和厚樸酚對高脂所致心肌細胞氧化應(yīng)激損傷的保護作用及其與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-線粒體凋亡通路的相關(guān)性

黃家喜，李 晶，鮑翠玉

(湖北科技學院1. 藥學院、2. 糖尿病心腦血管病變湖北省重點實驗室，湖北 咸寧 437100)

2017年，國際糖尿病聯(lián)盟公布了一組數(shù)據(jù)，目前全球共有4.25億成人糖尿病患者。中國成人糖尿病患者人數(shù)高達1.14億，位居世界第一，占總數(shù)的1/4以上。中國糖尿病的患病率也很驚人，2017年中國糖尿病患病率為10.9%，略低于美國(13%)。糖尿病性心肌病是一種發(fā)生于糖尿病患者，不能用高血壓性心臟病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病及其他心臟病變來解釋的心肌疾病[1-3]。據(jù)報道[4-5]，脂毒性在糖尿病早期就對心肌產(chǎn)生不良影響，其危害明顯大于糖毒性。目前，有研究表明脂毒性心肌損傷與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)或線粒體凋亡通路之間存在一定聯(lián)系[6-7]。

和厚樸酚屬于烯丙基和羥基引入苯環(huán)上的聯(lián)苯類化合物[8-10]，據(jù)報道，和厚樸酚是在糖脂代謝、保肝護肝、氧化應(yīng)激等方面的功效與機制研究逐漸受到關(guān)注。但和厚樸酚對心肌細胞脂毒性損傷的保護作用及其機制目前尚無報道?；诖耍狙芯繉⒁訣RS-線粒體凋亡通路為切入點，探討和厚樸酚對心肌細胞脂毒性損傷的保護作用及其與ERS-線粒體凋亡通路的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑 GRP78(#3177)、CHOP(#2895)、PERK(#5683)、pPERK(#3179)、Bcl-2(#15071)、Bax(#5023)、cleaved caspase-3(#9661)、β-actin(#3700)抗體購自美國CST公司；IRE1(ab37073)、p-IRE1(ab124945)抗體購自美國Abcam公司；棕櫚酸(palmitic acid，PA，#292125)、和厚樸酚(#4914)購自美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基，購自美國HyClone公司；胎牛血清，購自浙江天杭生物科技股份有限公司；BCA蛋白定量試劑盒，購自VazymE公司；活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒試劑盒購自貝博生物；MTT檢測試劑盒及線粒體膜電位檢測試劑盒購自碧云天公司。H9c2大鼠心肌細胞，購自上海通派生物有限公司。

1.1.2儀器 恒溫空氣浴搖床(上海福瑪實驗設(shè)備有限公司)；超凈工作臺(蘇州凈化公司)；細胞CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)；CKX41倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；電泳槽、電轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司)；多功能酶標儀(美國Bio-Tek公司)；化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(英國Syngene公司)。

1.2 方法

1.2.1PA及和厚樸酚的配制 用0.1 mol·L-1的NaOH溶液，在70 ℃水浴中溶解一定量的PA，振蕩混勻10 min，過濾，配成100 mmol·L-1的PA儲存液。在55 ℃水浴中，用去離子水配制50 g·L-1的牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)溶液，過濾。用PA儲存液和BSA溶液制備混合液，體積比值為1 ∶ 19，經(jīng)振蕩和水浴后，室溫下冷卻過濾后，用細胞培養(yǎng)基稀釋制備工作液。和厚樸酚則溶解于DMSO，使母液濃度達到100 mmol·L-1，使用前將其融于DMEM(含血清、雙抗)達到工作液濃度，渦旋混勻后使用。

1.2.2細胞培養(yǎng) DMEM培養(yǎng)基中加入雙抗、10%胎牛血清，用于培養(yǎng)H9c2心肌細胞，當細胞的貼壁密度處于70%～80%時，用含有0.25% EDTA的胰酶輕輕吹打消化、傳代至所需培養(yǎng)皿中進行實驗。

1.2.3實驗分組 1)MTT實驗分組： ① PA濃度梯度: control組(空白對照組加入同等體積的PBS)、PA(0.1、0.2、0.4、0.8 mmol·L-1)刺激24 h組，進行MTT檢測。② PA時間梯度: control組(空白對照組加入同等體積的PBS)、PA(0.4 mmol·L-1)刺激0、12、24、48 h組，進行MTT檢測。③ 和厚樸酚作用實驗：control組(空白對照組加入同等體積的PBS)、PA 0.4 mmol·L-1組、PA 0.4 mmol·L-1+和厚樸酚5 μmol·L-1組、PA 0.4 mmol·L-1+和厚樸酚10 μmol·L-1組、PA 0.4 mmol·L-1+和厚樸酚20 μmol·L-1組、和厚樸酚20 μmol·L-1組，含和厚樸酚培養(yǎng)基預處理1 h后吸出培養(yǎng)基，再加入含PA+和厚樸酚的培養(yǎng)基。2)試劑盒及免疫印跡實驗分組：Control組、PA 0.4 mmol·L-1組、PA 0.4 mmol·L-1+和厚樸酚5 μmol·L-1組、PA 0.4 mmol·L-1+和厚樸酚10 μmol·L-1組、PA 0.4 mmol·L-1+和厚樸酚20 μmol·L-1組、和厚樸酚20 μmol·L-1組，含和厚樸酚培養(yǎng)基預處理1 h后吸出培養(yǎng)基，再加入含PA+和厚樸酚的培養(yǎng)基。

1.2.4MTT檢測細胞增殖 MTT檢測采用96孔板接種細胞，細胞密度為1×106個/孔，培養(yǎng)24 h后給藥，進行孵育，每孔加入20 μL MTT(5 g·L-1)，在37 ℃細胞培養(yǎng)箱孵育4 h，吸除上清，每孔加入 150 μL DMSO，振蕩混勻后，用酶標儀檢測570 nm處的各孔OD值。細胞增殖率/%=OD處理孔/OD陰性對照孔×100%。

1.2.5ROS水平檢測 ROS水平檢測采用6孔板接種細胞，分組給藥后，在37 ℃細胞培養(yǎng)箱放置24 h，加入PBS后洗滌5 min，重復3次后，每孔加入DHE(10 mmol·L-1)，在37 ℃細胞培養(yǎng)箱放置30 min，吸除上清，加入PBS后洗滌5 min，重復3次后，熒光顯微鏡的激發(fā)波長設(shè)置為480～535 nm，發(fā)射波長設(shè)置為590～610 nm，并用ImageJ 1.41軟件分析紅色熒光強度。

1.2.6線粒體膜電位檢測 線粒體膜電位檢測采用6孔板接種細胞，分組給藥后，在37 ℃細胞培養(yǎng)箱放置24 h，加入PBS后洗滌5 min，重復3次后，每孔加入4%多聚甲醛，固定10 min后，吸除上清，用PBS洗滌細胞3次，每次5 min。每孔加入500 μL培養(yǎng)液，再向每孔加入500 μL JC-1染色工作液，放入細胞培養(yǎng)箱等待20 min。孵育后，吸除上清，加入PBS后洗滌5 min，重復3次后進行封片，加入2 mL培養(yǎng)液運用熒光顯微鏡檢測熒光。

1.2.7細胞凋亡檢測 細胞凋亡檢測采用6孔板接種細胞，分為以下幾組：control組、PA 0.4 mmol·L-1組、PA 0.4 mmol·L-1+和厚樸酚5 μmol·L-1組、PA 0.4 mmol·L-1+和厚樸酚10 μmol·L-1組、PA 0.4 mmol·L-1+和厚樸酚20 μmol·L-1組、和厚樸酚20 μmol·L-1組，含和厚樸酚培養(yǎng)基預處理1 h后吸出培養(yǎng)基，再加入含PA+和厚樸酚的培養(yǎng)基。分組給藥后，在37 ℃細胞培養(yǎng)箱放置24 h，加入PBS后洗滌5 min，重復3次后，每孔加入4%多聚甲醛，固定10 min后，用PBS洗滌細胞3次，每次5 min。每孔加入400 μL 反應(yīng)液，再向每孔加入10 μL PI，放入細胞培養(yǎng)箱等待10 min，加入PBS后洗滌5 min，重復3次后進行封片，用熒光顯微鏡檢測熒光，PI為紅色熒光。

1.2.8免疫印跡法檢測蛋白表達 細胞凋亡檢測采用培養(yǎng)皿接種細胞，分組給藥后，在37 ℃細胞培養(yǎng)箱放置24 h，加入PBS后洗滌5 min，重復3次后，每皿細胞進行裂解，將細胞刮下，離心收集沉淀，蛋白含量采用BCA試劑盒檢測。定量后的蛋白樣品取20 μL進行上樣，采用5%～15%的SDS-PAGE分離膠進行蛋白電泳，采用PVDF膜進行2 h轉(zhuǎn)模，室溫下采用5%的脫脂奶粉進行1 h的封閉，4 ℃下加入一抗孵育24 h，加入PBS后洗滌5 min，重復3次后，室溫下加入HRP標記的二抗孵育1 h，用ECL化學發(fā)光顯影，然后凝膠成像系統(tǒng)檢測GRP78、CHOP、pPERK、p-IRE1、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、β-actin的表達水平。

2 結(jié)果

2.1 和厚樸酚對高脂誘導的心肌細胞增殖能力低下的影響體外培養(yǎng)H9c2心肌細胞，用含PA(0.1、0.2、0.4、0.8 mmol·L-1)的DMEM培養(yǎng)基刺激24 h。如Fig 1A所示，心肌細胞增殖率隨著PA濃度的增加呈現(xiàn)下降趨勢，PA濃度在0.4 mmol·L-1時，降低明顯(P<0.05)。Fig 1B結(jié)果顯示，含PA 0.4 mmol·L-1的DMEM培養(yǎng)基刺激細胞0、12、24、48 h后，心肌細胞增殖率隨著PA刺激時間的延長呈現(xiàn)下降趨勢，尤其在24 h時，細胞增殖率開始明顯降低(P<0.05)。因此，我們將PA濃度定為0.4 mmol·L-1，刺激時間定為24 h開展下一步實驗。如Fig 1C所示，PA組心肌細胞增殖率明顯下降，隨著預處理的和厚樸酚濃度的升高，PA+和厚樸酚組的細胞增殖率呈現(xiàn)濃度依賴性升高趨勢。尤其和厚樸酚在20 μmol·L-1時，細胞增殖率明顯恢復至正常水平，因此在下一步實驗中和厚樸酚濃度設(shè)置為20 μmol·L-1。

2.2 和厚樸酚對高脂誘導的H9c2細胞內(nèi)ROS水平、線粒體膜電位水平及細胞凋亡的影響如Fig 2所示，PA組的紅色熒光明顯增強，而PA+和厚樸酚組的紅色熒光顯著弱于PA組，接近正常組。如Fig 3所示，PA組紅色熒光顯著減弱，綠色熒光顯著增強，而PA+和厚樸酚組的紅色熒光明顯強于PA組且綠色熒光弱于PA組，接近正常組。如Fig 4所示，0.4 mmol·L-1PA刺激24 h后，細胞內(nèi)PI 標記的紅色熒光明顯增強，而預處理和厚樸酚組可以明顯逆轉(zhuǎn)上述熒光改變。

2.3 和厚樸酚對高脂誘導的心肌細胞ERS-線粒體凋亡通路的影響如Fig 5A所示，用含0.4 mmol·L-1PA的DMEM培養(yǎng)基刺激H9c2心肌細胞24 h時，GRP78及CHOP表達明顯升高(P<0.05)，且p-PERK及p-IRE1蛋白表達明顯升高；預處理和厚樸酚組可以明顯逆轉(zhuǎn)心肌細胞內(nèi)高脂誘導的ERS相關(guān)蛋白GRP78、CHOP、p-PERK及p-IRE1表達的升高(P<0.05)。如Fig 5B所示，用含0.4 mmol·L-1PA的DMEM培養(yǎng)基刺激H9c2心肌細胞24 h時，Bcl-2水平明顯下降(P<0.05)，而如Fig 6所示，Bax、cleaved caspase-3等蛋白的表達均明顯升高(P<0.05)。而預處理和厚樸酚組可以明顯逆轉(zhuǎn)上述改變(P<0.05)。

3 討論

糖尿病心肌病的發(fā)病因素較多，其中高脂毒性是重要原因之一[11]。高脂毒性是指血游離脂肪酸水平增高[6，12]，以三酰甘油的形式在脂肪組織、非脂肪組織過度沉積，引起脂質(zhì)異位貯存。血游離脂肪酸高可使細胞的葡萄糖攝入、利用及糖原合成減少，可損害胰島素受體信號通路的活性，激活炎癥因子，引起胰島素抵抗，促進血胰島素水平升高；可使線粒體產(chǎn)生ROS增多，激活終末糖基化產(chǎn)物通路、PKC通路、己糖胺通路等，導致?lián)p傷細胞。動物實驗也證實，高脂血癥可以導致心肌脂質(zhì)沉積、心室壁增厚、心室重構(gòu)、心臟收縮功能降低。本研究證實，高脂可以誘發(fā)心肌細胞增殖率明顯下降，細胞內(nèi)活性氧生成增多，凋亡增加，而和厚樸酚可以顯著逆轉(zhuǎn)高脂所示心肌細胞增殖能力低下，并降低活性氧的產(chǎn)生，緩解細胞脂毒性損傷。

Fig 1 Viability of H9c2 cells treated with PA alone or combination of PA and

A:Concentration-dependent cell damage induced by PA at 24 h stimulation time.*P<0.05vs0 mmol·L-1group. B:Time-dependent cell damage induced by PA at 0.4 mmol·L-1concentration.*P<0.05，**P<0.01vs0 h group. C:Viability of cells treated with varied drugs (culture time:24 h).*P<0.05 vs control group;#P<0.05vsPA group.

Fig 2 Effect of honokiol on PA-induced cardiomyocyte oxidative damage(scale bar:50 μm)

Fig 3 Effect of honokiol on PA-induced reduction of cardiomyocyte mitochondrial membrane potential(scale bar:50 μm)

The intracellular level of mitochondrial membrane potential in H9c2 was estimated by JC-1，a fluorescent probe.

Fig 4 Effect of honokiol on PA-induced cardiomyocyte apoptosis(scale bar:50 μm)

The intracellular apoptosis level in H9c2 was estimated by PI labelled fluorescent probe.

心肌細胞脂毒性損傷的發(fā)病機制復雜，與多條信號通路相關(guān)，尤其是ERS信號通路與線粒體凋亡通路已成為近年來的研究熱點。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細胞中最重要的細胞器之一[13]，基本生理功能包括鈣調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)的合成加工及脂質(zhì)和膽固醇的合成。研究表明，ERS是一種自我保護性機制，但是過強或時間過長的ERS可能會導致細胞死亡。在非應(yīng)激條件下，ER跨膜蛋白的ER腔內(nèi)區(qū)域與伴侶蛋白GRP78相結(jié)合，ERS時，GRP78分別與PERK、IRE1等ER跨膜蛋白解離，轉(zhuǎn)位至內(nèi)ER內(nèi)，促進蛋白折疊，同時使ERS的下游信號通路激活，上調(diào)凋亡相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子C/EBP同源蛋白CHOP的表達[14]，最終促使細胞凋亡。有報道也提出上調(diào)的CHOP誘發(fā)細胞凋亡與線粒體通路相關(guān)，例如下調(diào)線粒體外膜上的抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達，從而引起線粒體外膜孔徑變大，線粒體膜通透性增加，促進線粒體中細胞色素C的釋放及凋亡誘導因子的高表達，出現(xiàn)凋亡蛋白caspase-3的大量表達，最終導致細胞凋亡。本研究結(jié)果提示，高脂刺激可以明顯誘發(fā)心肌細胞內(nèi)ERS相關(guān)蛋白GRP78、p-PERK、p-IRE1和CHOP的表達明顯升高，促凋亡蛋白BAX及cleaved caspase-3的表達也明顯升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達明顯降低，而和厚樸酚預處理可以明顯逆轉(zhuǎn)上述變化。這些結(jié)果表明，和厚樸酚可以調(diào)控細胞內(nèi)ERS-線粒體凋亡信號通路，保護心肌細胞出現(xiàn)脂毒性損傷。

Fig 5 Effect of honokiol on expression of ERS pathway related proteins

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPA group

Fig 6 Effect of honokiol on expression of mitochondrial apoptotic pathway related proteins in cardiomyocytes

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05 vs PA group

綜上所述，和厚樸酚能成功逆轉(zhuǎn)高脂所致的心肌細胞增殖力下降，緩解氧化應(yīng)激損傷及線粒體功能紊亂，通過調(diào)控ERS信號通路，最終減少線粒體介導的心肌細胞凋亡，起到保護心肌細胞的作用，目前和厚樸酚對心肌細胞脂毒性損傷的保護作用及其機制國內(nèi)外尚無報道，本研究為和厚樸酚治療心肌細胞脂毒性損傷奠定了理論和實踐基礎(chǔ)。