基于線粒體Cytb和D-Loop序列的大獺蛤5個(gè)地理群體遺傳多樣性研究

陳 康，王偉峰，陳秀荔，朱威霖，王煥嶺

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湖北武漢 430070；2.廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530021)

大獺蛤(Lutrariamaxima)隸屬雙殼綱(Bivalvia)，異齒亞綱(Heterodonta)，真瓣鰓目(Eulamellibranchia)，蛤蜊科(Mactridae)，獺蛤?qū)?，為營埋棲生活的二倍體貝類，廣泛分布于中國中南部沿海，北至福建省，南至海南省，尤其在北部灣地區(qū)較為豐富，目前通過人工養(yǎng)殖，已發(fā)展成為廣西、廣東等地淺海水產(chǎn)養(yǎng)殖的主要品種之一[1-3]。近年來，我國沿海地區(qū)建設(shè)了眾多高能耗、高排放的大型項(xiàng)目，大量生活污水和工業(yè)廢水排入海中，導(dǎo)致海水污染加重，赤潮暴發(fā)次數(shù)增加，水生生物棲息環(huán)境被嚴(yán)重破壞[4-5]。據(jù)相關(guān)報(bào)道，在北部灣貝類市場(chǎng)檢測(cè)的所有貝類生物中均含有麻痹性貝類毒素[6]，以貝類為主的經(jīng)濟(jì)物種面臨巨大的生存挑戰(zhàn)和繁殖壓力。另一方面，人工育種技術(shù)不斷成熟[7]，育種范圍相對(duì)集中，導(dǎo)致大獺蛤近親繁育加劇，很可能造成種質(zhì)資源不斷退化。因此，對(duì)大獺蛤野生群體的資源評(píng)估顯得十分必要。

為了促進(jìn)大獺蛤資源的可持續(xù)利用，本研究采用分析遺傳多樣性的方式為其遺傳育種和種質(zhì)資源的評(píng)估提供重要的依據(jù)[8]。由于多態(tài)性信息豐富、遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)和檢測(cè)手段相對(duì)簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，DNA分子標(biāo)記在群體遺傳結(jié)構(gòu)及其分化研究方面具有無可比擬的優(yōu)勢(shì)[9]。其中線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)是閉合、環(huán)狀的雙鏈DNA分子，其作為遺傳信息的重要載體，具有母系遺傳、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、進(jìn)化速度快、幾乎無重組及不同的區(qū)域進(jìn)化速度存在差異等特點(diǎn)，使得mtDNA成為一種重要的分子標(biāo)記[10]。在mtDNA中，細(xì)胞色素b(Cytochrome b，Cytb)和mtDNA控制區(qū)(又稱D-環(huán)區(qū)，control region displacement loop，D-Loop) 的進(jìn)化速度存在差異且變異速率快[11-12]。因此，利用Cytb和D-loop序列分析和對(duì)比不同群體mtDNA多態(tài)性，能夠揭示種內(nèi)或種間的親緣關(guān)系[13]。近年來，通過分析Cytb和D-Loop 序列的堿基信息檢測(cè)水生生物遺傳多樣性已被廣泛應(yīng)用，如基于Cytb基因序列發(fā)現(xiàn)中國養(yǎng)殖區(qū)和日本原產(chǎn)地的蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)出現(xiàn)明顯的遺傳分化[14]；王劍平等[15]基于Cytb基因發(fā)現(xiàn)洞庭湖河蜆(Corbiculafluminea)遺傳分化弱，變異主要來自群體內(nèi)；GUO等[16]利用Cytb和D-Loop序列得出西藏雅魯藏布江6個(gè)地理群體的裸裂尻魚(Schizopygopsisyounghusbandi)的遺傳多樣性水平較低，并且遺傳變異來自群體內(nèi)部，這些研究為水生生物種質(zhì)資源的開發(fā)與利用奠定了理論依據(jù)。

目前，關(guān)于大獺蛤的研究主要集中在營養(yǎng)成分分析與評(píng)價(jià)[17]、繁殖特性[18]及人工育苗[7,19]等方面。而關(guān)于大獺蛤種質(zhì)資源評(píng)估的研究鮮有報(bào)道，相關(guān)研究?jī)H見李斌等[20]采用形態(tài)學(xué)特征和RAPD技術(shù)，對(duì)3個(gè)地理群體的施氏獺蛤(L.siebaldii)與越南大獺蛤(L.maxima)遺傳差異進(jìn)行了比較分析。因此為了評(píng)估我國不同地理群體大獺蛤資源，本研究利用Cytb和D-Loop序列，對(duì)我國大獺蛤5個(gè)地理群體的遺傳多樣性、群體結(jié)構(gòu)和群體歷史動(dòng)態(tài)進(jìn)行分析，以期揭示大獺蛤種質(zhì)資源的遺傳背景，為大獺蛤的人工繁育和資源保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與DNA提取

大獺蛤分別采自廣西北海(BH)、廣西潿洲島(WZD)、廣東湛江(ZJ)、福建廈門(XM)和福建福州(FZ)5個(gè)地區(qū)(圖1)，取前后閉殼肌組織保存于95%乙醇中，用于基因組DNA的提取，每個(gè)群體的個(gè)體數(shù)及遺傳多樣性參數(shù)見表1。采用醋酸銨法[21]從肌肉組織中提取大獺蛤基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop測(cè)定DNA的質(zhì)量和濃度。

1.2 PCR擴(kuò)增

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中大獺蛤mtDNA全序列(Genbank：NC_036766.1)利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物用于擴(kuò)增Cytb和D-Loop序列。引物序列分別為，CytbF：5′ -TGCGGCTGTCTGGTATTGA-3′、CytbR：5′-AACCCTTTCATCGTCCCACTA -3′和D-Loop F：5′-ATTAGAATACGCCGTTGAAG-3′、D-Loop R：5′-GAGTAGTTACATCCTGCTTAC-3′，由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

PCR總反應(yīng)體積為10 μL，反應(yīng)體系為：10×PCR buffer 1 μL，dNTPs 0.4 μL，雙蒸水6.6 μL，DNA模板1 μL，ESTaqDNA聚合酶0.2 μL，左右引物各0.4 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性 94℃ 3 min，變性94℃ 30 s，退火30 s(D-Loop為52℃，Cytb為54℃)，延伸72 ℃(D-Loop為45 s，Cytb為105 s)，共32個(gè)循環(huán)，終延伸72℃ 7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，選擇目的條帶明顯且特異性好的PCR產(chǎn)物送武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

基于測(cè)序峰圖使用DNAstar軟件包[22]中的Seqman軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析校對(duì)，以確認(rèn)序列質(zhì)量，并與NCBI數(shù)據(jù)庫中公布的大獺蛤mtDNA進(jìn)行對(duì)比，獲得不同大獺蛤群體的Cytb和D-Loop序列。MEGA7.0[23]計(jì)算Cytb和D-Loop序列的堿基組成并使用鄰接法(neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用Bootstrap(重復(fù)次數(shù)1 000)檢驗(yàn)聚類樹各分支置信度。DNAsp5[24]獲得Cytb和D-Loop序列的核苷酸多樣性指數(shù)(nucleotide diversity，Pi)、平均核苷酸差異數(shù)(average number of nucleotide differences，K)、單倍型數(shù)(number of haplotypes，H)、單倍型多樣性指數(shù)(haplotype diversity，Hd)及多態(tài)位點(diǎn)數(shù)(number of polymorphic sites，S)。運(yùn)用Arlequin3[25]計(jì)算群體間的遺傳分化系數(shù)和擴(kuò)張參數(shù)τ，并結(jié)合中性檢驗(yàn)和核苷酸不配對(duì)分布曲線來推測(cè)大獺蛤種群的歷史動(dòng)態(tài)情況；根據(jù)公式τ= 2ut和T=t×(代時(shí))，估算種群擴(kuò)張時(shí)間T[26]。其中u=μk，μ為研究序列變異速率，k為研究的序列長度(bp)；大獺蛤性成熟約為1年，則代時(shí)為1[18]。本研究中，Cytb和D-loop的變異速度分別為(1.0%～2.5%)/百萬年[27]、(3%～10%)/百萬年[28]。

圖1 大獺蛤采樣分布圖 Fig.1 Sampling sites for L. maxima注：BH、WZD、ZJ、XM、FZ分別代表廣西北海、廣西潿洲島、廣東湛江、福建廈門、福建福州；●代表采樣點(diǎn)的位置Note：BH, WZD, ZJ, XM， FZ represent Beihai of Guangxi, Weizhou Island of Guangxi, Zhanjiang of Guangdong, Xiamen and Fuzhou of Fujian respectively；●indicates sampling site

表1 大獺蛤5個(gè)群體的遺傳多樣性參數(shù)Tab.1 Genetic diversity parameters of five populations of L. maxima

注：S：多態(tài)位點(diǎn)數(shù)；H：?jiǎn)伪缎蛿?shù)；Hd：?jiǎn)伪缎投鄻有灾笖?shù)；Pi：核苷酸多樣性指數(shù)；K：平均核苷酸差異數(shù)

Note:S: number of polymorphic sites;H: number of haplotypes;Hd: haplotype diversity;Pi: nucleotide diversity;K: average number of nucleotide differences

2 結(jié)果與分析

2.1 大獺蛤線粒體Cytb和D-Loop的序列特征和遺傳多樣性

測(cè)序結(jié)果經(jīng)軟件處理后分別獲得了大獺蛤Cytb基因序列(1 155 bp)和D-Loop序列(412 bp)。利用MEGA7軟件計(jì)算序列的堿基組成，結(jié)果顯示5個(gè)群體間Cytb和D-Loop序列的堿基含量基本一致，Cytb基因和D-Loop序列4種堿基T、C、A、G的平均含量分別占其全長的43.60%、13.53%、20.61%、22.26%和23.31%、25.25%、39.29%、12.16%，且兩序列的A+T含量明顯高于G+C含量(表2)，表現(xiàn)出了AT偏移，這與大多數(shù)水生動(dòng)物的已知模式一致。使用DNAsp5對(duì)大獺蛤5個(gè)地理群體的遺傳參數(shù)進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果顯示Cytb基因在5個(gè)群體的161個(gè)個(gè)體的核苷酸多樣性指數(shù)為0.002 3±0.001 4，單倍型多樣性為0.834 5±0.030 3，平均核苷酸差異數(shù)為2.631 3，共檢索到89個(gè)多態(tài)位點(diǎn)和73種單倍型。D-Loop序列在5個(gè)群體中159個(gè)個(gè)體的核苷酸多樣性指數(shù)為0.001 4±0.001 3，單倍型多樣性為0.445 6±0.049 8，平均核苷酸差異為0.562 7，共發(fā)現(xiàn)25個(gè)多態(tài)位點(diǎn)和27種單倍型。其中，北海群體的單倍型多樣性指數(shù)Cytb序列為0.903 2，D-Loop序列為0.584 9，該群體的單倍型也是比較豐富的(表1)。

2.2 大獺蛤種群的遺傳分化分析

在種群遺傳學(xué)中，遺傳分化指數(shù)(Fst)可反映群體間的遺傳分化程度，有學(xué)者將遺傳分化程度分為弱分化(Fst<0.05)、中度分化(0.05≤Fst≤0.25)、高度分化(Fst>0.25)3個(gè)等級(jí)[29]。本研究基于Cytb和D-Loop序列分析，北海、福州、潿洲島、廈門、湛江5個(gè)群體Fst分別在-0.008 0～0.010 1(P>0.05)和-0.014 3～-0.007 2(P>0.05)之間變動(dòng)，同時(shí)5個(gè)地理群體間的遺傳距離分別在0.001 8～0.002 9和0.000 8～0.002 0之間(表3,表4)。結(jié)果表明，每個(gè)群體之間遺傳分化程度都較弱(Fst<0.05)，遺傳距離較近，說明5個(gè)群體之間具有較高的遺傳同質(zhì)性。

基于Cytb對(duì)大獺蛤群體AMOVA分析表明：99.68%的差異屬于群體內(nèi)差異，0.32%為群體間差異(表5)；基于D-Loop對(duì)大獺蛤群體AMOVA分析表明：101.16%的差異屬于群體內(nèi)差異，-1.16%為群體間差異(表5)，表明群體內(nèi)遺傳變異遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于群體間的變異。

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹

基于Cytb基因(圖2-A)和D-Loop序列(圖2-B)的兩個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹都分為兩大支系，未形成明顯的單系群，5個(gè)地理群體間相互交叉，無明顯的地理群體聚類，與上述群體間遺傳距離弱、群體間分化指數(shù)Fst值低的結(jié)果相符。

表2 大獺蛤5個(gè)群體Cytb和D-Loop序列的堿基組成Tab.2 Base composition of Cytb and D-Loop sequences in five populations of L. maxima

注：BH、WZD、ZJ、XM、FZ分別代表廣西北海、廣西潿洲島、廣東湛江、福建廈門、福建福州

Note: BH, WZD, ZJ, XM， FZ represent Beihai of Guangxi, Weizhou Island of Guangxi, Zhanjiang of Guangdong, Xiamen and Fuzhou of Fujian respectively

表3 基于Cytb基因的大獺蛤群體間遺傳距離及遺傳分化指數(shù)FstTab.3 Genetic distance and fixation index (Fst) between every two populations of L. maxima based on Cytb gene

注：對(duì)角線下數(shù)據(jù)為群體間遺傳距離，對(duì)角線上數(shù)據(jù)為遺傳分化指數(shù)Fst；BH、WZD、ZJ、XM、FZ分別代表廣西北海、廣西潿洲島、廣東湛江、福建廈門、福建福州；Fst值均無顯著性(P>0.05)

Note：Data below the diagonal mean genetic distance, above the diagonal mean fixation indexFst; BH, WZD, ZJ, XM， FZ represent Beihai of Guangxi, Weizhou Island of Guangxi, Zhanjiang of Guangdong, Xiamen and Fuzhou of Fujian respectively; allFstvalues were not significant (P>0.05)

表4 基于D-Loop序列的大獺蛤群體間遺傳距離及遺傳分化指數(shù)FstTab.4 Genetic distance and fixation index (Fst) between every two populations of L. maxima based on D-Loop sequence

注：對(duì)角線下數(shù)據(jù)為群體間遺傳距離，對(duì)角線上數(shù)據(jù)為遺傳分化指數(shù)Fst；BH、WZD、ZJ、XM、FZ分別代表廣西北海、廣西潿洲島、廣東湛江、福建廈門、福建福州；Fst值均無顯著性(P>0.05)

Note：Data below the diagonal mean genetic distance, above the diagonal mean fixation indexFst; BH, WZD, ZJ, XM, FZ represent Beihai of Guangxi, Weizhou Island of Guangxi, Zhanjiang of Guangdong, Xiamen and Fuzhou of Fujian respectively; allFstvalues were not significant (P>0.05)

表5 大獺蛤5個(gè)地理群體Cytb和D-Loop序列的AMOVA結(jié)果Tab.5 AMOVA result of five populations based on Cytb and D-Loop sequences

注： Va、Vb 分別表示群體間變異和群體內(nèi)變異

Note: Va, Vb mean variations among populations and within populations

圖2 基于Cytb(A)基因和D-Loop(B)序列構(gòu)建大獺蛤單倍型NJ樹Fig.2 The NJ phylogenetic tree of L. maxima based on Cytb (A) and D-Loop(B) haplotypes注：每個(gè)群體的私有單倍型都用圓圈標(biāo)記，而群體之間的其他共享單倍型則不標(biāo)記。BH、WZD、ZJ、XM、FZ分別代表廣西北海、廣西潿洲島、廣東湛江、福建廈門、福建福州Note：The private haplotypes of each population are marked with circles, and the other shared haplotypes among populations are not marked. BH, WZD, ZJ, XM, FZ represent Beihai of Guangxi, Weizhou Island of Guangxi, Zhanjiang of Guangdong, Xiamen and Fuzhou of Fujian respectively

2.4 種群動(dòng)態(tài)

由于大獺蛤5個(gè)地理群體間的遺傳分化程度較弱，故分析其歷史動(dòng)態(tài)信息時(shí)將其看作一個(gè)整體，并依據(jù)Tajima’sD[30]和 Fu’sFS[31]值中性檢驗(yàn)和核苷酸不配對(duì)分布曲線來判定大獺蛤在過去是否發(fā)生了種群歷史擴(kuò)張。大獺蛤Cytb和D-Loop序列的中性檢驗(yàn)分析結(jié)果如表6所示?；贑ytb序列各群體的Tajima’D和Fu’sFS，均為負(fù)值，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析都存在顯著差異(P<0.05)，將5個(gè)群體作為一個(gè)整體進(jìn)行中性檢驗(yàn)，其Tajima’sD和 Fu’sFS值分別為-2.229 0(P<0.01)和-12.658 8(P<0.01)，Cytb序列核苷酸錯(cuò)配分布圖為單峰(圖3-A)?；贒-Loop序列各群體的Tajima’D和Fu’sFS，均為負(fù)值，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析都存在顯著差異(P<0.05)，將5個(gè)群體作為一個(gè)整體進(jìn)行中性檢驗(yàn)，其Tajima’sD和 Fu’sFS值分別為-1.943 2(P<0.05)和-6.248 6(P<0.05)，D-Loop序列核苷酸錯(cuò)配分布圖為單峰(圖3-B)。這些結(jié)果表明大獺蛤在歷史上發(fā)生過明顯的種群擴(kuò)張。在擬合度檢驗(yàn)中(表6)，基于Cytb和D-Loop序列分析，5個(gè)群體的偏離方差(sum of squared deviation)和Raggedness統(tǒng)計(jì)量(R)的值都較小，且大部分不存在顯著差異(P>0.05)。從整體來看，這兩個(gè)參數(shù)的值都較小，均未達(dá)到顯著水平(P>0.05)，同樣表明大獺蛤歷史上經(jīng)歷了種群擴(kuò)張?；贑ytb和D-Loop序列的平均擴(kuò)張參數(shù)τ值分別為1.523 8、1.038 7，推測(cè)出種群擴(kuò)張時(shí)間距今約為1.3×104～6.6×104年，表明大獺蛤種群擴(kuò)張時(shí)間約在更新世晚期。

表6 大獺蛤5個(gè)群體的中性檢驗(yàn)、擬合度檢驗(yàn)Tab.6 Neutrality test and test of goodness of fit in five populations of L. maxima

注：BH、WZD、ZJ、XM、FZ分別代表廣西北海、廣西潿洲島、廣東湛江、福建廈門、福建福州

Note：BH, WZD, ZJ, XM, FZ represent Beihai of Guangxi, Weizhou Island of Guangxi, Zhanjiang of Guangdong, Xiamen and Fuzhou of Fujian respectively

圖3 基于Cytb (A)和D-Loop (B)序列的大獺蛤5個(gè)群體核苷酸不配對(duì)分布圖Fig.3 Mismatch distribution of five populations based on Cytb (A) and D-Loop (B) sequences

3 討論

遺傳多樣性又稱基因多樣性，生物種群的遺傳多樣性是其物種進(jìn)化和環(huán)境適應(yīng)的基礎(chǔ)，遺傳多樣性缺乏可能會(huì)導(dǎo)致物種的資源衰退甚至瀕臨滅絕，豐富的遺傳多樣性能夠確保物種的延續(xù)，同時(shí)也為物種進(jìn)化提供充足的潛力。

3.1 遺傳多樣性

大獺蛤5個(gè)群體的線粒體Cytb基因序列中，檢測(cè)到89個(gè)多態(tài)位點(diǎn)和73個(gè)單倍型，單倍型多樣性為0.834 5±0.030 3；D-Loop基因序列中，檢測(cè)到25個(gè)多態(tài)位點(diǎn)和27個(gè)單倍型，單倍型多樣性為0.445 6±0.049 8，整體呈現(xiàn)出中等偏高的遺傳多樣性，但Cytb和D-Loop的核苷酸多樣性僅分別為0.002 3±0.001 4和0.001 4±0.001 3，處于一個(gè)較低水平。一般來說，當(dāng)群體數(shù)量足夠大并且在很長一段時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定，該群體中的高水平遺傳變異是可以維持的，而當(dāng)群體經(jīng)歷嚴(yán)重的瓶頸效應(yīng)時(shí)，隨機(jī)遺傳漂變將導(dǎo)致遺傳變異的大量喪失[11]。根據(jù)GRANT和BOWEN[32]提出的分類標(biāo)準(zhǔn)，以Hd=0.5、Pi=0.005為界，本研究結(jié)果與高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的模式相符。該遺傳多樣性模式的種群在歷史上有經(jīng)歷擴(kuò)張的可能，即某種群在數(shù)量急劇減少后，存留的優(yōu)良個(gè)體歷經(jīng)瓶頸效應(yīng)或建群效應(yīng)，突然快速繁衍發(fā)展為一個(gè)大種群的現(xiàn)象，在擴(kuò)張過程中，種群數(shù)量的增加導(dǎo)致了單倍型多樣性的提高，而無充足的時(shí)間去積累核苷酸變異，所以會(huì)產(chǎn)生單倍型多樣性較高而核苷酸多樣性較低的遺傳多樣性模式[33]。

基于Cytb基因獲得的5個(gè)大獺蛤地理群體的總體遺傳多樣性指數(shù)大于D-Loop序列的結(jié)果，通常情況下D-Loop序列獲得的種群遺傳變異大于Cytb基因[10]。目前有人發(fā)現(xiàn)mtDNA控制區(qū)D-Loop變異速率低于Cytb的現(xiàn)象，趙亮等[34]對(duì)太湖新銀魚(Neosalanxtaihuensis)Cytb和D-Loop序列采用貝葉斯(Bayes)MCMC模擬估測(cè)出Cytb相對(duì)速率為1.000±0.131，而D-Loop相對(duì)速率為0.859±0.261，Cytb的進(jìn)化速率相對(duì)比D-Loop高。

3.2 種群遺傳結(jié)構(gòu)

遺傳距離是反映不同物種或不同種群之間變異的常用參數(shù)。5個(gè)群體之間的遺傳距離幾乎處于同一水平，說明各群體之間的基因交流不受影響。ARNAUD等[35]認(rèn)為在幼蟲期具有浮游特性的海洋雙殼類生物具有很強(qiáng)的分散能力，大獺蛤具有大約12 d的浮游期[18]，在此期間一定程度上受到我國東南海暖流和東南部沿岸流的影響[36]，從而被動(dòng)地隨著海流擴(kuò)散和基因交流；此外我國大獺蛤苗種培育[19]的成功和工廠化育苗技術(shù)[7]的日漸成熟，導(dǎo)致各地大獺蛤群體之間交流加劇。

遺傳分化指數(shù)Fst是作為對(duì)種群遺傳分化評(píng)估的另一個(gè)重要指標(biāo)?；贑ytb的Fst值在-0.008 0～0.010 1之間，基于D-Loop的Fst值在-0.014 3 ～ -0.007 2之間，F(xiàn)st值結(jié)果也顯示5個(gè)群體間存在負(fù)值現(xiàn)象，表明群體內(nèi)差異大于群體間差異，同時(shí)根據(jù)WRIGHT[29]定義的標(biāo)準(zhǔn)和AMOVA分析結(jié)果表明，群體內(nèi)的變異遠(yuǎn)大于群體間的變異，說明各地理群體間不存在顯著的遺傳分化?；贑ytb基因和D-Loop序列構(gòu)建的NJ樹中，5個(gè)群體的單倍型相互混雜，未形成特定的地理聚群。這些結(jié)果表明各區(qū)域個(gè)體間的交配是隨機(jī)的，沒有顯著的遺傳分化。黃榮蓮等[37]在對(duì)貽貝(Pernaviridis)的研究中發(fā)現(xiàn)環(huán)境脅迫會(huì)對(duì)群體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。本研究采樣點(diǎn)福州(26°08′ N、119°30′ E)、廈門(24°48′ N、118°09′ E)和北海(21°48′ N、109°12′ E)為亞熱帶季風(fēng)性氣候；湛江(21°27′ N、110°37′ E)和潿洲島(21°04′ N、109°12′ E)為熱帶季風(fēng)性氣候，5個(gè)采樣地點(diǎn)的氣候、溫度和鹽度等環(huán)境因素都大致相同，這可能是遺傳分化弱的原因之一。

3.3 種群歷史動(dòng)態(tài)

通過分析種群的核苷酸不配對(duì)分布曲線的單峰或多峰類型，以及是否符合中性檢驗(yàn)，來推斷大獺蛤種群近期是否出現(xiàn)過種群擴(kuò)張事件[38]。當(dāng)種群偏離中性檢驗(yàn)，Tajima’D檢驗(yàn)會(huì)給出一個(gè)較低值。Fu’sFS值的負(fù)數(shù)越大表明由于種群擴(kuò)張或種群選擇導(dǎo)致中性偏離。整體來說，基于大獺蛤Cytb和D-Loop的Tajima’D和Fu’sFS值均為負(fù)值，且統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)顯著(P<0.05)，核苷酸錯(cuò)配分布曲線為單峰，說明大獺蛤種群歷史上可能經(jīng)歷過瓶頸和種群擴(kuò)張，上述的高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的分布模式也證明了這一點(diǎn)。根據(jù)平均τ值估算的大獺蛤種群擴(kuò)張時(shí)間距今約為1.3×104～ 6.6×104年，這個(gè)時(shí)期屬于更新世晚期，中國沿海海洋魚類的種群擴(kuò)張大多發(fā)生在該時(shí)期[39]。該時(shí)期由于冰期和間冰期的交替，導(dǎo)致海平面劇烈變化，使得海平面下降120 ～ 140 m，現(xiàn)生海洋物種在近期歷史上的擴(kuò)張大多受到這種冰期和間冰期交替的影響[40-41]。因此，大獺蛤種群可能經(jīng)歷了同樣的種群擴(kuò)張。

綜上所述，本研究基于線粒體Cytb和D-Loop序列對(duì)大獺蛤5個(gè)地理群體的遺傳多樣性進(jìn)行了分析。整體來說，各群體間遺傳距離較小，遺傳分化程度較弱，遺傳變異水平較低，可作為一個(gè)管理保護(hù)單位，且近期發(fā)生過種群擴(kuò)張事件；結(jié)合群體內(nèi)遺傳距離和平均遺傳多樣性指數(shù)，可以得出大獺蛤的遺傳多樣性處于一個(gè)中等的水平。但近年來東南沿海地區(qū)生態(tài)環(huán)境破壞的加劇和人工繁殖技術(shù)的日臻成熟，勢(shì)必會(huì)對(duì)大獺蛤的種質(zhì)資源造成潛在的威脅。因此在合理的開發(fā)利用下，有必要對(duì)野生資源進(jìn)行保護(hù)，以保證其行業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展。