染進入HEK細胞中，24 h后用于膜片鉗記錄TRPC6電流。

1.5 鈣成像和膜片鉗將培養(yǎng)過夜的子宮平滑肌細胞用PBS洗3遍后，加入4 μmol·L-1Fura-2AM，室溫放置1 h，使細胞充分負載鈣離子熒光染料。隨后使用PBS洗去溶液中的染料。使用Till-Photonics單細胞熒光成像系統(tǒng)檢測細胞內鈣離子濃度的變化。使用熒光信號比(F345/F380)的變化指示鈣離子濃度的變化。使用細胞外高鉀溶液(140 mmol·L-1KCl)使細胞膜去極化，只有給予高鉀溶液后引起胞內鈣離子升高的細胞用于實驗分析。

用Axopatch 200B放大器和Digidata 1550a數(shù)字化儀記錄全細胞膜片鉗模式下的TRPC6電流。pClamp 10軟件包用于采集控制和數(shù)據(jù)分析。在60 mV的鉗制電壓下，以2 s的間隔給與-100～100 mV的電壓刺激。TRPC6電流通過10 μmol·L-1的組胺(histamine， His)溶液激活。

1.6 PCR檢測TRPC6-KO小鼠基因型取小鼠耳朵小片組織置于含有125 μL裂解液(NaOH=25 mmol·L-1， EDTA=0.2 mmol·L-1，pH12 中90 ℃水浴中45 min，冷卻后，加入等體積的中和液(Tris HCl=40 mmol·L-1)。離心后，上清用于PCR。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設計合成，TRPC6的引物信息：野生型 WT-F 5′-TCT TTATGCAATCGCTGTGG-3′和WT-R 5′-GCTAGTCTTCCTGCAATCCA-3′?；蚯贸蚆UT-F 5′-TCTATTAACACTCAACTGGCACCT-3′和 MUT-R 5′-GCCAGAGGCCACTTGTGTAG-3′。PCR產物用于鑒定小鼠的基因型:Trpc6-/-175 bp 和WT 378 bp。

2 結果

2.1 TRPC6通道抑制劑對OT宮縮作用的影響Fig 1A所示，小鼠子宮小環(huán)在Krebs液中穩(wěn)定30～60 min后，收縮逐漸平穩(wěn)，向浴液中加入OT后，引起子宮組織強烈的收縮，并且隨著濃度的增加收縮逐漸增強。溶劑對照組(DMSO)中100 nmol·L-1OT引起收縮強度倍數(shù)增加為(13.2±4.0，n=7), 而Pyr10組，增加的倍數(shù)為(5.0±2.1，n=8)，P<0.05.說明TRPC通道抑制劑Pyr10(10 μmol·L-1)明顯抑制OT引起的子宮收縮(Fig 1B)。

為進一步明確TRPC6在子宮收縮中的作用，在實驗中使用特異性抑制TRPC6通道的Larixyl(10 μmol·L-1)[13]。Fig 1C 的結果顯示，Larixyl對OT的收縮作用也有明顯的抑制作用(增加的倍數(shù)為5.6±2.5，n=5)。本實驗研究結果表明，TRPC6通道抑制劑對離體小鼠子宮自發(fā)性的收縮沒有明顯的影響，但是明顯抑制了OT引起的子宮收縮，并且抑制作用在高濃度OT(100 nmol·L-1)下更明顯。

2.2 TRPC6-KO小鼠離體子宮的收縮因為研究中使用的TRPC6-KO小鼠是表達不具功能的TRPC6通道蛋白，因此使用商品的TRPC6通道蛋白抗體不能鑒別TRPC6-KO小鼠。因此使用Jackson Lab推薦protocol，用PCR來鑒定。PCR結果(Fig 2A)顯示TRPC6-KO小鼠TRPC6基因為mutant型。如Fig 2B所示，OT引起TRPC6-KO (n=7)小鼠子宮的收縮張力的變化明顯小于野生型(WT，n=5)小鼠。而在TRPC6-KO的小鼠子宮上，抑制劑larixyl(10 μmol·L-1)抑制OT(100 nmol·L-1)引起子宮收縮的作用明顯減弱(Fig 2C)。結果進一步表明TRPC6通道參與OT引起的小鼠子宮的收縮。

2.3 TRPC6通道對OT引起小鼠離體子宮收縮張力-時間的影響在浴液中加入OT后，離體子宮小環(huán)在開始出現(xiàn)強烈的收縮，而后收縮比較均勻平穩(wěn)，但是隨著時間的延長子宮小環(huán)的收縮會逐漸降低(Fig 3C)。但在TRPC6-KO 小鼠子宮環(huán)上，OT引起收縮張力隨時間延長，降低的速度要比WT緩慢(Fig 3A)。Fig 3B中對OT刺激后子宮每5 min平均收縮張力進行統(tǒng)計，連續(xù)統(tǒng)計4個時段。統(tǒng)計結果表明OT刺激后10 min后，WT子宮小環(huán)收縮明顯減弱(n=5，第四個5 min與最初5 min平均收縮力的比值為0.23±0.06)，而TRPC6-KO子宮小環(huán)收縮減弱的幅度明顯比較小(n=7，第四個5 min與最初5 min平均收縮力的比值為0.69±0.02)。TRPC6通道可以被GPCR-PLC通路生產的DAG直接激活，但是，如Fig 3D所示，過表達H1受體和TRPC6通道的HEK細胞上，His(10 μmol·L-1)誘發(fā)的TRPC6通道電流在達到最大值后，即使繼續(xù)給予His刺激，電流幅度逐漸開始衰減[4]。因此OT縮宮作用衰減在TRPC6-KO子宮上有所緩解可能與TRPC6通道功能喪失有關。

Fig 1 OT-induced uterine contractions inhibited by Pyr10 and Larixyl A: DMSO; B: Pyr10; C: Larixyl; D: Summary data. *P<0.05 vs DMSO

2.4 OT引起的TRPC6-KO小鼠子宮平滑肌細胞鈣離子濃度變化的特征在分離的小鼠子宮平滑肌細胞上，可以清楚看到100 nmol·L-1OT引起細胞內鈣離子濃度明顯的升高，相應的，升高的細胞內鈣離子濃度隨著時間的延長開始下降(Fig 4A)。對WT和TRPC6-KO兩組小鼠子宮平滑肌細胞的鈣離子濃度在受到OT刺激后隨時間衰減的時程曲線進行Exponential(standard)擬合。用tau值來表示衰減速度。如Fig 4B所示，TRPC6-KO組tau值(s)明顯高于WT組(TRPC6-KO：68.7±12.3，n=10 vs WT: 38.8 ±11.8,n=8)。

3 討論

OT可以引起小鼠離體子宮強烈的收縮，是體外模擬痛經子宮強烈收縮常用的工具藥物。研究結果表明，痛經的年輕女性體內OT水平明顯高于沒有痛經的女性[14]。OT收縮子宮的作用主要是通過激活OT受體實現(xiàn)的。當OT受體被激活后由第二信使介導，通過平滑肌細胞膜上的鈣離子通道介導的鈣離子內流，和細胞內鈣庫釋放鈣離子升高細胞內游離鈣離子濃度，從而引發(fā)宮縮。在這一過程中參與鈣離子內流的鈣離子通道主要包括電壓依賴性鈣離子通道和受體激活通道等。本研究所感興趣的TRPC6通道是受體調控的，對鈣離子據(jù)有通透性的通道之一。研究表明TRPC6在參與了血管平滑肌收縮的過程[9]。本文的結果表明，TRPC6通道的抑制劑對子宮自發(fā)性的收縮沒有明顯的影響，而比較明顯抑制了OT引起的子宮的強烈的收縮?？赡苁荰RPC6通道在OT受體被激活時才打開，進而介導鈣離子內流，參與子宮的收縮。因此，TRPC6通道抑制劑的解痙作用可能會緩解子宮強烈收縮引起的痛經。

Fig 2 Uterine contractions of TRPC6-KO mice

A: PCR; B: Summary of OT-induced TRPC6-KO mouse uterine contractions; C: Effects of DMSO and Larixyl on OT-induced TRPC6-KO mouse uterine contractions.*P<0.05vsWT

Fig 3 OT-induced uterine contraction in WT and TRPC6-KO mice

A: Represent uterine contraction traces from WT and TRPC6-KO mouse; B: Time-effect curves of WT and TRPC6-KO uterine contractions: the effect was presented by the ratio of each area under curve every five minutes and the first 5 minutes’; C: Histamine (His) induced TRPC6 current trace on HEK cells;D：Time trace of histamine induced TRPC6 current in HEK cells. The insert shows the sample current trace of current-voltage relationships acquired during the voltage ramps from -100mV to + 100 mV in HEK cells with TRPC6 overexpressing.**P<0.01vsWT

Fig 4 Fig 4. OT induces intracellular calcium signals in WT and TRPC6-KO uterine smooth muscle cells

A: Represent time-F345/F380 traces; B: Summary data comparing the decay time constants (tau, s) for the Ca2+transients shown in (A).*P<0.05vsWT

OT的作用比較迅速，給藥后很短時間就引起子宮的強烈收縮，但是隨時間的延長，縮宮作用逐漸衰減。然而，TRPC6通道功能喪失后，OT縮宮作用的衰減變得緩慢。TRPC6通道電流被受體激活后也存在衰減，這與通道和受體自身的磷酸化以及胞內鈣離子濃度升高有關[4]。結合TRPC6通道激活電流的特征和本文實驗結果推測，OT縮宮作用隨時間的衰減可能與TRPC6通道電流的減小有關。但是值得注意的是，TRPC6功能喪失，OT縮宮作用的衰減減慢，但是依然存在。表明這是一個復雜的過程，可能有多種機制參與其中，包括OT受體的下調等，其它參與機制還有待進一步研究。