IL-27通過(guò)PI3K/Akt通路對(duì)哮喘小鼠氣道重塑的影響

李 鑫,劉圓圓,張才擎

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院內(nèi)科學(xué)教研室，山東 濰坊 261053；2.山東大學(xué)附屬山東省千佛山醫(yī)院呼吸內(nèi)科，山東 濟(jì)南 250014；3.山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，山東 泰安 271000)

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞參與的氣道炎癥性疾病，長(zhǎng)期慢性炎癥導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性、氣道阻塞、粘液分泌過(guò)多和氣道重塑。但近年來(lái)，人們逐漸認(rèn)識(shí)到僅靠氣道炎癥并不足以解釋哮喘的發(fā)病機(jī)制。氣道重塑包括細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積導(dǎo)致基底膜增厚、上皮下纖維化、杯狀細(xì)胞化生、粘液分泌過(guò)多，引起氣流受限進(jìn)一步導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性，肺功能下降，從而損害肺的結(jié)構(gòu)和功能[1]。

白介素27(interleukin-27，IL-27)是一種屬于IL-12家族的細(xì)胞因子，主要由抗原呈遞細(xì)胞產(chǎn)生，包括樹(shù)突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等[2]。這種細(xì)胞因子與IL-27受體結(jié)合并傳遞信號(hào)。IL-27可以通過(guò)刺激單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肥大細(xì)胞、上皮細(xì)胞等誘發(fā)一系列炎癥事件[3]。另一方面，IL-27具有抗炎作用，能抑制Th1、Th2、Th17細(xì)胞亞群的發(fā)育，進(jìn)一步促進(jìn)IL-10的產(chǎn)生[4]。此外，研究表明，IL-27能夠抑制哮喘小鼠的氣道炎癥[5]。

PI3K/Akt信號(hào)通路是參與細(xì)胞生長(zhǎng)、存活、增殖、凋亡、蛋白合成、逆轉(zhuǎn)錄和自噬的重要信號(hào)通路。羅紅霉素可能通過(guò)PI3K/Akt通路抑制氣道平滑肌細(xì)胞增殖[6]。Xu等[7]發(fā)現(xiàn)，黃芩通過(guò)PI3K/Akt/NF-κB通路減輕香煙煙霧介導(dǎo)的COPD大鼠氣道重塑。益肺散結(jié)方通過(guò)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路增強(qiáng)小鼠肺纖維化模型的自噬作用進(jìn)而抑制肺纖維化[8]。我們通過(guò)建立哮喘小鼠模型，進(jìn)一步研究IL-27對(duì)哮喘小鼠氣道重塑的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物18只清潔級(jí)BALB/c ♀小鼠，8～10周齡，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(魯)20190003。

1.2 主要試劑卵蛋白(ovalbumin，OVA)購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司,鼠IL-27因子(貨號(hào)：2799-ML-010)購(gòu)于美國(guó)R&D 公司，抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)抗體(貨號(hào)：56856S)、p-Akt抗體(貨號(hào)：4060T)、Akt抗體(貨號(hào)：4691T)購(gòu)于美國(guó)CST公司，抗GAPDH抗體(貨號(hào)：60004-1-Ig)購(gòu)于美國(guó)protein Technology Group公司，TRIzol試劑購(gòu)于Invitrogen公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒和超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)于中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所。超聲霧化器購(gòu)于德國(guó)PARI BOY RX公司，Bio-Rad CFX96 Touch q-PCR系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad Laboratories公司，Olympus光學(xué)顯微鏡購(gòu)于日本OLYMPUS公司。

1.3 方法

1.3.1哮喘小鼠模型[5]18只小鼠按照隨機(jī)的原則分為3組：對(duì)照組、哮喘組、IL-27治療組。IL-27治療組在d 0～d 14給予IL-27(50 ng/只，每天2次)滴鼻治療，哮喘組和IL-27組在d 7和d 14腹腔注射OVA混懸液(1 mg OVA+100 mg氫氧化鋁)致敏，空白組以等量PBS代替。在d 21～d 35，哮喘組和IL-27治療組給予1% OVA溶液(OVA 0.1 g+生理鹽水10 mL)霧化30 min，每天1次，IL-27治療組在霧化前30 min給予IL-27(50 ng/只)滴鼻，對(duì)照組用等量PBS霧化吸入。在最后一次激發(fā)后24 h內(nèi)麻醉并處死各組小鼠。

1.3.2肺組織HE染色 取部分肺組織固定，脫水,石蠟包埋、切片， 厚度4 μm，HE 染色，封片，400倍光鏡下觀察，觀察每組小鼠炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)情況、氣道壁的厚度及氣道損傷情況。采用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)氣道壁總面積(Wat)進(jìn)行評(píng)估，采用基底膜周長(zhǎng)(Pbm)對(duì)Wat進(jìn)行統(tǒng)一化。采用Wat/Pbm比值(Wat/Pbm)評(píng)價(jià)氣道重構(gòu)。

1.3.3肺組織Masson染色 部分肺組織切片脫蠟,蘇木精染色，中性樹(shù)膠固定。在光學(xué)顯微鏡下觀察，最后用Image-Pro Plus 6.0分析軟件對(duì)測(cè)定上皮下 Masson 陽(yáng)性面積(μm2)和支氣管基底膜周長(zhǎng)(μm)，以支氣管基底膜周長(zhǎng)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，分析膠原沉積情況。

1.3.4免疫組織化學(xué)法測(cè)定α-SMA表達(dá)量 固定好的肺組織切片，脫蠟、再水化，抗原修復(fù)。在37℃下用5%牛血清封閉20 min。抗α-SMA抗體(1 ∶ 600)在4 ℃孵育過(guò)夜。在室溫下，用多克隆山羊抗兔免疫球蛋白/辣根過(guò)氧化物酶(1 ∶ 200)孵育30 min。光學(xué)顯微鏡下觀察切片，使用 Image-Pro Plus 6.0分析軟件進(jìn)行分析。

1.3.5實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)α-SMA在肺組織中mRNA的表達(dá) 小鼠肺組織總RNA的提取用TRIzol試劑，然后用PrimeScript RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用SYBR預(yù)混劑進(jìn)行擴(kuò)增。α-SMA上游引物：5′-CCCAACTGGGACCACATGG-3′,下游引物5′-GAAGTTACAGGGGGCGTACAT-3′；GADPH上游引物：5′-CCCATGTTTGTGATGGGTGT-3′,下游引物：5′-TGGTGTCAGGTACGGTAGTG-3′。反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s和65 ℃ 30 s，30個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。根據(jù)2-△△CT公式計(jì)算α-SMA mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.6Western blot檢測(cè)α-SMA、p-Akt、Akt 在肺組織中蛋白的表達(dá) 肺組織溶解于RIPA緩沖液中。勻漿冰上靜置30 min，離心(12 000 r·min-1，4 ℃，30 min)取上清。測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，以4 ∶ 1混于5×上樣緩沖液中，金屬浴15 min。配8%分離膠和5%濃縮膠進(jìn)行蛋白凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉，并在4 ℃孵育過(guò)夜:α-SMA(1 ∶ 1 000)和GAPDH(1 ∶ 2 000)，用含Tween的TBS洗3次，每次10 min，二抗(1 ∶ 10 000)在室溫下孵育2 h，TBST重復(fù)洗3次，ECL發(fā)光試劑盒顯影。用Imag J 分析條帶的積分光密度值。

2 結(jié)果

2.1 哮喘模型評(píng)估OVA激發(fā)后，哮喘組小鼠出現(xiàn)明顯的狂躁、易激惹、打噴嚏、流涕、呼吸頻率急促、體質(zhì)量減輕等癥狀。對(duì)照組和IL-27治療組未見(jiàn)明顯變化。

2.2 HE染色對(duì)照組小鼠肺組織管腔完整，支氣管內(nèi)無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，氣道平滑肌未見(jiàn)增厚；哮喘組可見(jiàn)支氣管腔狹窄，氣道和血管周圍可見(jiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；IL-27治療組較哮喘組明顯改善，炎性細(xì)胞明顯減少，但仍不能恢復(fù)到對(duì)照組的水平。哮喘組氣管壁厚度高于對(duì)照組(P<0.05)；IL-27治療組較哮喘組明顯下降, 但仍高于對(duì)照組, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)Fig 1。

2.3 Masson染色Masson 染色結(jié)果顯示對(duì)照組肺組織可見(jiàn)少量藍(lán)色膠原，哮喘組和IL-27治療組較對(duì)照組支氣管上皮下膠原沉積明顯加重(P<0.05)，且 IL-27組上皮下膠原沉積情況較哮喘組明顯減輕(P<0.05),見(jiàn)Fig 2。

2.4 肺組織α-SMA的免疫組化結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示，哮喘組小鼠肺組織α-SMA 陽(yáng)性面積明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，而IL-27治療后α-SMA陽(yáng)性面積較哮喘組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)Fig 3。

2.5 肺組織α-SMA的mRNA和蛋白的表達(dá)結(jié)果在mRNA水平上，哮喘組小鼠α-SMA的表達(dá)量較對(duì)照組明顯升高(P<0.05),而IL-27治療組小鼠α-SMA的表達(dá)較哮喘組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在蛋白水平上，與對(duì)照組相比，哮喘組小鼠α-SMA的表達(dá)明顯增加，IL-27治療能明顯下調(diào)這一表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)Fig 4。

2.6 肺組織Akt蛋白表達(dá)采用Western blot對(duì)小鼠肺組織Akt蛋白的磷酸化水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，哮喘組小鼠肺組織Akt磷酸化水平明顯升高(P<0.05)，IL-27治療下調(diào)了Akt蛋白的磷酸化水平(P<0.05)。Akt的總蛋白表達(dá)在3組間未見(jiàn)明顯的變化。因此IL-27可以抑制Akt蛋白的磷酸化，提示IL-27是通過(guò)PI3K/Akt通路抑制氣道重塑(Fig 4)。

A:HE staining of lung tissues at 400× magnification; B：The quantitative analysis of the thickness of airway wall.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsOVA

A: Masson′s staining of lung tissue at (400×); B: The quantitative analysis of collagen deposition.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsOVA

3 討論

哮喘是常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病之一，發(fā)病率居高不下，影響到全球3億多人，每年大約有25萬(wàn)人死亡。過(guò)去，人們認(rèn)為氣道炎癥是導(dǎo)致氣道重塑的主要原因。大量的研究表明，氣道重塑不僅僅是慢性炎癥反應(yīng)的結(jié)果，甚至與氣道炎癥同時(shí)存在。一些研究表明，IL-27 治療可減輕膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎[9]。IL-27能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞增殖、分化和膠原合成[10]。而且，IL-27通過(guò)調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞的分化能夠減輕博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化[11]。因此，我們推測(cè)IL-27能夠抑制哮喘小鼠的氣道重塑。

A: The expression of α-SMA in lung tissue were examined by immunohistochemistry (×400); B: The semiquantitative analysis of α-SMA.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsOVA

氣道炎癥是哮喘最主要的特征之一，炎癥細(xì)胞包括嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等。炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)可促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，氣道平滑肌的重塑是影響哮喘氣道重塑病理改變嚴(yán)重程度的重要因素，可釋放大量的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，在受到刺激時(shí)也能夠促進(jìn)炎癥細(xì)胞遷移。α-SMA不僅是氣道平滑肌的標(biāo)志物, 而且在成纖維細(xì)胞以及上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化和活化的過(guò)程中起作用。此外，上皮下膠原過(guò)度沉積也是引起氣道重塑的重要特征。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建哮喘小鼠氣道重塑模型，我們的研究顯示：IL-27能夠明顯抑制哮喘小鼠氣道平滑肌的增生、炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，減少氣管及血管周圍膠原沉積面積。哮喘組小鼠α-SMA在氣道黏膜下大量沉積，且α-SMA在蛋白及mRNA水平表達(dá)明顯增高，而IL-27治療能明顯抑制哮喘小鼠α-SMA的表達(dá)。因此，本研究證明IL-27除了能夠抑制哮喘小鼠的氣道炎癥外還能抑制氣道重塑。

近年來(lái)，證據(jù)表明，PI3K/Akt信號(hào)通路在支氣管哮喘中發(fā)揮著重要作用。特異性PI3K抑制劑(LY294002)能顯著下調(diào)小鼠肺組織中Akt的磷酸化，抑制Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、粘液的產(chǎn)生和氣道高反應(yīng)性[12]。過(guò)表達(dá)miR-200a可能下調(diào)FOXC1，通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，最終抑制哮喘患者的氣道平滑肌增殖和氣道重塑[13]。IL-27通過(guò)抑制Akt途徑，增強(qiáng)細(xì)胞毒性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制卵巢囊腺癌細(xì)胞增殖[14]。IL-27通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路，誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)趨化因子CXCL10[15]。然而，很少有研究報(bào)道IL-27與Akt信號(hào)通路在哮喘氣道重塑上的相關(guān)性。Akt作為PI3K的直接下游底物，可通過(guò)觀察p-Akt的表達(dá)來(lái)預(yù)測(cè)PI3K/Akt通路是否激活。在本實(shí)驗(yàn)中，研究結(jié)果顯示，哮喘組小鼠p-Akt的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，IL-27組能降低Akt的磷酸化水平。這些結(jié)果證實(shí)，IL-27通過(guò)抑制PI3K/Akt通路而抑制哮喘小鼠的氣道重塑。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證明IL-27對(duì)哮喘小鼠的氣道炎癥和氣道重塑有抑制作用，其機(jī)制是通過(guò)抑制PI3K/Akt通路。IL-27與氣道重塑之間的關(guān)系的深入研究，可能為我們治療頑固性哮喘提供新方向。

Fig 4 IL-27 inhibited expression of α-SMA and phosphorylation of Akt in asthmatic

A: The expression of α-SMA mRNA in the lung tissues were determined by RT-PCR; B: The expression of α-SMA, p-Akt and Akt was assessed by Western blot; C: The analysis of the α-SMA and p-Akt expressioprotein.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsOVA