潛陽封髓丹對化療致口腔黏膜炎的作用研究△

唐曉麗，楊霖，劉悅，牛芬溪，方芳*

1.北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 102488；2.首都醫(yī)科大學 附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010

潛陽封髓丹為潛陽丹封髓丹合方，潛陽丹出自《醫(yī)理真?zhèn)鳌?，封髓丹最早見于《御藥院方》，復方由黑附片、醋龜甲、黃柏、炙甘草和砂仁組成。臨床觀察顯示，潛陽封髓丹漱口并口含對腎陽不足型腫瘤患者化療后出現(xiàn)的口腔黏膜炎具有改善作用，能提高卡氏評分(KPS評分)，縮短化療致口腔黏膜炎的出現(xiàn)時間，減輕疼痛，提升患者的生活質(zhì)量[5]。本實驗采用5-氟尿嘧啶(5-FU)聯(lián)合機械劃傷致金黃地鼠口腔黏膜炎的模型[6]，觀察潛陽封髓丹對化療致金黃地鼠口腔黏膜炎的影響，為臨床上化療致口腔黏膜炎的病人用藥提供實驗參考。

1 材料

1.1 實驗動物

40只SPF級金黃地鼠，雄性，8～9周齡，體質(zhì)量130～150 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0011]。動物實驗在北京中醫(yī)藥大學屏障環(huán)境動物室進行[SYXK(京)2016-0038]，每籠飼養(yǎng)4只金黃地鼠。飼養(yǎng)條件為室溫20～25 ℃，相對濕度(50%±5%)，12 h/12 h光照日夜循環(huán)，動物自由飲水，標準飼料喂養(yǎng)，動物處死方式為腹主動脈取血。動物許可證號為NO.11400700319709。

1.2 試藥與儀器

潛陽封髓丹提取物由首都醫(yī)科大學提供，處方組成為黑附片10 g、龜板30 g、黃柏10 g、炙甘草10 g、砂仁10 g，均購自北京中醫(yī)醫(yī)院中藥房，采用煎煮法制成1 g生藥/mL的濃縮液備用；5-FU(美國MedChem Express公司，批號：HY-90006/CS-0993)；IL-1β、TNF-αELISA測定試劑盒(武漢博士德生物公司)；MDA、SOD試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

Bead Ruptor 多樣品研磨珠均質(zhì)儀(OMIN international，USA)；全自動酶標儀(BMG LABTECH，Germany)；高速低溫離心機(Eppendorf AG，Hamburg，Germany)；全 景 掃 描 儀(3D Histech Pannoramic MIDI，Hungary)。

2 方法

2.1 分組及給藥

動物適應性飼養(yǎng)后，隨機分成5組，正常對照組、模型組、潛陽封髓丹低劑量組(3.5 g·kg-1)、中劑量組(7 g·kg-1)、高劑量組(14 g·kg-1)。除正常對照組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液外，其余各組在實驗開始的第1天和第2天分別腹腔注射60、40 mg·kg-1的5-FU。第4天除正常對照組外，將其余各組動物的口腔頰囊外翻，用18號針頭以線性的方式從距離口腔邊緣5 mm處開始由外到里進行淺表劃傷頰囊，長度為1 cm，深度為1 mm。實驗開始時各給藥組動物分別給予相應劑量的藥物，給藥方式為局部涂抹加灌胃，灌胃容積為1 mL·(100 g)-1體質(zhì)量，每天1次，持續(xù)到14 d即為實驗結(jié)束，正常對照組、模型組動物分別給予等體積的0.9%氯化鈉溶液。實驗過程中，記錄動物的進食量和體質(zhì)量變化情況。

2.2 口腔頰囊宏觀分析及評分

給藥第7天和第14天，觀察各組金黃地鼠口腔頰囊劃傷部位的宏觀變化并拍照，根據(jù)口腔頰囊是否出現(xiàn)紅斑、血管擴張、潰瘍、膿腫和糜爛等癥狀進行評分，具體評分標準[7]如下：0分，頰囊表面紅潤，無血管擴張、膿腫、糜爛等現(xiàn)象；1分，頰囊表面可見少量紅斑，無膿腫、糜爛；2分，頰囊表面紅斑面積擴散，血管出現(xiàn)擴張，開始出現(xiàn)糜爛面；3分，黏膜表面可見1個或多個潰瘍面，總面積在表面總區(qū)域面積的25%以下；4分，頰囊表面潰瘍面積占總區(qū)域面積的25%～50%；5分，頰囊表面幾乎完全潰爛。

2.3 組織病理學檢測

實驗結(jié)束后，取頰囊組織，經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定。將頰囊組織進行組織病理學檢測，經(jīng)常規(guī)石蠟包埋，制片(4 μm)，HE染色后脫水封片，用全景掃描儀在20倍光鏡下截取對應病變部位拍照，并根據(jù)口腔黏膜的病變部位進行組織病理學分析。組織病理學評分根據(jù)是否存在炎性細胞浸潤，肌細胞間隙增大、萎縮或壞死，表皮層斷裂，真皮層局部結(jié)締組織成團脫落等進行綜合評分，如出現(xiàn)其中1種情況即積1分，每只累計總分進行統(tǒng)計學比較。

2.4 生化指標檢測

將動物麻醉后進行腹主動脈取血，靜置，3500 r·min-1，離心5 min(離心半徑為18 cm)，分離血清后待測。按照試劑盒的說明書進行操作，測定金黃地鼠血清中腫瘤壞死因子(TNF-α)和 白細胞介素1β(IL-1β)的含量。另取頰囊組織稱質(zhì)量后，用1∶9體積0.9%氯化鈉溶液制成10%組織勻漿，離心并分離上清待測。按照生化試劑盒的說明書操作，測定金黃地鼠口腔黏膜組織中超氧化歧化酶(SOD)活性和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的含量。

2.5 統(tǒng)計學方法

以片植、孤植和綠籬三種方式栽植：一是片植，選擇苗木高度0.5-1.0m，冠幅0.3-0.5m，株行距0.6m×0.5m；二是孤植，選擇苗木高度1.2-1.5m，冠幅0.5-1.0m；三是綠籬方式，選擇苗木高度0.5-1.0m，冠幅0.3-0.5m,單排栽植，行距0.2m。

3 結(jié)果

3.1 潛陽封髓丹對金黃地鼠體質(zhì)量和進食量的影響

結(jié)果顯示，造模前各組動物的體質(zhì)量未見明顯差異。與造模前動物體質(zhì)量比較，正常對照組動物體質(zhì)量在實驗期間變化不明顯；模型組動物在第7天體質(zhì)量明顯降低(P<0.05)，隨后逐漸恢復；潛陽封髓丹高劑量組動物體質(zhì)量變化不明顯，中劑量組動物體質(zhì)量在第7天明顯降低，隨后逐漸恢復并明顯增加(P<0.01)，低劑量組動物體質(zhì)量在第7、14天都明顯降低(P<0.05)，見表1。

表1 潛陽封髓丹對金黃地鼠體質(zhì)量的影響 g

注：與實驗前自身比較，*P<0.05，**P<0.01。

從表中可以看出，與正常對照組比較，模型組動物的進食量在第1～7天明顯降低(P<0.05)，在第8～14天體質(zhì)量雖有降低但未見明顯差異。與模型組比較，給予潛陽封髓丹高、中劑量后，在第1～7天及第8～14天動物的進食量均有所增加，但未見明顯的統(tǒng)計學差異，見表2。

表2 潛陽封髓丹對金黃地鼠進食量的影響 g

注：與正常對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 潛陽封髓丹對金黃地鼠口腔頰囊宏觀評分的影響

宏觀觀察結(jié)果顯示，正常對照組頰囊組織完整，表面光滑，無紅斑、炎癥等變化。模型組動物的口腔頰囊組織出現(xiàn)明顯的紅斑、血管擴張、糜爛創(chuàng)面等病理變化，雖然從第7天開始上述癥狀逐漸減輕，但至第14天仍可見紅斑、血管擴張等現(xiàn)象存在；與模型組比較，給予潛陽封髓丹中劑量組在第7天有降低損傷評分的作用，且在第14天評分降低更顯著(P<0.01)。潛陽封髓丹高、低劑量組在第14天均可明顯降低口腔頰囊組織宏觀評分(P<0.01)，見表3，圖1。

表3 潛陽封髓丹對金黃地鼠口腔頰囊宏觀評分的 影響

注：與正常對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01。下同。

注：A.正常對照組第7天；B.模型組第7天；C.潛陽封髓丹低劑量組第7天；D.潛陽封髓丹中劑量組第7天；E.潛陽封髓丹高劑量組第7天；A′.正常對照組第14天；B′.模型組第14天；C′.潛陽封髓丹低劑量組第14天；D′.潛陽封髓丹中劑量組第14天；E′.潛陽封髓丹高劑量組第14天。圖1 潛陽封髓丹對金黃地鼠口腔頰囊的宏觀影響

3.3 潛陽封髓丹對金黃地鼠口腔黏膜組織病理變化的影響

HE染色后，對各組動物的染色結(jié)果從表皮結(jié)構(gòu)、肌纖維細胞、結(jié)締組織、炎性細胞是否浸潤等方面進行組織病理學分析。結(jié)果顯示，正常對照組視野中表皮結(jié)構(gòu)完整，表皮下肌纖維排列緊密，肌纖維下疏松的結(jié)締組織中可見少量肥大細胞，組織未見其他明顯異常。與正常對照組相比，模型組表皮下可見部分肌細胞排列疏松，間隙增大，肌細胞間質(zhì)結(jié)締組織中存在少量炎性細胞浸潤及少量壞死肌細胞，胞核固縮深染，同時表皮層斷裂，真皮層局部結(jié)締組織成團脫落，并可見其嗜酸性減弱，炎性細胞浸潤較多，炎癥反應明顯。與模型組相比，潛陽封髓丹高、中、低劑量組組織中未見胞核固縮深染、表皮層斷裂、壞死肌細胞等現(xiàn)象，視野中表皮結(jié)構(gòu)完整正常，真皮層膠原纖維排列緊密，真皮層下疏松結(jié)締組織中可見少量肥大細胞滲出，炎癥反應減輕，見圖2。組織病理學評分結(jié)果顯示，與正常對照組評分(0.833±0.41)比較，模型組評分(2.750±0.98)顯著升高(P<0.01)。與模型組評分比較，潛陽封髓丹中劑量組(1.167±0.41)和低劑量組(1.333±0.52)評分明顯降低(P<0.01)(P<0.05)，潛陽封髓丹高劑量組評分(1.500±0.84)雖有降低，但差異無統(tǒng)計學意義。

3.4 潛陽封髓丹對金黃地鼠血清中促炎癥因子IL-1β、TNF-α的影響

結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組動物血清中TNF-α含量明顯升高(P<0.01)，模型組動物血清中的IL-1β含量有所增加(P<0.05)。與模型組動物相比，潛陽封髓丹低劑量組能明顯降低動物血清中IL-1β的含量(P<0.01)，潛陽封髓丹中劑量組能顯著降低動物血清中TNF-α和IL-1β的含量(P<0.05，P<0.01)，而潛陽封髓丹高劑量組雖然對動物血清中TNF-α和IL-1β的含量均有所降低，但差異無統(tǒng)計學意義，見表4。

3.5 潛陽封髓丹對金黃地鼠口腔頰囊組織中SOD和MDA含量的影響

結(jié)果顯示，各組動物口腔頰囊組織中的SOD活性未見顯著差異無統(tǒng)計學意義。與正常對照組比較，模型組動物口腔頰囊組織中的MDA含量有所升高(P<0.05)。與模型組相比，潛陽封髓丹高劑量組的MDA含量有所下降(P<0.05)，潛陽封髓丹低、中劑量組的MDA含量則差異無統(tǒng)計學意義，見表5。

注：A.正常對照組；B.模型組；C.潛陽封髓丹低劑量組；D.潛陽封髓丹中劑量組；E.潛陽封髓丹高劑量組；黑色箭頭所示肥大細胞或炎性細胞浸潤；綠色箭頭所示少量壞死肌細胞和胞核固縮深染；紅色箭頭所示表皮層斷裂；黃色箭頭所示真皮層局部結(jié)締組織成團脫落及嗜酸性減弱。圖2 潛陽封髓丹對金黃地鼠口腔頰囊組織病理的影響(HE染色，×20倍)

表4 潛陽封髓丹對金黃地鼠血清中TNF-α和 IL-1β的影響 pg·mL-1

表5 潛陽封髓丹對金黃地鼠口腔頰囊組織中SOD和 MDA的影響

4 討論

化療是目前治療腫瘤的有效手段，口腔黏膜炎則是化療后常見的并發(fā)癥之一且發(fā)病率較高。接受標準劑量化療的患者，口腔黏膜炎的發(fā)病率為20%～80%，而接受大劑量化療后，發(fā)病率幾乎為100%[8]，在頭頸部癌放化療中，口腔黏膜炎的發(fā)生率更高。5-FU是1種細胞周期特異性對細胞具有毒性的抗癌藥物。臨床數(shù)據(jù)顯示，應用5-FU進行化療時口腔黏膜炎的發(fā)生率為28%左右[9]。主要是放化療損傷了口腔黏膜的基底細胞層，抑制新細胞的形成或已經(jīng)存在的細胞遷移到黏膜表面脫落，導致口腔黏膜變薄，出現(xiàn)紅斑進而形成潰瘍?；熕幹饕菑酿つは陆M織的血管中滲透進入口腔黏膜基底細胞中，對上皮基底層細胞功能有毒性作用并誘導凋亡，引起上皮層變薄和黏膜再生障礙，受損的上皮受到病原微生物的侵蝕，免疫功能降低，從而導致感染，因此口腔黏膜的病理變化是細胞毒藥物最常見的不良反應之一[10]。

體質(zhì)量的降低與口腔黏膜損傷后影響進食和吸收有關(guān)，因此體質(zhì)量變化可以用來評價模型成功及藥物治療作用的1個間接指標。本研究結(jié)果顯示，造模后，動物的體質(zhì)量明顯比用藥前降低，在第7天最顯著，而后逐漸恢復，而潛陽封髓丹中劑量組動物體質(zhì)量也有明顯降低，但體質(zhì)量降低程度明顯比模型組弱，恢復較快；潛陽封髓丹高劑量組動物體質(zhì)量無明顯變化。同樣，模型組動物從造模到第7天的平均日進食量明顯減少，給予潛陽封髓丹高、中劑量后動物的平均日進食量比模型組高，這與體質(zhì)量的增加一致，提示給予上述藥物后對于劃傷加5-FU誘導的口腔黏膜炎有一定的緩解作用。

從口腔黏膜宏觀評分可以看出，在第7、14天時，模型組評分較高，說明造模對金黃地鼠起到了一定的損傷作用，且在評分來看，作用比較明顯。在第14天時，給與潛陽封髓丹各劑量組與模型組相比有明顯降低黏膜損傷評分的作用，說明潛陽封髓丹給藥可改善病理損傷變化，加快金黃地鼠的損傷恢復。HE染色結(jié)果提示，模型組動物黏膜組織部分樣本中可見少量壞死肌細胞，胞核固縮深染；表皮層斷裂；真皮層局部結(jié)締組織成團脫落，并可見其嗜酸性減弱，炎細胞浸潤明顯。從病理分析結(jié)果可以看出，模型組的損傷比較嚴重。給予藥物后各組均可見有少量炎細胞浸潤，程度比模型組輕，這提示潛陽封髓丹給藥有改善病理損傷并且促進愈合的作用。

放化療誘導口腔黏膜炎的病理機理涉及炎癥反應和氧化應激。TNF-α和IL-1β等細胞因子被認為是炎癥標記物，參與了5-FU誘導的口腔黏膜炎的發(fā)病機制。SOD是抗氧化系統(tǒng)中主要的酶類抗氧化物之一，MDA是脂質(zhì)過氧化作用下產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物，其含量的高低能反應氧化應激水平。Barbosa等[11]研究發(fā)現(xiàn)用5-FU誘導倉鼠口腔黏膜炎，模型組動物的黏膜組織中炎癥標記物TNF-α、IL-1β等的表達上調(diào)，氨磷汀用藥可阻止其表達上調(diào)并降低TNF-α、IL-1β的免疫表達及免疫染色評分，從而證實了該藥物的抗炎作用，并暗示了其可能適用于治療口腔黏膜炎。本實驗研究結(jié)果顯示，造模處理明顯增加了金黃地鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量，潛陽封髓丹用藥對金黃地鼠血清中的炎癥因子TNF-α和IL-1β有明顯降低的作用，同時能夠降低金黃地鼠口腔黏膜組織中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量，但對SOD的活性影響不大。提示潛陽封髓丹可能是通過對抗金黃地鼠體內(nèi)炎癥反應和氧化應激水平來改善5-FU加劃傷誘導的口腔黏膜炎的病理變化。

綜上所述，潛陽封髓丹對劃傷加5-FU誘導的口腔黏膜炎有一定的改善作用，能夠降低金黃地鼠口腔頰囊組織宏觀評分，改善5-FU所致的頰囊組織病理損傷，其作用機制可能與降低金黃地鼠血清中炎癥標記物TNF-α和IL-1β的含量，降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量有關(guān)。