索氏提取法提取牡丹籽油的工藝優(yōu)化研究

陳 曉，易雪平，倪 穗

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院， 浙江 寧波 315211)

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)又名木芍藥，是芍藥科(Paeoniaeeae)、芍藥屬(PaeoniaL.)、牡丹組(Sect.Moutan)的落葉灌木，是我國特有的種質(zhì)資源[1]。牡丹籽油富含亞麻酸、亞油酸等多種不飽和脂肪酸以及多種活性物質(zhì)[2]，且無毒副作用或毒副作用極小[3]。研究表明，亞麻酸具有降血糖、降血脂[4]、預(yù)防心血管疾病[5]、促進(jìn)脂肪代謝、提高自身免疫力、抗腫瘤等作用[6]；亞油酸具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、減肥和免疫調(diào)節(jié)等功能[7]。牡丹籽油具有很高的營(yíng)養(yǎng)和保健價(jià)值，除了可以作為食用油還可以應(yīng)用到很多行業(yè)，帶來可觀的經(jīng)濟(jì)效益[8]，如用于防曬美白[9]產(chǎn)品、抗氧化作用[10]保健品、化妝品原料油[11]、皮膚燙傷用藥[12]等。在眾多的牡丹品種中，‘鳳丹’牡丹結(jié)實(shí)性好[13]，且籽出油率高，適應(yīng)性強(qiáng)，是目前生產(chǎn)牡丹籽食用油的主要品種之一。

油用牡丹產(chǎn)業(yè)是近年來的新興產(chǎn)業(yè)[14]，其籽油的開發(fā)不僅豐富了食用油的品種，還為市場(chǎng)增加了一種健康和營(yíng)養(yǎng)的食品，對(duì)國民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展有積極意義。在國家與政府的支持下，我國油用牡丹產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，但是目前我國在牡丹籽油的提取和精煉技術(shù)等方面的研究鮮見報(bào)道，這將會(huì)極大影響油用牡丹的的產(chǎn)業(yè)發(fā)展。本研究針對(duì)牡丹籽油產(chǎn)業(yè)發(fā)展這一瓶頸問題，采用索氏提取法對(duì)‘鳳丹’籽油的提取技術(shù)展開研究，并進(jìn)行了工藝優(yōu)化。以期為牡丹籽油的產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供技術(shù)支持，使我國油用牡丹產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

‘鳳丹’的種子，購于安徽亳州。

種子在60℃下烘干后，手工剝殼得種仁，再次烘干至恒重，粉碎后過60目篩，密封備用。

1.2 儀器與試劑

ZK-26/100真空泵、FCD-3000、HH-4恒溫水浴鍋、FA2004分析天平、多功能粉碎機(jī)、索氏抽提器、安捷倫7890 B-7000 C氣相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀。

實(shí)驗(yàn)室自制純水、石油醚、硫酸、甲醇、正己烷、無水硫酸鈉(以上試劑均為分析純)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 提取方法

抽提瓶烘干至恒重，稱量并記錄重量，與提取管相連接。在抽提管中放入稱重過并包裹好的牡丹籽粉末。加入石油醚后，打開冷凝管進(jìn)水管并開始水浴加熱。待提取完畢后，取出包裹樣品的濾紙筒，將溶液回流2次，回收溶劑并取下抽提瓶，清理后放入烘箱烘干至恒重，再次稱量，增加的質(zhì)量即牡丹籽油的質(zhì)量，稱量，計(jì)算出油率。

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.2.1 單因素梯度設(shè)置 提取時(shí)間為2、4、6、8、10 h，料液比(g∶mL)為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35，籽粒目數(shù)為10、20、40、60、80目，提取溫度為72、75、80、85、90℃。

1.3.2.2 出油率計(jì)算 出油率=所得牡丹籽油質(zhì)量/牡丹籽粉末質(zhì)量

1.3.3 提取工藝優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用中心組合(Box-Behnken)試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，以料液比(A)、提取時(shí)間(B)、提取溫度(C)為考察變量，選擇適當(dāng)?shù)捻憫?yīng)面因素水平表如表1所示，以牡丹籽油得率(%)為指標(biāo)，采用Box-Behnken進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)牡丹籽油提油率提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

表1 提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)因素水平

1.3.4 牡丹籽油的GC-MS分析

甲酯化：稱取1.00 g索氏提取法所得牡丹籽油于錐形瓶中，加入4 mL石油醚-苯(體積比1:1)混合液，再加入4 mL的0.4 mol/L氫氧化鉀甲醇溶液，搖勻后室溫放置10 min，加蒸餾水至刻度線后進(jìn)行GC-MS分析。

GC條件：色譜柱：CD-2560 (100 m × 0.25 mm × 0.2 μm)；升溫程序?yàn)?40℃保留5 min，以4℃/min升至240℃，保留25 min；載氣：He、N2；總流量：44.31 mL/min；進(jìn)樣口溫度：250℃；進(jìn)樣量：900 μL；分流比50∶1；

MS條件：EI，離子源，電離電壓70 eV，離子源溫度230℃，四級(jí)桿溫度250℃，掃描范圍40～450 m/z。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1.1 不同提取時(shí)間對(duì)牡丹籽出油率的影響

在提取溫度80℃，物料目數(shù)為60目，以及料液比(g∶mL)為1∶20 的條件下，分析提取時(shí)間分別為2、4、6、8、10、12 h時(shí)對(duì)牡丹籽出油率的影響。結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同提取時(shí)間對(duì)牡丹籽出油率的影響Fig.1 Effects of time on extraction rate of the peony oil

由圖1可知，隨著提取時(shí)間的增加，出油率大致呈上升趨勢(shì)。提取時(shí)間在2 h時(shí)出油率最低為21.38%，后隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng)出油率上升，當(dāng)提取時(shí)間為8 h時(shí)出油率最高為31.25%，且比6 h多了2.37%，差距較大，而提取時(shí)間繼續(xù)增加出油率減少。因此，選取8 h為牡丹籽油提取的最佳提取時(shí)間。

出現(xiàn)該結(jié)果的可能原因是隨著時(shí)間增加提取出的油越多，而長(zhǎng)時(shí)間加熱后可能加速了牡丹籽油中的某些物質(zhì)的分解，考慮到生產(chǎn)成本和生產(chǎn)時(shí)長(zhǎng)等因素，提取時(shí)間選擇8 h。

2.1.2 不同料液比對(duì)牡丹籽出油率的影響

在80℃提取溫度，物料目數(shù)為60目以及8 h提取時(shí)間條件下，分析料液比(g∶mL)對(duì)牡丹籽出油率的影響，分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35。結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，隨著石油醚體積的增加，出油率呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢(shì)。其中，料液比(g∶mL)為1∶35時(shí)出油率最低為25.07%，料液比(g∶mL)為1∶20時(shí)出油率最高為31.59%，且料液比(g∶mL)為1∶20時(shí)出油率比1∶15時(shí)多了3.21%，比1∶25時(shí)多了2.98%，差值較大。因此選1∶20為牡丹籽油提取的最佳料液比。

出現(xiàn)該結(jié)果的可能原因是料液比大，溶劑少，溶液中油的濃度較高且易于達(dá)到飽和狀態(tài)，油脂分子的動(dòng)力減小，出油率小。料液比過小，牡丹籽粉末混合浸潤(rùn)效果不太好，單位石油醚中油脂濃度也會(huì)降低，既浪費(fèi)了溶劑，也給后續(xù)提純工作增加負(fù)擔(dān)。

雁蕩山完整地記錄了火山爆發(fā)、塌陷、復(fù)活隆起的完整地質(zhì)演化過程，不僅是亞洲大陸邊緣巨型火山帶中白堊紀(jì)火山的典型代表，還是研究流紋質(zhì)火山巖的天然博物館，為中生代晚期亞歐大陸邊緣復(fù)活型破火山模式的典型范例，對(duì)研究全球白堊紀(jì)時(shí)期破火山演變規(guī)律和地貌演化特征具有重要的科學(xué)意義。雁蕩山融山水美學(xué)、自然科學(xué)、歷史文化于一身，被譽(yù)為“海上名山、寰中絕勝”，史稱“東南第一山”，是中國大地上的一顆“東方明珠”。2004年11月8-10日，聯(lián)合國教科文組織地學(xué)部主任伊登博士，在考察雁蕩山后題詞，稱贊雁蕩山是“一首由巖石、水和生命組成的交響樂?！?/p>

2.1.3 不同物料目數(shù)對(duì)牡丹籽出油率的影響

在80℃提取溫度，8 h提取時(shí)間以及1∶20料液比(g∶mL)情況下，分別分析物料目數(shù)為10、20、40、60、80目時(shí)對(duì)牡丹籽出油率的影響。結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，隨著物料目數(shù)的增加出油率呈大致上升趨勢(shì)。其中，在物料目數(shù)為10目時(shí)出油率最低為16.78%，60目時(shí)出油率最高為31.25%，且比40目高了3.74%，差值較大。因此，選擇物料目數(shù)為60目為牡丹籽油提取的最佳物料目數(shù)。

出現(xiàn)該結(jié)果的可能原因是牡丹籽粉末越小，比表面積越大，出油率越高，但當(dāng)物料目數(shù)超過60目后，可能是粉末中其他物質(zhì)提取過多抑制了牡丹籽油的提取，而且目數(shù)高的提取液較渾濁難以過濾。

2.1.4 不同溫度對(duì)牡丹籽出油率的影響

選擇在8 h提取時(shí)間，60目物料目數(shù)以及1∶20料液比(g∶mL)情況下，分別分析溫度為72、75、80、85、90℃時(shí)對(duì)牡丹籽出油率的影響。結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同溫度對(duì)牡丹籽出油率的影響Fig.4 Effects of temperature on extraction rate of the peony oil

由圖4可知，隨著提取溫度的提高，牡丹籽油的出油率大致呈上升趨勢(shì)。其中，在溫度為72℃時(shí)出油率最低為16.35%，80℃時(shí)出油率最高為31.52%。72、75、80、85、90℃時(shí)出油率分別為16.35%、27.48%、31.52%、30.67%、29.04%，不同溫度間差異顯著。因此，選擇80℃為牡丹籽油的提取最佳溫度。

出現(xiàn)該結(jié)果的可能原因是隨著提取溫度的升高，牡丹籽粉末中的油脂分子間的動(dòng)能增加，向石油醚擴(kuò)散的速度增加，因此從72～80℃時(shí)出油率升高，而當(dāng)溫度超過80℃時(shí)，由于溫度太高造成了油中沸點(diǎn)低的成分分解或揮發(fā)。

2.2 響應(yīng)面分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，綜合考慮料液比、時(shí)間和溫度對(duì)牡丹籽出油率的影響，進(jìn)行了試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見表2。

表2 牡丹籽油提取工藝響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面模型方程建立與顯著性分析

利用Design-Expert軟件進(jìn)行擬合，以料液比 (A) 、提取時(shí)間 (B) 和提取溫度 (C)為自變量，以牡丹籽出油率為因變量，建立得到的二次多項(xiàng)回歸方程如下：

R=32.13+1.09×A+1.28×B+1.08×C-0.56×A×C-0.52×B×C-0.63×A2-0.77×B2-0.75×C2

采用Design-Expert軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果如表3。

表3 響應(yīng)面二次模型的方差分析結(jié)果

回歸方程中各變量的顯著性程度由F值來判斷，P值越小, 則相應(yīng)變量的顯著性越高。由表2-2可知，料液比、提取時(shí)間和提取溫度的一次項(xiàng)以及提取時(shí)間和提取溫度的二次項(xiàng)均達(dá)到極顯著水平(p<0.01)，因素AC、BC、A2對(duì)牡丹籽出油率的影響顯著(P<0.05)，因素AB對(duì)牡丹籽出油率的影響不顯著(P>0.05)。

由F值可知，各因素對(duì)牡丹籽出油率的影響大小為：提取時(shí)間>料液比>提取溫度。回歸方差分析顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明，該模型回歸性極顯著，且失擬項(xiàng)不顯著說明該方程對(duì)試驗(yàn)擬和較好。

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析

根據(jù)回歸方程和表3分析結(jié)果，做出各極顯著的交互因素響應(yīng)面及等高線圖，考察擬和響應(yīng)面曲面的形狀，分析料液比、提取時(shí)間和提溫度對(duì)牡丹籽出油率的影響如圖5～7所示，響應(yīng)面圖可反映各因素對(duì)牡丹籽出油率的影響，曲線越陡峭，說明該因素影響越大。此外，等高線的形狀也能反映兩個(gè)因素交互作用的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而等高線接近圓形表示兩因素交互作用不顯著。由圖5～7可知，相比較而言，料液比和提取時(shí)間的交互作用顯著，表現(xiàn)為響應(yīng)面曲線較陡，等高線曲線偏橢圓形，其他因素間的相互作用對(duì)牡丹籽出油率的影響較小，表現(xiàn)為響應(yīng)面圖曲線較緩，等高線圖曲線偏圓形。

圖5 料液比與提取時(shí)間對(duì)牡丹籽出油率影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Contour and response surface plots for the effect of solid-to-liquid ratio and time on the yield of the peony oil

圖6 料液比與提取溫度對(duì)牡丹籽出油率影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.6 Contour and response surface plots for the effect of solid-to-liquid ratio and temperature on the yield of the peony oil

圖7 提取時(shí)間與提取溫度對(duì)牡丹籽出油率影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.7 Contour and response surface plots for the effect of time and temperature on the yield of the peony oil

2.2.4 最優(yōu)條件的確定

通過軟件Design-Expert對(duì)模型進(jìn)行最優(yōu)化預(yù)測(cè)，可得到提取牡丹籽油的最優(yōu)化工藝組合為：料液比(g∶mL)為23.18，提取時(shí)間9.29 h，提取溫度81.28℃，在此工藝條件下的牡丹籽出油率理應(yīng)為33.026%。為了驗(yàn)證所得結(jié)果的可靠性，在理論條件下進(jìn)行牡丹籽油的提取。由于實(shí)際條件的可操作性，將最佳工藝條件修正為：料液比(g∶mL)為1∶25，提取時(shí)間10 h，提取溫度80℃，實(shí)際操作后測(cè)得的平均出油率為32.978%，與理論出油率相差0.048%，說明該工藝具有實(shí)際可操作性及可靠性，有使用價(jià)值。

2.3 牡丹籽油GC-MS分析結(jié)果

通過GC-MS分析索氏提取法所得的牡丹籽油，檢索標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫并查閱文獻(xiàn)后鑒定出牡丹籽油中的主要脂肪酸成分，并利用峰面積歸一化法確定各組分在總脂肪酸中的相對(duì)百分含量，分析結(jié)果見表4。

表4 牡丹籽油的索氏提取法GC-MS分析成分表

從表中可知，索氏提取法所得的牡丹籽油共測(cè)定出4種不飽和脂肪酸，其中，亞麻酸甲酯含量最高，占總不飽和脂肪酸的40.920 9%，棕櫚酸甲酯含量最少，占總不飽和脂肪酸的6.956 3%。

從GC-MS結(jié)果分析可知，索氏提取法所得牡丹籽油中亞麻酸甲酯、亞油酸甲酯和油酸甲酯含量較高；索氏提取法得到的硬脂酸甲酯可能由于含量較低未能檢出。

3 結(jié)論

通過單因素以及響應(yīng)面分析得到索氏提取法提取牡丹籽油的最佳工藝條件為：料液比(g∶mL)為1∶20，提取時(shí)間8 h，提取溫度75℃，物料目數(shù)為60目。在此工藝條件下，出油率在32.92%左右。其油中油酸的含量為24.159 6%，亞油酸為27.963 1%，亞麻酸為40.920 9%。王喜波等[15]通過索氏提取法萃取的牡丹籽油中油酸的含量為22.39%，亞油酸為24.27%，亞麻酸為44.94%，出油率為24.58%。其結(jié)果與本試驗(yàn)索氏提取法所得的牡丹籽油最大結(jié)論相差不大，但出油率低了很多，可能與牡丹品種及試驗(yàn)條件設(shè)置不同有關(guān)。

研究結(jié)果可為牡丹籽油的提取以及油用牡丹的產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。