去甲基化調(diào)控μ阿片受體對神經(jīng)病理性疼痛痛覺過敏和嗎啡耐受的影響

吳 強(qiáng)，林 靜，劉民強(qiáng)，劉 麗，何仁亮

(深圳市第三人民醫(yī)院1.麻醉科、2.供應(yīng)室，廣東 深圳 518000)

阿片類藥物如嗎啡依然是臨床上治療中重度神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain，NPP)的主要藥物，但長期使用將產(chǎn)生藥物耐受，導(dǎo)致療效下降。前期研究顯示，NPP過程中外周神經(jīng)的μ阿片受體(mu-opioid receptor，MOR)表達(dá)下降，推測可能與嗎啡耐受有關(guān)，但機(jī)制不明，表觀遺傳機(jī)制可能參與其中[1-2]。文獻(xiàn)表明DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)亞型DNMT3a介導(dǎo)的Oprm1基因(編碼MOR)沉默會(huì)導(dǎo)致MOR表達(dá)減少，并促進(jìn)神經(jīng)損傷導(dǎo)致的NPP和嗎啡耐受[3-4]。本文嘗試用相反的手段，即DNA去甲基化酶TET1過表達(dá)的方式進(jìn)行干預(yù)，觀察其對NPP痛覺過敏和嗎啡耐受的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器兔抗TET1一抗(1 ∶ 1 000，Abcam，編號ab191698), 兔抗 GAPH一抗(1 ∶ 1 000，Santa Cruz，編號sc-20357)，兔抗MOR一抗(1 ∶ 500，Immunostar，編號RA10104)，山羊抗兔二抗(1 ∶ 3 000，Jackson Immuno Research)，DNA 提取試劑盒(Qiagen)，Ribo-Zero rRNA 試劑盒(Illumina，CA)，Tru Seq Stranded Total RNA 樣品制備試劑盒(Illumina，CA)，5mC/5hmC一抗(BI-MECY, Eurogentec)，熱輻射測痛儀(美國 IITC Life Science)，Von Frey針(美國Stolting)，電泳轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(Bio-Rad)，高通量測序平臺Illumina Hi Seq 2500。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 成年SD大鼠，♂，體質(zhì)量(250～300) g，購于廣東實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號SCXK(粵)2017-0029，飼養(yǎng)于溫度(20～25)℃、晝夜12 h交替環(huán)境中，自由取食飲水。隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：① 假手術(shù)組(Sham組)：將左側(cè)的坐骨神經(jīng)充分游離暴露但不結(jié)扎；② 慢性壓迫性損傷(chronic constriction injury,CCI)組：將左側(cè)坐骨神經(jīng)游離暴露結(jié)扎；③ CCI+TET1組：背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglia,DRG)內(nèi)微注射HSV-TET1，3 d后結(jié)扎左側(cè)坐骨神經(jīng)。④ CCI+GFP組：DRG內(nèi)注射HSV-GFP，3 d后結(jié)扎左側(cè)坐骨神經(jīng)。

1.2.2DRG內(nèi)HSV-TET1病毒質(zhì)粒微注射 在異氟醚吸入麻醉后，顯微鏡下小心操作三維手動(dòng)旋鈕，使玻璃微注射管(直徑 20～40 μm)中心垂直于已暴露的DRG上方，然后緩慢向下調(diào)節(jié)旋鈕，使其尖端垂直刺入背DRG表面，刺入時(shí)有輕微的突破感。微量注射泵的流速為12 μL·h-1，最后注入HSV-TET1(2 μL, 20 μmol·L-1)或HSV-GFP(2 μL)。HSV-TET1由美國羅格斯大學(xué)Tao教授饋贈(zèng)。

1.2.3坐骨神經(jīng)結(jié)扎CCI模型制備 病毒注射3 d后，參考Bennett等[5]的方法建立大鼠CCI模型：異氟烷吸入麻醉下將大鼠左側(cè)臥位固定在操作臺上，右側(cè)后肢皮膚去毛，碘伏消毒，于坐骨結(jié)節(jié)處切開皮膚，鈍性分離肌肉后暴露坐骨神經(jīng)，用4-0的羊腸線打4個(gè)單線結(jié)，松緊度控制在勉強(qiáng)能夠滑動(dòng)為宜，間距約為1 mm，術(shù)畢逐層縫合傷口，單籠飼養(yǎng)。

1.2.4疼痛行為學(xué)觀察和測量 在造模前3 d測定各組大鼠基礎(chǔ)痛閾值，在造模前1 d，造模后d 3、d 5進(jìn)行疼痛行為學(xué)測定。所有測定均在8 ∶ 00～12 ∶ 00 am安靜環(huán)境下進(jìn)行。

① 機(jī)械刺激縮爪反應(yīng)閾值(paw withdrawal threshold, PWT)測量：參考Chaplan和何林峰等[6-7]的方法，以up and down 法測定PWT。將一透明有機(jī)玻璃箱放置于金屬篩網(wǎng)上，讓大鼠適應(yīng)環(huán)境10 min 后，用Von Frey 針刺激大鼠術(shù)側(cè)后足掌部持續(xù)時(shí)間≤4 s，陽性反應(yīng)依據(jù)為大鼠出現(xiàn)抬足或舔足行為。初始刺激強(qiáng)度為2 g，當(dāng)該力度刺激為陰性反應(yīng)，則增大一級力度刺激；如反應(yīng)為陽性則減少一級力度，如此交替直至出現(xiàn)第1次陽性。取 4 次測定平均值為閾值。最大力度為15 g，大于此值時(shí)記為15 g。注意每次刺激間隔(30 s)和刺激力度相當(dāng)。② 熱輻射刺激縮爪反應(yīng)潛伏期(paw withdrawal latency, PWL)測量：參考 Hargreaves 等[8]的方法，將大鼠放置專用透明有機(jī)玻璃板上，調(diào)整熱痛刺激儀光源焦距照射動(dòng)物后肢掌心，記錄動(dòng)物從照射開始到引起縮肢反應(yīng)的時(shí)間。每只大鼠測量 5 次，間隔時(shí)間5 min，上限20 s，以避免造成組織損傷。

1.2.5Western blot 于術(shù)后d 7行為學(xué)檢測完畢后，采用頸椎脫臼法處死大鼠，沿棘突切開皮膚，除棘突和椎板，快速取出各組大鼠左側(cè) L5 DRG，加入組織裂解液，提取總蛋白，定量后行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫下 5% 脫脂奶粉封閉 2 h，加入一抗 4 ℃下孵育過夜。次日PBST洗膜后重復(fù)清洗3次后，加入相應(yīng)二抗室溫下孵育2 h，ECL顯影，記錄分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.6嗎啡耐受模型的建立及測定[9]CCI造模術(shù)后d 4開始，每天早晚皮下注射嗎啡10 mg·kg-1(間隔12 h)，連續(xù)7 d，建立嗎啡耐受模型。于術(shù)后d 7、9、11早注射嗎啡前，檢測嗎啡耐受情況。方法：給予嗎啡誘導(dǎo)量3 mg·kg-1皮下注射，在注射前后0.5 h測量TWL，連續(xù)測定3次，間隔1 min,上限值20 s。計(jì)算最大鎮(zhèn)痛效應(yīng)百分比(maximum potential analgesic effect，MPAE),公式為MPAE/%=(給藥后TWL-給藥前TWL)/(20-給藥前TWL)×100%。

1.2.7甲基化水平檢測 上述嗎啡耐受模型大鼠行為學(xué)檢測完畢后處死，采集L5 DRG，參照試劑盒說明書提取DNA，采用DNA blot方法檢測DRG全基因5mC和5hmC水平，采用亞硫酸氫鹽測序和Tab-seq技術(shù)檢測MOR啟動(dòng)子區(qū)域5mC和5hmC水平。

2 結(jié)果

2.1 注射HSV-TET1對CCI模型大鼠疼痛行為學(xué)影響如Fig 1所示，各組大鼠在手術(shù)前3 d和1 d 熱痛閾值(PWLs)及機(jī)械痛閾值(PWTs)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，術(shù)后d 3、d 5 CCI大鼠術(shù)側(cè)PWLs和PWTs明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。DRG內(nèi)微注射HSV-TET1可以明顯緩解疼痛，PWLs和PWTs恢復(fù)基礎(chǔ)水平；HSV-GFP疼痛閾值無明顯影響(Fig 1 A, C)。手術(shù)對側(cè)疼痛閾值在各時(shí)點(diǎn)沒有明顯改變(Fig 1 B, D)。

2.2 HSV-TET1注射對CCI模型大鼠DRG內(nèi)TET1和MOR表達(dá)的影響如Fig 2所示，CCI術(shù)后TET1表達(dá)沒有變化，HSV-TET1注射后TET1表達(dá)顯著增加(P<0.01)。CCI術(shù)后MOR表達(dá)明顯下降(P<0.01)，HSV-GFP注射不能逆轉(zhuǎn)MOR表達(dá)下降，HSV-TET1注射可以逆轉(zhuǎn)這種效應(yīng)，MOR表達(dá)明顯增加(P<0.01)。

2.3 TET1過表達(dá)對于嗎啡用于NPP鎮(zhèn)痛效果的影響如Fig 3所示，CCI術(shù)后d 3，嗎啡3 mg·kg-1肌注對于sham組大鼠和CCI組大鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)MPAE分別約為(90.6±9.3)和(39.8±11.2)(P<0.01)，嗎啡對CCI大鼠的鎮(zhèn)痛效果明顯減弱。CCI+GFP組大鼠MPAE為(37.1±7.6)，和CCI組相似；注射HSV-TET1后，嗎啡的鎮(zhèn)痛效應(yīng)恢復(fù)至約(76±8.6)(P<0.01)。

2.4 TET1過表達(dá)對CCI大鼠嗎啡耐受的影響如Fig 4所示，嗎啡3 mg·kg-1對于CCI大鼠術(shù)后d 7、9、11的MPAE值分別約為50、30、19，發(fā)生了明顯的嗎啡耐受。CCI+GFP組大鼠的MPAE值分別為48、29、19，和CCI組結(jié)果相似。TET1組相應(yīng)時(shí)點(diǎn)的MPAE分別為80、58、30，sham組分別為90、63、30，TET1組和sham組各時(shí)點(diǎn)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TET1組和CCI組各時(shí)點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

Fig 1 Effect of HSV-TET1 microinjection in DRG on nerve-injury induced nociceptive

**P<0.01vssham group

Fig 2 Effect of HSV-TET1 microinjection on level of TET1 and MOR in L5 DRG after

**P<0.01vssham group;##P<0.01vsCCI group

Fig 3 Effect of TET1 overexpression on morphine

**P<0.01vssham group;##P<0.01vsCCI group

Fig 4 Effect of TET1 overexpression on morphine

*P<0.05,**P<0.01vsCCI group

2.5 TET1過表達(dá)對DRG全基因甲基化水平的影響如Fig 5 所示，DNA blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，4組實(shí)驗(yàn)大鼠L5 DRG內(nèi)的5mC和5hmC的總含量半定量值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Fig 5 Effect of TET1 overexpression on level of genomic 5mC/5hmC in L5 DRG after

2.6 TET1過表達(dá)對DRG內(nèi)OPRM1啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平的影響如Fig 6所示，CCI模型大鼠MOR基因OPRM啟動(dòng)子區(qū)域Oprm1(-450/-288)和Oprm2(-238/+439)5mC相對水平上升，5hmC水平下降(P<0.01)；HSV-GFP注射對此效應(yīng)沒有影響，HSV-TET1注射可以逆轉(zhuǎn)此效應(yīng)。

3 討論

雖然阿片類藥物是目前NPP中重度患者最常使用的藥物，但其在臨床上的治療效果并不理想，并且反復(fù)使用會(huì)產(chǎn)生藥物耐受。既往研究發(fā)現(xiàn)，NPP形成后, 脊髓背角和DRG內(nèi)MOR表達(dá)明顯下降,這被認(rèn)為是NPP病理過程維持及阿片類藥物療效不佳和耐受的主因之一[10-12]。但導(dǎo)致MOR表達(dá)減少的原因，目前仍然不十分明確。

DNA甲基化機(jī)制是最早發(fā)現(xiàn)又最具特征的基因表觀修飾方式, 是基因表達(dá)狀態(tài)穩(wěn)定的主要機(jī)制之一。越來越多的研究者發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳相關(guān)的表型變化與疼痛的關(guān)系[13]。機(jī)體中甲基化和非甲基化的動(dòng)態(tài)平衡是由兩類酶進(jìn)行調(diào)控：一種是促進(jìn)甲基化過程的酶，即DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族DNMTs，使胞嘧啶(C) 轉(zhuǎn)變?yōu)?5-甲基胞嘧啶(5mC)；另一種是促進(jìn)去甲基化的酶TET(Ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase)蛋白，催化 5mC 的氧化成為衍生物5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)，從而使已經(jīng)甲基化的胞嘧啶去甲基化。最近的研究表明，DNMTs和TET蛋白共同維持著甲基化和去甲基的平衡[3]。DNA 的甲基化可以抑制相關(guān)基因的活性, 而去甲基化則能促進(jìn)相關(guān)基因的活化甚至重新表達(dá)。因此體內(nèi)無論甲基化酶DNMTs還是去甲基化酶TET發(fā)生變化，都會(huì)影響目的基因轉(zhuǎn)錄活性，從而導(dǎo)致蛋白表達(dá)和相應(yīng)的生理功能發(fā)生改變。TET蛋白家族有3個(gè)成員，分別為TET1、TET2和TET3。TET1是目前公認(rèn)的最具有催化5mC羥基化的活性酶。前期的結(jié)果顯示，受損的DRG神經(jīng)元中DNMT亞型DNMT3a的表達(dá)上調(diào)，但TET1的表達(dá)無明顯變化，從而導(dǎo)致甲基化-去甲基化動(dòng)態(tài)失衡[3]。本實(shí)驗(yàn)從調(diào)節(jié)TET1表達(dá)著手，嘗試恢復(fù)機(jī)體甲基化-去甲基化的平衡狀態(tài)，從而改善NPP的狀態(tài)和嗎啡耐受。

Fig 6 Effect of TET1 overexpression on level of 5mC/5hmC in two regions of oprm1 gene after

**P<0.01vssham group;##P<0.01vsCCI group

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CCI模型的大鼠，在外周神經(jīng)損傷d 3即開始出現(xiàn)痛覺過敏，證明NPP模型建立成功。CCI大鼠DRG的MOR表達(dá)水平明顯減少，這和之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。我們采用腺病毒載體技術(shù)，將HSV-TET1注射入DRG內(nèi)，Western blot結(jié)果表明，DRG內(nèi)TET1表達(dá)明顯增加，并且可以顯著逆轉(zhuǎn)神經(jīng)損傷導(dǎo)致的MOR表達(dá)減少，行為學(xué)檢測表明，TET1過表達(dá)可以緩解疼覺過敏。在CCI d 3，我們檢測同等劑量的嗎啡對不同分組大鼠鎮(zhèn)痛效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，劑量3 mg·kg-1的嗎啡，sham組大鼠的MPAE約為90，而CCI大鼠的MPAE約為40，注射HSV-TET1的大鼠MPAE恢復(fù)至約70。以上結(jié)果證實(shí)，CCI大鼠發(fā)生了痛覺過敏，且對嗎啡的反應(yīng)下降；TET1過表達(dá)可以恢復(fù)MOR的表達(dá)，改善NPP的狀態(tài)，并部分恢復(fù)嗎啡對NPP的鎮(zhèn)痛作用。

我們進(jìn)一步對CCI大鼠連續(xù)7 d注射嗎啡建立嗎啡耐受模型，觀察TET1過表達(dá)對大鼠嗎啡耐受的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著時(shí)間推移，嗎啡對CCI大鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)明顯減弱，患側(cè)的MAPE在d 7、d 9、d 11的MPAE分別約為50、30、19，產(chǎn)生了明顯的嗎啡耐受。注射HSV-TET1的大鼠在相同的時(shí)間點(diǎn)的MPAE分別約為80、58、30，表明雖然也產(chǎn)生了嗎啡耐受，但耐受的情況得到明顯改善。利用DNA探針發(fā)現(xiàn)，TET1過表達(dá)并不會(huì)改變DRG整體的甲基化水平，但直接基因測序結(jié)果顯示注射TET1可以使MOR啟動(dòng)子內(nèi)的兩個(gè)特定區(qū)域Oprm1(-450/-288)和Oprm2(-238/+439)5mC含量下調(diào)，5hmC含量上調(diào)，即去甲基化水平上升，從而影響MOR的表達(dá)，最終影響到嗎啡的鎮(zhèn)痛效能。以上結(jié)果表明，TET1可以通過調(diào)節(jié)MOR啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平，恢復(fù)MOR的表達(dá)，改善NPP的嗎啡耐受。

綜上所述，NPP過程中痛覺過敏和嗎啡耐受可能與外周神經(jīng)甲基化水平失衡，MOR表達(dá)水平下降有關(guān)。DNA去甲基化酶TET1可以調(diào)節(jié)MOR的啟動(dòng)子區(qū)域5mC和5mhC的平衡，恢復(fù)MOR的表達(dá)，從而改善NPP的痛覺過敏和嗎啡耐受。本研究結(jié)果可以幫助深入理解NPP的發(fā)病機(jī)制，并為其臨床治療提供新的思路和靶點(diǎn)。