新型冠狀病毒肺炎病原體診斷技術(shù)發(fā)展概述

張 雯，黃 鵬

(1.南昌大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院a.2017級(jí)； b.循證醫(yī)學(xué)中心； 2.江西省預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌330006)

2019年12月，中國(guó)武漢出現(xiàn)了一種由未知病原體引發(fā)的肺炎疫情，隨后這種病原體被鑒定為一種新型的冠狀病毒。目前，該新型冠狀病毒被命名為SARS-CoV-2，引起的肺炎被命名為COVID-19。SARS-CoV-2與過去引起流行的SARS-CoV(SARS冠狀病毒)和MERS-CoV(中東呼吸綜合征冠狀病毒)不同，但同屬于β冠狀病毒，SARS-CoV-2有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，常為多形性，直徑60～140 nm。從目前掌握的情況來看，SARS-CoV-2的潛伏期為1～14 d，多為3～7 d，以發(fā)熱、乏力、干咳為主要表現(xiàn)，重型患者多在1周后出現(xiàn)呼吸困難和(或)低氧血癥，嚴(yán)重者迅速進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒和凝血功能障礙等[1]。本文綜述SARS-CoV-2病原學(xué)診斷技術(shù)的發(fā)展，以期為該病的早期發(fā)現(xiàn)和診斷提供更多手段。

1 SARS-CoV-2的致病機(jī)制

1.1 結(jié)合血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)

冠狀病毒呈不規(guī)則形狀，直徑約60～220 nm。病毒外包著脂肪膜，膜表面有三種糖蛋白：刺突糖蛋白(spike protein，S蛋白)、小包膜糖蛋白(envelope protein，E蛋白)、膜糖蛋白(membrane protein，M蛋白)。冠狀病毒的S蛋白分為S1和S2 2個(gè)功能單位，S1通過結(jié)合宿主受體促進(jìn)病毒感染，它包括2個(gè)結(jié)構(gòu)域，即直接與宿主受體相互作用的N-末端結(jié)構(gòu)域和C-末端結(jié)構(gòu)域[2]。

國(guó)內(nèi)研究[3]表明SARS-CoV-2由呼吸道侵入人體后，通過S-蛋白與人的ACE2結(jié)合從而感染呼吸道上皮細(xì)胞，其結(jié)合力比SARS-CoV高10～20倍，所以傳染性更強(qiáng)[3]。ACE2為膜蛋白，在肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上有分布[4]。ACE2可將血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)分解為七肽血管緊張素1-7(angiotensin 1-7,Ang 1-7)，Ang 1-7具有舒張血管、抗炎、抗凝、抗纖維化的作用[5]，可以對(duì)AngⅡ引起的肺損傷具有保護(hù)作用[6-7]。

另外，最新發(fā)布的一篇報(bào)道[8]顯示，在深圳感染的12例患者中，AngⅡ含量明顯高于正常人，而且AngⅡ含量與肺損傷程度呈正相關(guān)，提示SARS-CoV-2可能與肺的ACE2結(jié)合，導(dǎo)致其無法水解AngⅡ，使得肺內(nèi)血管收縮、纖維化，最終導(dǎo)致肺炎發(fā)生。

1.2 引發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴

在SARS-CoV-2感染過程中，觀察到的肺組織病理特點(diǎn)是宿主免疫反應(yīng)加重，其特征是免疫細(xì)胞向肺部浸潤(rùn)[9]。學(xué)者由此猜測(cè)，機(jī)體的炎癥作用表達(dá)極可能是SARS-CoV-2致病重要機(jī)制[10]。

細(xì)胞因子風(fēng)暴(cytokine storm)是指機(jī)體感染微生物后引起體液中多種細(xì)胞因子迅速大量產(chǎn)生的現(xiàn)象，是引起急性呼吸窘迫綜合征和多臟器衰竭的重要原因。COVID-19患者從重型向危重型發(fā)展時(shí)，患者可出現(xiàn)嚴(yán)重低氧血癥、繼發(fā)重型感染，進(jìn)而發(fā)生休克，出現(xiàn)組織灌注障礙，甚至多器官功能衰竭[11]。這可能是因?yàn)镃OVID-19病毒的基因組及抗原性均不同以往的冠狀病毒，機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)新的、高致病的病原體可能產(chǎn)生了過激免疫應(yīng)答反應(yīng)。病毒感染后活化免疫細(xì)胞或者非免疫細(xì)胞，導(dǎo)致其釋放大量細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子繼續(xù)加重器官的損傷，患者會(huì)表現(xiàn)出一系列臨床癥狀，如高熱、肌肉酸痛、精神萎靡等，嚴(yán)重者可表現(xiàn)為血管滲漏效應(yīng)、低氧血癥、多器官毒性表現(xiàn)，甚至危及生命。而血管滲漏效應(yīng)會(huì)持續(xù)加重肺泡及肺組織中的滲出，進(jìn)一步加重低氧血癥，一旦形成惡性循環(huán)，病情會(huì)進(jìn)一步惡化。

2 SARS-CoV-2的診斷

2.1 分離培養(yǎng)和鑒定

病毒的分離和純化培養(yǎng)是診斷病毒感染的首要條件。從患者中提取的各種標(biāo)本(如鼻咽拭子、肺泡灌洗液、痰或肺組織、血液等)進(jìn)行培養(yǎng)分離得到SARS-CoV-2后，再用電子顯微鏡技術(shù)觀察研究病毒顆粒。ZHU等[12]在無菌杯中收集支氣管肺泡灌洗液樣品，將上清液接種在人氣道上皮細(xì)胞上。經(jīng)過三次傳代，得到表現(xiàn)出細(xì)胞病變作用的人氣道上皮細(xì)胞。在透射電子顯微鏡下觀察到特異性細(xì)胞病變的形態(tài)，并用從培養(yǎng)上清液中提取的RNA進(jìn)行克隆和測(cè)序基因組，從而成功地觀察和檢測(cè)出SARS-CoV-2。

病毒的純化和鑒定為之后進(jìn)行PCR或者基因測(cè)序做出重要鋪墊，也使得今后研發(fā)病毒疫苗和研制抗病毒藥物成為可能。

2.2 核酸檢測(cè)

根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》，規(guī)定對(duì)于疑似病例，具備以下病原學(xué)證據(jù)之一者即可確診：1)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)新型冠狀病毒核酸陽(yáng)性；2)病毒基因測(cè)序與已知的新型冠狀病毒高度同源。

2.2.1 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)

新型冠狀病毒基因序列的獲取，使快速開發(fā)針對(duì)SARS-CoV-2的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR診斷測(cè)試成為可能。新型冠狀病毒是RNA病毒，病毒中特異性RNA序列是區(qū)分該病毒與其他病原體的標(biāo)志物，因此核酸檢測(cè)是患者確診的主要手段。目前采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)其3個(gè)特異性基因：開放讀碼框架1a/b(ORF1a/b)、核殼蛋白(N)及包膜蛋白(E)基因。其中，ORF1a/b特異性最高，故作為確認(rèn)靶標(biāo)[9]。因PCR反應(yīng)模板僅為DNA，因此采用RT-PCR，即在進(jìn)行PCR反應(yīng)前，需將新型冠狀病毒核酸(RNA)逆轉(zhuǎn)錄為DNA，再進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。在PCR反應(yīng)體系中，包含一對(duì)特異性引物以及一個(gè)Taqman探針，如果反應(yīng)體系中存在靶序列，就能發(fā)出熒光。每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子產(chǎn)生。病毒核酸濃度越高，熒光定量PCR儀監(jiān)測(cè)的Ct值(即達(dá)到設(shè)定熒光閾值所需要的循環(huán)數(shù))越小。通過熒光定量PCR所得到的樣本Ct值的大小，可以知道患者樣本中新型冠狀病毒的濃度。

實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)可明顯提高檢測(cè)SARS-CoV-2的特異性和敏感性。該法可用于檢測(cè)各類型生物樣本(血液、痰液、呼吸道分泌物等)中SARS-CoV-2的RNA。但是普通型COVID-19患者隨著機(jī)體免疫系統(tǒng)的較快激活和增強(qiáng)，體內(nèi)病毒被清除或抑制在低水平，因此有的病例在早期呈現(xiàn)出SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陰性[13]。而且除呼吸道樣本外，COVID-19患者的其他生物樣本行SARS-CoV-2核酸檢測(cè)鮮有報(bào)告。

2.2.2 病毒基因測(cè)序

與前述RT-PCR相比，高通量測(cè)序技術(shù)(又稱“下一代”測(cè)序技術(shù)，next-generation sequencing technology，NGS)有著不可替代的顯著優(yōu)勢(shì)。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)(RNA-Seq)可以檢測(cè)生物體內(nèi)的RNA病毒、DNA病毒、細(xì)菌、真核生物等。RNA-Seq不僅可以檢測(cè)，而且還能揭示病原體豐度、變異情況、基因表達(dá)等信息[14]。RNA-Seq就是把NGS應(yīng)用到由RNA逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA上，從而獲得來自不同基因的RNA片段在特定樣本中的含量。其基本原理是邊合成邊測(cè)序，即測(cè)序過程以DNA單鏈為模板，在復(fù)制過程中合成互補(bǔ)鏈時(shí)，利用帶有熒光標(biāo)記的dNTP發(fā)出不同顏色的熒光來確定不同的堿基。用可逆的保護(hù)基團(tuán)封閉新加入dNTP的末端，既保證單次反應(yīng)只能加入單個(gè)堿基，又能在該堿基讀取完畢后，將可逆的保護(hù)基團(tuán)除去，使得下一個(gè)dNTP連接可繼續(xù)進(jìn)行。最后，熒光信號(hào)被成像系統(tǒng)所采集，獲得目標(biāo)RNA的堿基序列。若患者支氣管肺泡灌洗液或咽拭子中含有與已知的新型冠狀病毒高度同源的核酸，則能夠確診。

最近，DI等[15]開發(fā)了一種基于Tn5轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序快速建庫(kù)方法，該方法縮短了建庫(kù)的用時(shí)，而且需求的樣本量較小，可以應(yīng)用于高質(zhì)量的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，或許能夠提升SARS-CoV-2等樣本的病毒檢出率和速度?？傮w上看，NGS適用于最初病毒的鑒定和后期病毒的進(jìn)一步研究，雖然NGS診斷SARS-CoV-2感染者的準(zhǔn)確度高，當(dāng)測(cè)序結(jié)果與已知SARS-CoV-2序列高度同源時(shí)便可確診，但測(cè)序所需時(shí)間較長(zhǎng)，設(shè)備要求較高，不適用于臨床快速大批量診斷。

總之，對(duì)于SARS-CoV-2核酸檢測(cè)結(jié)果是否準(zhǔn)確，需要綜合分析樣本類型、標(biāo)本的采集保存與運(yùn)輸(RNA易降解)、患者感染周期等影響因素，了解各種標(biāo)本中病毒含量以及出現(xiàn)時(shí)間的不同，這是確診SARS-CoV-2感染患者及判斷患者恢復(fù)的關(guān)鍵。另外，實(shí)驗(yàn)室人員操作、核酸提取、試劑盒性能等都能造成檢測(cè)結(jié)果假陰性或假陽(yáng)性，故實(shí)驗(yàn)室需要質(zhì)量控制與臨床評(píng)價(jià)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析相結(jié)合[16-17]。

2.3 血清免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)

針對(duì)SARS-CoV-2的IgM和IgG抗體，目前已有多家生物公司研發(fā)出可供檢測(cè)的膠體金試劑(免疫層析法)，這為SARS-CoV-2感染的輔助診斷和流行病調(diào)查提供了一個(gè)極好的檢測(cè)手段。但比較于核酸檢測(cè)，免疫膠體金法的敏感度和特異性弱，假陽(yáng)性率和假陰性率更高。國(guó)內(nèi)深圳亞輝龍等公司已經(jīng)研發(fā)了的化學(xué)發(fā)光試劑盒，能夠用于檢測(cè)新型冠狀病毒IgM、IgG抗體及抗原。該試劑盒能夠自動(dòng)化批量檢測(cè)，而且可供基層醫(yī)院使用。血清免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)其臨床實(shí)驗(yàn)室的操作要求相對(duì)要低，適用于篩查及流行病學(xué)調(diào)查，但其病毒檢出率還需要進(jìn)一步提高。有報(bào)告[18]顯示，血清免疫學(xué)檢測(cè)的靈敏度和特異度分別為88.66%和90.63%。

目前，SARS-CoV-2的現(xiàn)有診斷方法比較見表1。

表1 SARS-CoV-2的現(xiàn)有診斷方法比較

3 SARS-CoV-2的輔助檢查

國(guó)家衛(wèi)健委發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第六版)》[1]中，建議開展C反應(yīng)蛋白、降鈣素原、鐵蛋白、D-二聚體、淋巴細(xì)胞總數(shù)及亞群、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、INF-γ等反映機(jī)體炎癥和免疫狀態(tài)的指標(biāo)監(jiān)測(cè)，有助于判斷臨床進(jìn)程、預(yù)警重癥、危重癥傾向，并為治療策略的制訂提供依據(jù)。

3.1 免疫細(xì)胞

免疫細(xì)胞是指參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞等。當(dāng)受到新型冠狀病毒感染時(shí)，肺炎患者的白細(xì)胞下降、淋巴細(xì)胞下降、嗜酸性粒細(xì)胞下降、T淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)下降(包括CD3、CD4、CD8)，并呈現(xiàn)出骨髓抑制和細(xì)胞免疫功能下降的特征[19]。人體樣本和動(dòng)物模型均證實(shí)，SARS-CoV-2感染后，肺部可發(fā)生單核巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的堆積，這些細(xì)胞正是細(xì)胞因子和炎性趨化因子的主要產(chǎn)生來源[20-21]。

WANG等[22]最新發(fā)表的關(guān)于COVID-19患者尸檢病理結(jié)果也顯示，外周血液樣本中，CD4+和CD8+T細(xì)胞被過度激活，較高的HLA-DR(CD4 3.47%)與CD38(CD8 39.4%)雙陽(yáng)性比例證實(shí)了這一點(diǎn)。CD4+T細(xì)胞中具有高度促炎效應(yīng)的CCR4+CCR6+Th17細(xì)胞濃度增高，而CD8+T細(xì)胞表現(xiàn)為高濃度的細(xì)胞毒性顆粒，從而證實(shí)以輔助性T細(xì)胞17(helper T cell 17，Th17)的增加和CD8+T細(xì)胞的高細(xì)胞毒性為表現(xiàn)的T細(xì)胞過度活化，導(dǎo)致該患者的嚴(yán)重免疫損傷。

3.2 細(xì)胞因子

SARS-CoV-2感染所導(dǎo)致細(xì)胞因子風(fēng)暴原因尚存爭(zhēng)議，但研究者通過對(duì)同為冠狀病毒感染引起的疾病SARS及MERS患者樣本及動(dòng)物模型的研究，發(fā)現(xiàn)了一些可能的關(guān)鍵因素。有研究[23-26]發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV和 MERS-CoV在感染細(xì)胞后均能發(fā)生快速?gòu)?fù)制，并在短期內(nèi)達(dá)到高滴度水平。這種病毒早期快速?gòu)?fù)制模式可引起受感染的肺上皮細(xì)胞短期內(nèi)分泌大量的早期反應(yīng)細(xì)胞因子，而這些早期反應(yīng)細(xì)胞因子會(huì)引起炎性細(xì)胞大量滲入肺部，引起免疫激化作用[27-28]。當(dāng)病毒感染入血后，單核/巨噬細(xì)胞所釋放的細(xì)胞因子激活了適應(yīng)性免疫應(yīng)答系統(tǒng)，出現(xiàn)免疫級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，并且隨著病毒感染的加重、受累臟器的增多，會(huì)增加治療的復(fù)雜程度。因此，檢測(cè)新型冠狀病毒肺炎患者血液中細(xì)胞因子水平，能夠反映機(jī)體炎癥程度，可以提前預(yù)示病情進(jìn)展，甚至能成為解除患者急性炎癥狀態(tài)的治療靶點(diǎn)[9]。

4 結(jié)語(yǔ)

目前，檢測(cè)SARS-CoV-2有多種方法。病原學(xué)檢測(cè)方法(即通過體外培養(yǎng)分離病毒)耗時(shí)較長(zhǎng)，分離陽(yáng)性率不高，血清學(xué)方法難以對(duì)病毒感染進(jìn)行早期診斷，核酸檢測(cè)可明顯提高檢測(cè)的特異性和敏感性。綜上所述，為應(yīng)對(duì)臨床上樣本數(shù)量多、檢測(cè)速度快、結(jié)果準(zhǔn)確等要求，核酸檢測(cè)仍然是新型冠狀病毒的首要檢測(cè)方法。但是面對(duì)臨床標(biāo)本的多樣性和復(fù)雜性，實(shí)際工作中仍然無法避免實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陰性和假陽(yáng)性。例如患者的肺泡灌洗液標(biāo)本粘稠、富含蛋白質(zhì)、含有自身成分干擾等，這些情況都會(huì)給診斷帶來一定的困難。因此，臨床應(yīng)用中需取長(zhǎng)補(bǔ)短，增強(qiáng)實(shí)用性，提高病毒的快速診斷和鑒別診斷的能力。當(dāng)然，相信隨著科研工作的不斷深入，將會(huì)出現(xiàn)更快更準(zhǔn)的方法用于SARS-CoV-2感染的早期發(fā)現(xiàn)和臨床診斷。