西羅莫司對心肌梗死大鼠心肌纖維化的治療作用及其機(jī)制

陳俊文，劉益，鐘偉宏香港大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東深圳58000；深圳市婦幼保健院

心肌梗死是臨床常見病，心肌梗死后患者會(huì)有不同程度的順應(yīng)性心臟重構(gòu)和心力衰竭[1]。心肌纖維化、炎癥、細(xì)胞凋亡和血管內(nèi)皮功能障礙是心肌梗死后心臟重構(gòu)的典型特征[2]。心肌纖維化以細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)膠原分泌增加，降解減少，膠原比例失調(diào)為主要特征的病理變化，過度心肌纖維化可改變心肌的收縮性和傳導(dǎo)性，從而促發(fā)心力衰竭和心律失常[3]。轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、腫瘤壞死因子α和白細(xì)胞介素1β參與的炎癥反應(yīng)在心肌纖維化和心臟重構(gòu)中發(fā)揮重要作用[4]。西羅莫司是哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白抑制劑，研究顯示其具有抗腫瘤作用和免疫抑制活性[5]。西羅莫司對神經(jīng)纖維瘤、結(jié)腸癌、宮頸癌等多種實(shí)體腫瘤都有抑制作用[6]。西羅莫司還可抑制堿性成纖維細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系的增殖[7]。但西羅莫司對大鼠心肌纖維化的作用尚不清楚。2018年8月～2019年10月,本研究對此作了觀察，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及儀器 8周雄性SD大鼠45只，體質(zhì)量250～300 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。西羅莫司購自Pfizer Ireland Pharmaceuticals；Masson染色試劑盒購自南京建成生物工程研究所。Ⅰ型膠原(ab34710)、Ⅲ型膠原(ab7778)、TGF-β1(ab92486)抗體、Smad7(ab216428)抗體均購自美國Abcam公司；磷酸化Smad2(p-Smad2，S465/S467，#18338)抗體購自美國CST公司。HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔二步法檢測試劑盒(兔增強(qiáng)聚合物法檢測系統(tǒng)，pv9001)、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；PVDF膜、ECL發(fā)光液均購自密理博(上海)貿(mào)易有限公司。

1.2 動(dòng)物分組及模型制備 將SD大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、西羅莫司組各15只。用1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉大鼠，對照組暴露冠狀動(dòng)脈左前降支用結(jié)扎線只穿過不結(jié)扎，然后逐層縫合傷口。模型組、西羅莫司組結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支制備心肌梗死模型，逐層縫合傷口。西羅莫司組術(shù)后給予西羅莫司2 mg/(kg·d)灌胃治療[8]，對照組、模型組給予等量生理鹽水灌胃。均連續(xù)給藥4周。

1.3 心臟功能檢測 給藥結(jié)束后，按前述方法將大鼠麻醉，用彩色多普勒超聲儀獲得心臟M-超聲心動(dòng)圖。記錄大鼠左室收縮末期直徑(LVESD)、左室舒張末期直徑(LVEDD)、左室短軸縮短率(LVFS),并計(jì)算各組大鼠左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。

1.4 取材 用斷頭法處死大鼠，剪開其胸腔取出心臟，用生理鹽水沖洗組織，取部分保存于液氮中用于提取總蛋白；剩余組織用4%多聚甲醛固定，行脫水石蠟包埋，制成4 μm厚的切片，用于后續(xù)染色。

1.5 大鼠心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)測算 采用Masson染色法。切片常規(guī)脫蠟至水，用配制好的Weigert鐵蘇木素染色5～10 min。用酸性乙醇分化，Massson返藍(lán)液返藍(lán)，麗春紅品紅染色5 min，磷鉬酸分化，苯胺藍(lán)染色1～2 min。乙醇梯度快速脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察膠原纖維呈藍(lán)色，心肌組織呈紅色，胞核呈黑藍(lán)色。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野并拍照，圖像用Image pro plus6.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)算膠原纖維染色面積占切片總面積的百分比，即CVF。

1.6 大鼠心肌組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)檢測 采用免疫組化法。心肌組織切片常規(guī)脫蠟至水，用檸檬酸鹽緩沖液(pH值6.0)進(jìn)行抗原修復(fù)(微波大火5 min，小火15 min)，3%過氧化氫清除內(nèi)源性過氧化物酶活性，3%的BSA室溫封閉30 min，把濕盒放在4 ℃孵育一抗Ⅰ型膠原(1∶100)、Ⅲ型膠原(1∶500)過夜。第2天按照兔二步法檢測試劑盒說明書孵育二抗，DAB顯色。蘇木素復(fù)染、乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡觀察并隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照。用Image J-plugins-IHC profiler對圖片進(jìn)行定量分析，計(jì)算蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞百分比。

1.7 大鼠心肌組織中TGF-β1及Smad2、7蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。將保存于液氮中的心肌組織研磨并用蛋白裂解液裂解，BCA法測總蛋白濃度，用上樣緩沖液100 ℃煮蛋白5 min使其變性。取50 μg總蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜封閉后，4 ℃孵育一抗TGF-β1(1∶500)、Smad7(1∶500)、p-Smad2(1∶1 000)過夜，第2天孵育HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶4 000)，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行ECL發(fā)光實(shí)驗(yàn)。用Image J進(jìn)行灰度值計(jì)算，用β-actin作內(nèi)參。目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。

2 結(jié)果

2.1 西羅莫司對心肌梗死大鼠心功能的影響 與對照組比較，模型組LVESD、LVEDD高(P均<0.05)，LVFS、LVEF低(P均<0.05)。與模型組比較，西羅莫司組LVESD、LVEDD低(P均<0.05)，LVFS、LVEF高(P均<0.05)。見表1。

表1 各組心功能指標(biāo)比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.2 西羅莫司對心肌梗死大鼠心肌膠原纖維含量的影響 對照組、模型組、西羅莫司組CVF分別為(4.6±1.03)%、(16.5±3.29)%、(9.3±2.45)%。與對照組比較，模型組CVF高(P<0.05)；與模型組比較，西羅莫司組CVF低(P<0.05)。

2.3 西羅莫司對心肌梗死大鼠心肌組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)的影響 對照組Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白陽性細(xì)胞百分比分別為(14.6±2.38)%、(11.6±2.20)%，模型組分別為(63.3±3.29)%、(55.0±1.37)%，西羅莫司組分別為(33.3±1.78)%、(28.0±1.59)%。與對照組比較，模型組Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原蛋白陽性細(xì)胞百分比高(P均<0.05)；與模型組比較，西羅莫司組Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原蛋白陽性細(xì)胞百分比低(P均<0.05)。

2.4 西羅莫司對心肌梗死大鼠心肌組織中TGF-β1/Smad通路的影響 與對照組比較，模型組TGF-β1、p-Smad2蛋白相對表達(dá)量高(P均<0.05)，Smad7蛋白相對表達(dá)量低(P<0.05)。與模型組比較，西羅莫司組TGF-β1、p-Smad2蛋白相對表達(dá)量低(P均<0.05)，Smad7蛋白相對表達(dá)量高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠心肌組織中TGF-β1、p-Smad2及Smad7蛋白相對表達(dá)量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討論

心臟受損傷后再生能力非常有限，失去的細(xì)胞會(huì)被纖維化瘢痕所取代[9]。隨之而來的是周圍心肌的重構(gòu)，最終導(dǎo)致心功能受損。重構(gòu)過程包括左心室壁增厚(肥厚)和變硬(纖維化)[10]。然而，心肌梗死后增加的機(jī)械應(yīng)力以及激素和旁分泌的細(xì)胞因子，也會(huì)導(dǎo)致梗死遠(yuǎn)端結(jié)締組織擴(kuò)張。梗死邊緣區(qū)和遠(yuǎn)端未損傷心肌的這種反應(yīng)性纖維化導(dǎo)致心室順應(yīng)性改變和心室硬度增加，從而危及心輸出量[11]。除了對心臟收縮力的影響外，纖維瘢痕和間質(zhì)纖維化也會(huì)干擾心臟正常的電功能，從而誘發(fā)心律失常[12]。因此，心肌纖維化已被確定為心力衰竭的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可使心力衰竭患者發(fā)生心臟性猝死，并獨(dú)立于射血分?jǐn)?shù)而增加總體病死率[13]。

心肌纖維化是指心肌間質(zhì)中膠原纖維過度堆積，各類膠原比例失調(diào)，膠原纖維排列紊亂。肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生大量的間質(zhì)膠原(最初是Ⅲ型膠原，后來在梗死愈合過程中產(chǎn)生Ⅰ型膠原)[14]。結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支能引起大鼠心肌梗死，4周后會(huì)形成明顯的心肌纖維化，此模型已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于心肌纖維化機(jī)制的研究。本研究應(yīng)用此方法成功誘導(dǎo)了大鼠心肌纖維化模型，心肌梗死術(shù)后4周大鼠心臟LVESD、LVEDD都明顯升高，LVEF顯著降低；心肌間質(zhì)膠原明顯增加，Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原含量均增加。以上符合心肌纖維化的病理特征。

西羅莫司是一種有效抑制抗原誘導(dǎo)的T細(xì)胞、B細(xì)胞增殖和抗體產(chǎn)生的抑制劑，可用作器官移植中的免疫抑制劑[15]。西羅莫司與細(xì)胞內(nèi)蛋白形成免疫抑制復(fù)合物，阻斷了細(xì)胞周期特異性激酶(TOR)的激活。TOR失活后的下游反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞周期在G1期和S期交界處受阻[16]。有研究認(rèn)為，西羅莫司的抗真菌、抗增殖和免疫抑制作用的分子機(jī)制是相同的[17]。西羅莫司可減輕單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠腎間質(zhì)纖維化[8]。本研究在心肌梗死術(shù)后每天給予大鼠西羅莫司灌胃治療，第28天測心功能發(fā)現(xiàn)，西羅莫司組大鼠心功能較模型組明顯改善，CVF明顯降低，Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原含量均下降?？梢?，西羅莫司可以減輕心肌梗死導(dǎo)致的心肌纖維化。

TGF-β1屬于TGF-β超家族，是調(diào)節(jié)基質(zhì)沉積的關(guān)鍵因子，在細(xì)胞分化、免疫抑制、增殖、炎癥、組織重構(gòu)和傷口愈合中發(fā)揮重要作用[18]。研究表明，TGF-β1通路可以刺激血管內(nèi)膜增生和纖維化[19]。TGF-β1通路是由TGF-β1結(jié)合Ⅱ型TGF-β受體，導(dǎo)致TβR-I絲氨酸磷酸化和激活。激活的TβR-I反過來促進(jìn)Smad2、Smad3絲氨酸位點(diǎn)的磷酸化，使其與Smad4結(jié)合介導(dǎo)TGF-β信號(hào)從胞質(zhì)轉(zhuǎn)到胞核，從而轉(zhuǎn)錄纖維化相關(guān)基因[20，21]。MADH/Smad7是TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的拮抗劑，已有研究證明，MADH/Smad7可抑制TGF-β1激活，從而阻止Smad2通路[22]。本研究中，心肌梗死組織中TGF-β1和p-Smad2蛋白表達(dá)升高。提示在心肌梗死模型中TGF-β1/Smad通路被激活，從而引起心肌纖維化。西羅莫司組TGF-β1、p-Smad2蛋白表達(dá)降低，Smad7蛋白表達(dá)升高，提示西羅莫司可能通過抑制TGF-β1/Smad通路激活減少心肌膠原沉積，從而抑制心肌纖維化。

綜上所述，西羅莫司治療能改善心肌梗死大鼠心功能，減少膠原沉積，抑制心肌纖維化。其機(jī)制可能與抑制TGF-β1/Smad通路激活有關(guān)。