“徐香”獼猴桃離體快繁研究

趙文娟，吳杰新，張漢堯

（西南林業(yè)大學(xué)西南地區(qū)生物多樣性保育國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650224）

徐香獼猴桃是獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia）多年生落葉藤本植物[1]。果實(shí)內(nèi)不僅含有獼猴桃堿、蛋白水解酶、單寧、果膠和糖類等有機(jī)物質(zhì)，還含有人體所需的17 種氨基酸和豐富的維生素C、檸檬酸、果糖、葡萄酸、蘋果酸和鈣、鋅、硒、鍺、鉀等微量元素，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，市場(chǎng)前景良好。中國(guó)的獼猴桃產(chǎn)業(yè)不斷擴(kuò)大，市場(chǎng)應(yīng)用前景廣闊；廣大顧客對(duì)獼猴桃苗的需求量也越來越大[2]。傳統(tǒng)的獼猴桃繁殖方式主要采用種子播種，或采用實(shí)生苗作為砧木嫁接，育種周期長(zhǎng)且產(chǎn)量較低；通過播種育苗，種子出苗率較低，還會(huì)引起后代性狀變異；通過嫁接繁殖又會(huì)有砧木和接穗不親和障礙、病毒復(fù)合感染的問題；而植物組織培養(yǎng)則利用細(xì)胞具有全能性的特點(diǎn)，通過離體器官的組織培養(yǎng)，降低了育苗成本；整個(gè)過程具有培養(yǎng)條件可控、生長(zhǎng)周期短、繁殖力高、管理方便等優(yōu)點(diǎn)；建立徐香獼猴桃的無菌體系，既能使其優(yōu)良性狀得以保存，又能大量培育出組培苗[3]。在生產(chǎn)生活中，可以用組培苗進(jìn)行抗性篩選研究，得到能夠抵御不良環(huán)境的徐香苗，提高育種效率，從而更好地應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。本次實(shí)驗(yàn)對(duì)離體的徐香獼猴桃葉片進(jìn)行培養(yǎng)，保存徐香獼猴桃的優(yōu)良性狀；因此，以植物組織培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)的離體快速繁殖技術(shù)將成為獼猴桃重要的良種繁育途徑[4～5]。

1 材料與方法

1.1 供試材料

實(shí)驗(yàn)所需的外植體材料為西南林業(yè)大學(xué)溫室大棚栽培的徐香獼猴桃嫩葉，或是通過室內(nèi)水培的復(fù)幼嫩葉；實(shí)驗(yàn)及組織培養(yǎng)在西南林業(yè)大學(xué)西南地區(qū)生物多樣性保育國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，組培室培養(yǎng)條件如下：光照采用日光燈光源，光照強(qiáng)度2000 Lux；溫度 24 ℃；濕度 60%。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MS 培養(yǎng)基的配制

空白培養(yǎng)基采用MS 培養(yǎng)基配方配制，培養(yǎng)基中加入 MS 粉 4.4 g/L，蔗糖 30 g/L，瓊脂 4.5 g/L，用電磁爐煮沸水直至瓊脂融化，將pH 值調(diào)至5.8。在壓強(qiáng)98 kPa、溫度121 ℃的條件下，滅菌21 min。

1.2.2 無菌體系的建立

選擇無病蟲害的根萌條、健康且生長(zhǎng)旺盛的徐香獼猴桃嫩葉作為外植體。外植體消毒時(shí)，試驗(yàn)采用L9（23）正交實(shí)驗(yàn)篩選最佳消毒配方，其中因素1 為75%酒精的浸泡時(shí)間，3 個(gè)水平依次為 10 s、15 s、20 s；因素2 為0.1%升汞的浸泡時(shí)間，3 個(gè)水平分別是1 min、2 min、3 min；每個(gè)處理重復(fù) 3 次，每個(gè)重復(fù) 10 瓶。觀察不同處理的生長(zhǎng)情況，15 d 后統(tǒng)計(jì)污染葉片數(shù)（片）和褐化葉片數(shù)（片）。

1.2.3 愈傷組織誘導(dǎo)

實(shí)驗(yàn)使用細(xì)胞分裂素TDZ 和生長(zhǎng)素IBA 在無菌體系建立的基礎(chǔ)上，采用L9（23）正交實(shí)驗(yàn)篩選最佳誘導(dǎo)愈傷配比。因素1 為TDZ 的濃度，3 個(gè)水平分別是1 mg/L、1.5 mg/L、2 mg/L；因素 2 為 IBA 的濃度，3 個(gè)水平分別是 0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L；每個(gè)處理重復(fù)3 次，每個(gè)重復(fù)10 瓶。30 d 后統(tǒng)計(jì)形成愈傷組織的情況。

1.2.4 不定芽分化誘導(dǎo)

選擇6-BA 和NAA 作為本實(shí)驗(yàn)不定芽誘導(dǎo)的細(xì)胞分裂素，將生長(zhǎng)良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接到不定芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)瓶中，采用L9（23）正交實(shí)驗(yàn)篩選最佳不定芽誘導(dǎo)配方。其中因素1 為6-BA 的濃度，3 個(gè)水平分別為1 mg/L、1.5 mg/L、2 mg/L；因素 2 為 NAA 的濃度，3 個(gè)水平分別為 0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L，且每個(gè)處理重復(fù)3 次，每個(gè)重復(fù)10 瓶。30 d 后統(tǒng)計(jì)不定芽的分化結(jié)果，統(tǒng)計(jì)不定芽分化的愈傷數(shù)量（株），平均出芽數(shù)（株），平均苗高（cm）。

1.2.5 生根誘導(dǎo)

生根誘導(dǎo)時(shí)使用1/2 MS 培養(yǎng)基，同樣采用L9（23）正交實(shí)驗(yàn)篩選最佳生根配方。其中因素1 為IBA 的濃度，3 個(gè)水平分別為 0.5 mg/L、0.75 mg/L、1 mg/L；因素2 為 AC 的濃度，3 個(gè)水平分別為 0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L，且每個(gè)處理重復(fù)3 次，每個(gè)重復(fù)10 瓶。第7 d 起開始觀察接入組培苗的生根情況，于第30 d 統(tǒng)計(jì)生根的株數(shù)、根長(zhǎng)（cm）、計(jì)算生根率（%）。

1.2.6 煉苗與移栽

將長(zhǎng)勢(shì)旺盛，生根正常的組培苗移至自然光下生長(zhǎng)，10 d 后開始慢慢松動(dòng)瓶蓋，15 d 后將組培瓶的瓶蓋打開并用紗布掩住，20 d 后取出組培苗用流水將附著于根上的培養(yǎng)基沖洗干凈，并用多菌靈溶液進(jìn)行消毒泡洗5 min，之后在陰涼環(huán)境下晾干表面水分，栽種到經(jīng)多菌靈殺毒處理過的不同配比的土壤基質(zhì)中。實(shí)驗(yàn)選用的基質(zhì)為腐殖土、生土、草炭土、珍珠巖，4 種基質(zhì)比處理 1 為 1∶1 ∶1 ∶1、處理 2 為 2 ∶1 ∶1 ∶1、處理 3 為 3 ∶1 ∶1∶1、處理 4 為 4 ∶1 ∶1 ∶1。每個(gè)配方移栽 10 株生根苗，3 次重復(fù)。放置于陰涼處，用塑料薄膜或蓋子將其蓋住，保持溫度在（26±3）℃，噴施水霧濕度控制在80%以上。20 d 后統(tǒng)計(jì)苗的長(zhǎng)勢(shì)情況，如是否健壯，有無萎蔫等。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方法對(duì)徐香獼猴桃外植體的影響

表1 顯示，外植體消毒的平均污染率在2.8%～88.9%，其中平均污染率最低的是處理8；平均成活率在7.8%～96.1%。平均成活率最高的是處理8，最低的是處理3。這說明0.1%升汞和75%酒精對(duì)外植體均有消毒效果，且消毒效果隨酒精消毒時(shí)間的增加而增加，隨0.1%升汞消毒時(shí)間的增加而呈現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì)；因此當(dāng)75%酒精處理時(shí)間不足，0.1%升汞處理時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)（處理2）平均污染率高達(dá)88.9%；而適當(dāng)?shù)脑黾?5%酒精消毒時(shí)長(zhǎng)，外植體的平均污染率又有逐步降低的趨勢(shì)，處理8 污染率降低至2.8%，同時(shí)外植體的成活率隨升汞消毒滅菌時(shí)間的增加呈現(xiàn)出逐步減小的趨勢(shì)，這與升汞消毒滅菌時(shí)對(duì)外植體細(xì)胞產(chǎn)生的毒害作用有關(guān)。不難看出，處理8 的消毒效果最好。

表1 徐香獼猴桃外植體各處理消毒效果

表2 外植體各處理消毒方差分析

如表2 所示，外植體消毒9 個(gè)處理間的污染率（P=0＜0.01）差異極顯著；褐化率（P=0＜0.01）呈現(xiàn)極顯著差異，成活率（P=0＜0.01）也有極顯著差異。

2.2 不同生長(zhǎng)激素對(duì)徐香獼猴桃愈傷組織形成的影響

如表3 所示，30 d 后觀察9 個(gè)處理的愈傷形成情況，平均死亡率在0%～74.5%，平均存活率在22.5%～92.5%，愈傷組織的形成率在29.2%～100%。其中平均存活率最高是處理6，高達(dá)92.5%；其愈傷形成率也最高，為100%，說明處理6 易誘導(dǎo)形成愈傷組織。

如表4 所示，愈傷組織誘導(dǎo)9 個(gè)處理間的褐化率（P=0＜0.01）呈現(xiàn)極顯著差異，成活率（P=0＜0.01）也有極顯著差異。

表3 不同生長(zhǎng)激素對(duì)徐香獼猴桃愈傷組織形成的影響

表4 愈傷組織誘導(dǎo)各處理的方差分析

2.3 不定芽誘導(dǎo)激素對(duì)徐香獼猴桃不定芽增殖的影響

如表5 所示，不定芽誘導(dǎo)平均株高9 個(gè)處理為0.5～1.77 cm，平均芽數(shù)0.86～9.62 個(gè)/株。其中處理9的平均株高最高，為1.77 cm，且其平均芽數(shù)也多，為9.62 個(gè)/株。

如表6 所示，不定芽誘導(dǎo)激素9 個(gè)處理間的平均芽高（P=0＜0.01）有極顯著差異；平均芽數(shù)（P=0.001＜0.01）呈現(xiàn)極顯著差異。

表5 不定芽誘導(dǎo)激素各處理效果

表6 不定芽誘導(dǎo)激素各處理方差分析

2.4 不同生根處理對(duì)徐香獼猴桃生根的影響

表7 表明，9 個(gè)生根處理的生根率在 46.7%～98.3%，平均根長(zhǎng)在4.9～9.4 cm。其中，處理9 誘導(dǎo)生根效果最好，平均生根率可達(dá)98.3%，且誘導(dǎo)生長(zhǎng)的根長(zhǎng)最長(zhǎng)，已達(dá)9.4 cm。

表7 不同生根處理對(duì)徐香獼猴桃生根的影響

如表8 所示，9 個(gè)處理間的生根率（P=0＜0.01）有極顯著差異；生根數(shù)（P=0＜0.01）呈現(xiàn)極顯著差異，根長(zhǎng)（P=0＜0.01）也有極顯著差異。

表8 不同生根處理方差分析

2.5 不同基質(zhì)配比對(duì)徐香獼猴桃煉苗成活率的影響

如表9 所示，4 個(gè)處理生長(zhǎng)成活率較高的是處理4，即腐殖土 ∶生土 ∶草炭土 ∶珍珠巖為 4 ∶1 ∶1 ∶1 時(shí)，苗木生長(zhǎng)情況較其他處理更綠，苗木生長(zhǎng)也比較健壯。

表9 不同基質(zhì)配比對(duì)徐香獼猴桃煉苗成活率的影響

3 討論

通過實(shí)驗(yàn)，得出最佳的外植體滅菌方法為流水沖洗30 min+75%酒精消毒20 s+0.1%升汞消毒2 min。75%的酒精滅菌消毒時(shí)間在外植體消毒殺菌過程中有著主要作用。當(dāng)75%酒精處理20 s 時(shí)，可得到最佳的消毒滅菌效果，時(shí)間過短會(huì)增加外植體污染率；0.1%升汞消毒2 min 又優(yōu)于消毒1 min 和3 min，這和葛新玲得出的最佳外植體消毒時(shí)間不同，葛新玲通過建立獼猴桃再生體系，得出最佳的酒精處理時(shí)間為10～15 s，然后用升汞處理8 min[6]，這可能由于外界環(huán)境和外植體本身差異導(dǎo)致；0.1%升汞對(duì)外植體的消毒效果隨消毒時(shí)間的增加出現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，這和馬歡[7]外植體消毒滅菌方法得出的結(jié)論相一致。

周紅菊[8]用歐亞旋覆花為材料，探究了TDZ 在用葉片、根部誘導(dǎo)形成愈傷組織時(shí)得出，當(dāng)培養(yǎng)基中加入TDZ 0.05 mg/L 時(shí)，歐亞旋覆花的根部長(zhǎng)出的愈傷組織較好，且分化較快，愈傷組織分化率達(dá)到100%，分化出來的愈傷組織也有光澤。而潘偉明[9]采用環(huán)割進(jìn)行壓條時(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IBA 溶液對(duì)獼猴桃愈傷組織的形成有促進(jìn)作用，且濃度越高效果越好。

本次實(shí)驗(yàn)表明，愈傷組織誘導(dǎo)效果最好的是當(dāng)激素濃度TDZ 1.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L 時(shí)，污染率最低，成活率達(dá)到92.5%，愈傷形成率可達(dá)100%。其中，IBA 的濃度作用效果與潘偉明得出的結(jié)論相符；最適宜誘導(dǎo)愈傷組織生長(zhǎng)的TDZ 濃度與周紅菊得出的結(jié)論不符，可能是由于實(shí)驗(yàn)材料、環(huán)境及其操作人員的不同造成。實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)激素濃度為IBA 1 mg/L+AC 0.3 g/L 時(shí)，不定芽生根率較高，平均生根率可達(dá)98.3%，且誘導(dǎo)生根后根生長(zhǎng)較好。王大平[10]對(duì)獼猴桃組織培養(yǎng)苗生根條件進(jìn)行研究得出，最佳生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 1.0 mg/L+0.3%活性炭，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。