不同植被根際土壤中可培養(yǎng)與未培養(yǎng)黏細菌的多樣性研究

原紅娟　朱紅惠

摘要：為探索不同植被根際可培養(yǎng)黏細菌與未培養(yǎng)黏細菌的多樣性，采用傳統(tǒng)的輔助菌誘導方法，對樣品的黏細菌進行分離純化，通過形態(tài)特征結(jié)合16S rDNA基因的序列分析，確定黏細菌菌株的系統(tǒng)分類地位;利用基于黏細菌特異性引物的變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）分析黏細菌的多樣性。結(jié)果顯示，從不同植被根際土壤中共分離得到19株，初步鑒定為黏球菌屬（Myxococcus）11株，珊瑚球菌屬（Corallococcus）13株，孢囊桿菌屬（Cystobacter） 2株，多囊菌屬（Polyangium）1株，其中，紅樹林分離得到的黏細菌種類最多，共7株;樟木最少，為2株。PCR-DGGE分子指紋圖譜技術(shù)對其黏細菌多樣性結(jié)果顯示，花梨木、鐵木、亞熱帶常綠闊葉林、針葉林、紅樹林、樟木根際土壤中黏細菌的物種豐度分別為16、24、34、26、30、24，多樣性指數(shù)分別為2.10、2.53、3.49、2.62、2.77、2.73。DGGE指紋圖譜顯示，越南不同植被根際土壤存在大量的未培養(yǎng)黏細菌，其技術(shù)研究黏細菌多樣性比傳統(tǒng)分離純化的方法方便、快速。本研究為黏細菌開發(fā)利用和多樣性研究提供理論與技術(shù)參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：PCR-DGGE（聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳）;根際土壤;黏細菌;多樣性

中圖分類號： S182文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）07-0264-05

黏細菌是一類革蘭氏陰性細菌，具有復雜的形態(tài)發(fā)生行為[1]，可形成多細胞的子實體結(jié)構(gòu)和抗逆的黏孢子。在系統(tǒng)進化上，黏細菌位于變形菌門（Proteobacteria）的δ變形菌亞綱（Deltaproteobacteria）[2]，共分屬3個亞目、8個科、23個屬、50多個種[3-7]。黏細菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物具有結(jié)構(gòu)新穎、種類多、作用機制多樣的特性，目前被公認為是僅次于放線菌之后的第二類藥源微生物的新類群[8-9]。

目前，對黏細菌的多樣性研究一直以來都是采用平板培養(yǎng)分離方法[10-15]，這種傳統(tǒng)分離方法不僅耗時耗力，而且不能很好地反映土壤黏細菌多樣性的初始狀態(tài)，因為土壤中許多存活但不可培養(yǎng)的黏細菌不能被分離與鑒定。利用分子生物學方法可以克服傳統(tǒng)分離方法的缺陷[16]。目前尚未有不同植被根際土壤可培養(yǎng)與未培養(yǎng)黏細菌多樣性研究的相關(guān)報道。本研究采用傳統(tǒng)的輔助菌誘導方法，對樣品的黏細菌進行分離純化，通過形態(tài)結(jié)合16S rDNA基因的序列分析，確定黏細菌的系統(tǒng)分類地位;利用基于黏細菌特異性引物的變性梯度凝膠電泳（DGGE）[17]分析黏細菌的多樣性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集 采集越南菊芳國家公園花梨木、鐵木、亞熱帶常綠闊葉林、針葉林、紅樹林和樟木的根際土壤，為防止霉菌的污染，立即自然室溫風干，放入4 ℃冷庫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要培養(yǎng)基[7] 水瓊脂培養(yǎng)基 （WCX） 、VY/2 培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理 取風干的土樣2.5～3.0 g，用含100 μg/mL放線菌酮的無菌水浸泡過夜，6 000 r/min 離心5 min收集樣品。

1.2.2 黏細菌子實體的誘導 用E.coil、Achromobacter sp.2種被捕食菌菌漿在WCX培養(yǎng)基上劃十字交叉線，30 min后在十字線交叉點處接種大豆大小的經(jīng)放線菌酮處理的土樣，30 ℃恒溫培養(yǎng)，4 d后觀察子實體的形成。

1.2.3 純化與保藏 挑取可疑菌株接種于LB 液體培養(yǎng)基進行驗純，純化的菌株分別用VY/2斜面培養(yǎng)基、15%甘油及凍干管保藏。

1.2.4 土壤DNA的提取及擴增 土壤DNA的提取使用Magen公司的土壤DNA提取試劑盒，按照說明書進行。PCR擴增：mglA基因的半巢式PCR擴增[18]，使用引物分別為mglA1F（5′-[JP9]CGCGAAATCAACTGCAAGAT-3′）與mglA5R（5′-[JP9]GGCAGGTCGCGCTTGTTGTACTG-3′）;及引物mglA4F（5′-[JP9]CAGGTGTTCTACGACGCCA-3′）與 mglA5R（5′-[JP9]GGCAGGTCGCGCTTGTTGTACTG-3′）[19]。PCR擴增體系均為25 μL：10×PCR 緩沖液5.0 μL，10 μmol/L dNTPs 1.0 μL，10 μmol/L mglA1F（或mglA4F）1 μL，10 μmol/L mglA5R 1 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，ddH2O 20 μL。第1輪PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min;95 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共進行35 個循環(huán);最后72 ℃ 延伸10 min。第2輪PCR采用touch-down PCR，反應條件為：95 ℃預變性5 min;95 ℃變性45 s，65 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，10個循環(huán);95 ℃ 變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，25個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。反應完成后，PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，4 ℃保存待用。

1.2.5 DGGE分析

DGGE參考Muyzer等的方法[17]，所用的儀器為美國Bio-rad公司的DCodeTM Universal Mutation Detection System電泳系統(tǒng)。DGGE電泳所用的膠濃度為8% （丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺37.5 ∶1），變性劑為尿素和甲酰胺，其濃度梯度為40%～75%，電泳緩沖液為1×TAE，上樣緩沖液為溴酚藍，電泳電壓70 V，電流100 mA，電泳時間720 min。將第2次PCR產(chǎn)物濃縮至20 ?μL用于DGGE分析。電泳完成后，將DGGE產(chǎn)物于Goldview核酸染色劑染色0.5 h，凝膠成像儀中觀察結(jié)果并照相。利用Quantity One軟件分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植被根際土壤性質(zhì)

土壤微生物的量受植被類型的影響，不同的植被類型由于其地上部分生物量的差異，使得土壤中的有機碳量明顯不同，不同種類的植被，其枯落物的質(zhì)量也不盡相同，這2個因素均會影響土壤微生物的活動[20]。由表1可見，土壤平均水溶性鹽含量為9.90 g/kg，其中鐵木的最低，為4.40 g/kg，樟木的最高，為15.50 g/kg。土壤平均有機質(zhì)含量較高，為58.54 g/kg，紅樹林最高，為106.64 g/kg，針葉林最低，為14.40 g/kg。pH 值為4.68～6.47，偏酸。

2.2 不同植被根際土壤可培養(yǎng)黏細菌的分類鑒定

黏細菌的形態(tài)特征主要包括營養(yǎng)細胞形態(tài)、子實體形態(tài)、黏孢子形態(tài)以及它們特征性的菌落結(jié)構(gòu)。黏細菌的分類主要保持在形態(tài)上，且由于其形態(tài)的復雜性決定著形態(tài)分類比其他細菌更為可靠[1]。Sprer等曾證實了形態(tài)分類是與黏細菌在種水平上的分類相吻合的試驗，并認為形態(tài)分類對黏細菌新種鑒定仍是一種可靠的手段[21]。根據(jù)《Bergeys Manual of Determinative Bacteriology》 （第九版）[22]和《Prokayotes》（第二版）[23]的黏細菌分類標準，分離得到黏球菌屬（Myxococcus）11株、珊瑚球菌屬（Corallococcus）13株、孢囊桿菌屬（Cystobacter）2株（未純化）、多囊菌屬（Polyangium）1株，其中，紅樹林分離得到的黏細菌種類最多，共7株，其次是鐵木和亞熱帶常綠闊葉林，均為6株，花梨木和針葉林均為3株，樟木最少，為2株（表2）。

橙色黏球菌（Myxococcus fulvus）的子實體橘黃色、球形且比較黏滑;黃色黏球菌（Myxococcus ?xanthus）的子實體黃色、球狀、表面光滑，黏液較多;弱小珊瑚球菌（Corallococcus exiguous）為白色，球形，在自然條件下的子實體較小;珊瑚狀珊瑚球菌（Corallococcus coralloides）的子實體形態(tài)多樣，波浪狀或珊瑚狀，黃色，較黏滑;孢囊桿菌屬（Cystobacter）的孢子囊無柄、單個或成群，圓形或盤卷， 褐色; 葉柄黏球菌（Myxococcus stipitatus）是帶柄的黏球菌，子實體黃色或粉色，表面光滑;多囊菌屬（Polyangium）子實體白色或粉色，圓形、刻蝕培養(yǎng)基（圖1）。

2.3 不同植被根際土壤可培養(yǎng)黏細菌的分子鑒定

黏細菌菌株結(jié)合16S rDNA 進行序列分析，將其鑒定到屬。6種不同植被根際土壤可培養(yǎng)的黏細菌共分離得到19株，依據(jù)黏細菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及16S rDNA 序列分析（圖2），利用5個不同種屬的黏細菌建立的系統(tǒng)發(fā)育樹，初步鑒定黏細菌分屬于3個屬，Ⅰ類為黏球菌屬（Myxococcus），Ⅱ類為珊瑚球菌屬（Corallococcus），Ⅲ類為多囊桿菌屬（Polyangium）。

2.4 DGGE分析不同植被根際土壤黏細菌的多樣性

不同植被根際土壤黏細菌DGGE圖譜見圖3。由表3可知，花梨木、鐵木、亞熱帶常綠闊葉林、針葉林、紅樹林、樟木根際土壤中黏細菌的物種豐度（S）分別為16、24、34、26、30、24，多樣性指數(shù)（H ）分別為 2.10、2.53、3.49、2.62、2.77、2.73，與可培養(yǎng)黏細菌（表2）相比，土壤中存在大量的未培養(yǎng)黏細菌。而樣本間的相似性系數(shù)（表4）表明，花梨木與針葉林土壤樣品黏細菌相似性系數(shù)最低，為2.4%，鐵木與紅樹林土壤樣品黏細菌相似性系數(shù)最高，為47.4%，說明不同植被下黏細菌群落結(jié)構(gòu)存在差異。

3 討論與結(jié)論

本試驗中6種植被根際土壤性質(zhì)為含鹽量較低，有機質(zhì)含量較高，土質(zhì)偏酸性。黏細菌通常出現(xiàn)在中性至微堿性的土壤中，在pH值較低的環(huán)境中，可能因其營養(yǎng)缺乏，一般僅有黃色黏球菌（Myxococcus xanthus）、 橙色黏球菌（Myxococcus fulvus）、變綠黏球菌（Myxococcus virescens）和珊瑚狀珊瑚球菌（Corallococcuscoralloides），偶爾出現(xiàn)多囊菌（Polyangiun） 和蝶形囊球菌（Angiococcus disciformis）。真正的嗜酸性黏細菌還有待繼續(xù)發(fā)現(xiàn)[24-25]。本研究的土壤pH值為 4.68～6.47，除了通?？梢苑蛛x得到的黏球菌屬和珊瑚球菌屬，還分離得到在酸性環(huán)境中少見的多囊菌屬與在酸性環(huán)境中未曾報道的孢囊桿菌屬，這與黏細菌子實體和黏孢子具有很強的抗逆性，以及越南特殊的土壤微環(huán)境有關(guān)，使較多種類的黏細菌更適合生存;同時也進一步說明，在酸性環(huán)境條件下，不同植被的根際土壤，能為黏細菌提供不同的食物基礎(chǔ)和生存生境，黏細菌的多樣性也存在差異，6個樣品中，樟木根際土壤只分離到2株珊瑚狀珊瑚球菌，得到的可培養(yǎng)黏細菌最少;其次是花梨木，分離得到2株橙色黏球菌和1株珊瑚狀珊瑚球菌，針葉林分離到2株橙色黏球菌和1株弱小珊瑚球菌;鐵木和亞熱帶常綠闊葉林較多，均為6株，鐵木分別為黃色黏球菌、珊瑚狀珊瑚球菌、弱小珊瑚球菌和孢囊桿菌，亞熱帶常綠闊葉林為黃色黏球菌、珊瑚狀珊瑚球菌、弱小珊瑚球菌和多囊菌;紅樹林分離得到的最多，包括橙色黏球菌、黃色黏球菌、葉柄黏球菌、珊瑚狀珊瑚球菌、弱小珊瑚球菌和孢囊桿菌，共7株。

為了有效避免在傳統(tǒng)分離純化過程中造成的黏細菌遺傳多樣性信息的丟失，使得分析結(jié)果更真實、全面地反映黏細菌群落結(jié)構(gòu)，利用DGGE圖譜進一步分析6種不同植被根際土壤的黏細菌多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)土壤中可能存在大量的難培養(yǎng)黏細菌或未培養(yǎng)黏細菌的資源，在分離純化過程中，黏細菌純化過程相對較長且不易純化，可能與土壤中黏細菌的伴生菌難以分離有關(guān)，其原因須進一步研究。另一原因，可能由于越南地處北回歸線以南，雨量充沛，年平均降水量1 500～2 000 mm，是典型的熱帶地區(qū)，霉菌污染相對較多。由于其特殊的地理環(huán)境，需對越南黏細菌挖掘篩選方法進一步改善，以期獲得更多的黏細菌類群，豐富黏細菌資源。不同植被覆蓋的根際土壤黏細菌資源不同，且有明顯差異，說明不同植被覆蓋的根際土壤微生境不同，從而決定其群落結(jié)構(gòu)的差異，不同的群落結(jié)構(gòu)可能存在不同的黏細菌類群。

到目前為止，熱帶亞熱帶根際土壤黏細菌分離純化這一特殊生境中黏細菌資源的研究尚處于啟蒙階段，特別是在酸性環(huán)境條件下的黏細菌研究，還須繼續(xù)探索分離純化方法。黏細菌是一類天然藥物篩選資源，在其活性篩選、代謝產(chǎn)物等方面，有待進一步研究。

參考文獻：

[1]Reichenbach H. The order Cytophagales[M]//Balous A，Trüper H G，Dworkin M，et al . The prokaryotes. 2nd ed . New York：Spriger-Verlag，1992：3631-3675.

[2]Kaiser D，Losick R. How and why bacteria talk to each other[J]. Cell，1993，73（5）：873-885.

[3]Mohr K I，Garcia R O，Gerth K，et al. Sandaracinus amylolyticus gen.nov.，sp.nov.，a starch-degrading soil myxobacterium，and description of Sandaracinaceae fam.nov[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2012，62（5）：1191-1198.

[4]Iizuka T，Jojima Y，Hayakawa A，et al. Pseudenhygromyxa salsuginis gen.nov.，sp.nov.，a myxobacterium isolated from an estuarine marsh[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2013，63（4）：1360-1369.

[5]Garcia R O，Reichenbach H，Ring M W，et al. Phaselicystis flava gen.nov.，sp.nov.，an arachidonic acid-containing soil myxobacterium，and the description of Phaselicystidaceae fam.nov[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2009，59（6）：1524-1550.

[6]Kathrin I M，Ronald O G，Klaus G，et al. Sandaracinus amylolyticus gen.nov.，sp.nov.，astarch-degrading soil myxobacterium，and description of Sandaracinaceae fam.nov[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2012，62（5）：1191-1198.

[7]Shimkets L J，Dworkin M，Reichenbach H. The myxobacteria[M]// Dworkin M. The prokaryotes. 3rd ed. Berlin：Springer，2006：31-115.

[8]Reichenbach H. Myxobacteria，producers of novel bioactive substances[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2001，27（3）：149-156.

[9]Wenzel S C，Müller R. Myxobacteria-‘microbial factories for the production of bioactive secondary metabolites[J]. Molecular Biosystems，2009，5（6）：567-574.

[10]李越中，陳 琦. 海洋微生物資源多樣性[J]. 生物工程進展，1998. 18（4）：34-40.

[11]李越中，李 健，周 璐，等. 我國黏細菌（Myxobacteria）資源的分離與鑒定[J]. 微生物學報，2000，40（6）：652-656.

[12]方曉梅，張利平. 黏細菌生態(tài)多樣性的初步研究[J]. 生物多樣性，2001，9（3）：207-213.

[13]李艷青，張利平，楊潤蕾. 河北省黏細菌物種資源多樣性的研究——承德市區(qū)及其五縣生態(tài)樣品的研究[J]. 河北科技大學學報，2005，26（3）：215-218，224.

[14]張鮮姣，黎志坤，譚志遠，等. 新疆阿克蘇地區(qū)鹽堿地黏細菌分離鑒定[J]. 微生物學報，2012，52（2）：160-168.

[15]趙智穎，張鮮姣，譚志遠，等. 藥用植物根系土壤可培養(yǎng)黏細菌的分離鑒定[J]. 微生物學報，2013，53（7）：657-668.

[16]李友發(fā)，宋 兵，宋亞娜，等. 福建省稻田土壤細菌群落的16S rDNA-PCR-DGGE分析[J]. 微生物學通報，2008，35（11）：1715-1720.

[17]Muyzer G，de Waal E C，Uitterlinden A G. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA[J]. Applied and Environmental Microbiology，1993，59（3）：695-700.

[18]Oros-Sichler M，Gomes N C M，Neuber G，et al. A new semi-nested PCR protocol to amplify large 18S rRNA gene fragments for PCR-DGGE analysis of soil fungal communities[J]. Journal of Microbiological Methods，2006，65（1）：63-75.

[19]李百元.新疆鹽堿地黏細菌的分離及多樣性的研究[D]. 北京：中國科學院大學，2013.

[20]徐秋芳.森林土壤活性有機碳庫的研究[D]. 杭州：浙江大學，2004.

[21]Sprer C，Reichenbach H，Stackebrandt E. The correlation between morphological and phylogenetic classification of myxobacteria[J]. International Journal of Systematic Bacteriology，1999，49（3）：1255-1262.

[22]Reichenbach H. The Myxococcales[M]//Garrity G M.Bergeys manual of systematic bacteriology：Part 3：The alpha-，beta-，delta-，and epsilon-proteobacteria. 2nd ed. New York：Springer-Verlag，2005：1059-1143.

[23]Reichenbach H，Dworkin M.The Myxobacteria[M]// Balous A，Trüper H G，Dworkin M，et al . The prokaryotes. 2nd ed . New York：Spriger-Verlag，1992：3416-3487.

[24]Dawid W. Biology and global distribution of myxobacteria in soils[J]. FEMS Microbiology Reviews，2000，24（4）：403-427.

[25]Li B Y，Yao Q，Zhu H H. Approach to analyze the diversity of myxobacteria in soil by semi-nested PCR-denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE）based on taxon-specific gene[J]. PLoS One，2014，9（10）：e108877.