血清RASSF1A基因甲基化對(duì)原發(fā)性肝癌診斷價(jià)值的Meta分析

黃宇操，張雨薇，楊文龍

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院感染科，南昌 330006)

肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是目前臨床上最常見的癌癥之一，和大多數(shù)惡性腫瘤一樣，缺乏典型的早期表現(xiàn)，傳統(tǒng)組織活檢有著諸如穿刺風(fēng)險(xiǎn)、受解剖位置限制、體驗(yàn)痛苦、操作繁瑣、價(jià)格昂貴等限制性，并且常見的血清腫瘤標(biāo)志物，如脫-Υ-羧基凝血酶、甲胎蛋白異質(zhì)體3、鱗狀細(xì)胞癌抗原、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等對(duì)早期HCC診斷效能不佳[1]，致使很多患者錯(cuò)過了最佳治療階段。

LEON等[2]發(fā)現(xiàn)腫瘤患者比正常健康人血液中有更多的循環(huán)DNA，就此液體活檢進(jìn)入人們的視野。液體活檢是指對(duì)血液或其他體液進(jìn)行的低侵入性或非侵入性檢測(cè)，選擇檢測(cè)有關(guān)腫瘤患者的遺傳信息，為臨床應(yīng)用提供新的手段和方法。然而肝癌的發(fā)病機(jī)制涉及的基因繁多，在2000年，Ras相關(guān)區(qū)域家族1(Ras association domain family 1，RASSF1)基因作為DNA修復(fù)蛋白XPA的雙雜交結(jié)合伴侶被偶然發(fā)現(xiàn)[3]，RASSF1基因由于2個(gè)啟動(dòng)子的不同使用及不同的剪接方式產(chǎn)生7種不同的亞基(RASSF1A—G)[4],但在各種腫瘤中僅有RASSF1A啟動(dòng)子CpG島的甲基化被檢出[5]。有研究[6]報(bào)道在肝細(xì)胞性肝癌患者組織中RASSF1A甲基化檢出率達(dá)85%(72/82)。隨著研究的進(jìn)展，在血清、血漿和尿液樣本中也觀察到RASSF1A的廣泛甲基化，這表明RASSF1A作為HCC生物標(biāo)志物具有很強(qiáng)的候選資格[7]。然而眾多研究中肝癌患者血清的甲基化RASSF1A檢測(cè)率差距較大，在CHAN等[8]的研究中檢出率高達(dá)93.7%(59/63)，而在WU等[9]研究中檢出率卻只有19.2%(7/26)?；诖?，本研究納入關(guān)于RASSF1A甲基化診斷HCC的研究進(jìn)行Meta分析，探討其準(zhǔn)確性。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)檢索策略

檢索2000年1月至2019年10月PubMed、EMBASE、Cochrane、萬方和中國(guó)知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)收入的相關(guān)研究文獻(xiàn)。檢索關(guān)鍵詞為：“hepatocellular carcinoma”“Ras association domain family 1A”“HCC”“RASSF1A”“sensitivity”“specificity”“肝細(xì)胞性肝癌”“DNA甲基化”。通過閱讀文獻(xiàn)全文和追蹤參考文獻(xiàn)減少遺漏。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：1)關(guān)于外周血中RASSFlA甲基化對(duì)HCC進(jìn)行診斷的研究；2)能提取出用于計(jì)算診斷試驗(yàn)有關(guān)指標(biāo)的數(shù)據(jù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)數(shù)據(jù)無法利用的文獻(xiàn)；2)重復(fù)發(fā)表的文獻(xiàn) 。

1.3 數(shù)據(jù)提取

每篇文獻(xiàn)由2名研究人員獨(dú)立閱讀標(biāo)題、摘要以及全文并提取數(shù)據(jù)，分歧均通過第3人裁定。提取數(shù)據(jù)包括：第一作者、發(fā)表年限、實(shí)驗(yàn)地區(qū)或國(guó)家、試驗(yàn)組及對(duì)照組例數(shù)、試驗(yàn)組及對(duì)照組疾病分類、完整的四格表數(shù)據(jù)。

1.4 質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

由2名研究人員對(duì)納入文獻(xiàn)逐篇根據(jù)診斷準(zhǔn)確性研究的質(zhì)量評(píng)價(jià)工具Quality Assessment of Diagnostic Accuracy Studies(QUADAS)中的14個(gè)條目進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本次研究采用STATA 12.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。通過SROC曲線及Spearman相關(guān)性分析來確定有無閾值效應(yīng)的存在；異質(zhì)性通過I2值進(jìn)行評(píng)價(jià)，當(dāng)I2≥50%時(shí)，表明各研究間異質(zhì)性明顯，采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行擬合。反之，則采用固定效應(yīng)模型。合并的統(tǒng)計(jì)量采用敏感性(sensitivity,SEN)、特異性(specificity,SPE)、陽(yáng)性似然比(PLR)、陰性似然比(NLR)、診斷比值比(DOR)及其95%置信區(qū)間(CI)表示，并繪制SROC曲線，計(jì)算曲線下面積(area under cunre， AUCSROC)。通過Meta回歸分析用于探索異質(zhì)性來源。制作漏斗圖評(píng)價(jià)納入文獻(xiàn)是否存在發(fā)表偏倚，當(dāng)P<0.05時(shí)，說明納入的文獻(xiàn)存在發(fā)表偏倚，反之，則不存在發(fā)表偏倚。P<0.05為合并指標(biāo)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 納入文獻(xiàn)情況

根據(jù)檢索策略和納入排除標(biāo)準(zhǔn)，最終納入研究文獻(xiàn)11篇，1篇為前瞻性研究， 10篇為回顧性研究。共收集病例試驗(yàn)組819例(原發(fā)性肝癌)，對(duì)照組827例(包括慢性肝炎、肝硬化、良性肝臟疾病等)。8項(xiàng)研究采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP) 檢測(cè)RASSF1A甲基化;3項(xiàng)研究采用甲基化敏感的內(nèi)切酶-定量聚合酶鏈反應(yīng)(MSRE-P)。文獻(xiàn)篩選流程見圖1，納入文獻(xiàn)基本特征見表1。

2.2 Mate分析

2.2.1 閾值分析

SROC曲線不呈“肩臂”狀態(tài)，見圖2，Spearman相關(guān)系數(shù)r=0.155，P=0.650，提示不存在閾值效應(yīng)。

表1 納入文獻(xiàn)基本特征表

2.2.2 診斷指標(biāo)的合并

異質(zhì)性分析I2=96.21%，提示納入的研究間存在異質(zhì)性(P<0.01)，對(duì)納入文獻(xiàn)進(jìn)行逐篇排除后，仍存在異質(zhì)性，采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行指標(biāo)合并，結(jié)果見表2，血清RASSF1A基因甲基化檢測(cè)診斷HCC合并SEN及SPE森林圖見圖3—4。

2.2.3 Meta回歸分析

從研究類型(prodesign)、人群特點(diǎn)(subject)、檢測(cè)方法(method)3個(gè)角度進(jìn)行亞組分析，結(jié)果顯示，合并SEN的結(jié)果中檢測(cè)方法(P<0.01)、研究類型(P<0.01),這2個(gè)因素是異質(zhì)性的主要來源，而在合并SPE的結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)能解釋其異質(zhì)性的因素。見圖5。

2.2.4 發(fā)表偏倚檢測(cè)

發(fā)表偏倚采用Deeks試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)(圖6)，未發(fā)現(xiàn)明顯的發(fā)表偏倚(P=0.57)。

表2 納入文獻(xiàn)的各項(xiàng)指標(biāo)的合并結(jié)果

注：method中Yes表示采用MSP方法，No表示采用MSRE-P方法；prodesign中Yes為前瞻性研究，No為回顧性研究；subject，Yes為闡明研究對(duì)象人群特點(diǎn)，No為未闡明。

圖5 敏感性(左)與特異性(右)Meta回歸分析

3 討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清RASSF1A甲基化檢測(cè)診斷肝細(xì)胞性肝癌合并SEN=0.56(95%CI：0.36～0.74)，SPE=0.81(95%CI：0.64～0.92)，說明單獨(dú)的血清中RASSF1A甲基化檢測(cè)在診斷HCC漏診率及誤診率偏高，本次納入的研究中對(duì)照組均為患有肝臟疾病個(gè)體，未設(shè)立正常人群作為對(duì)照，可能降低該檢測(cè)在整體人群中對(duì)HCC診斷的敏感性及特異性；陽(yáng)性似然比(PLR)=3.0(95%CI：1.5～5.9)，陰性似然比(NLR)=0.55(95%CI：0.36～0.83)，說明血清中RASSF1A甲基化檢測(cè)在確定診斷以及排除診斷HCC中具有一定的價(jià)值；診斷比值比(DOR)=5(95%CI：2～14);SROC曲線下面積(AUCSROC)=0.75(95%CI：0.71～0.79)，說明血清中RASSF1A甲基化檢測(cè)鑒別HCC患者和非患者能力尚可。

本研究進(jìn)一步通過Meta回歸分析確定異質(zhì)性的來源，結(jié)果發(fā)現(xiàn)是否為前瞻性研究及檢測(cè)方法是合并SEN異質(zhì)性的來源。提示未來需要更多的前瞻性研究幫助明確RASSF1A甲基化檢測(cè)對(duì)HCC的診斷價(jià)值，另外，雖然有研究表明焦磷酸測(cè)序已成為臨床診斷中定量檢測(cè)DNA甲基化最合適的技術(shù)之一[19]，但是對(duì)甲基化基因的捕捉、提純等方面仍未統(tǒng)一，故在甲基化檢測(cè)方法可能需要進(jìn)一步的規(guī)范，如探針及引物的選擇、擴(kuò)增方法、離心方法等。本次研究的亞組分析中發(fā)現(xiàn)采用MSRE-P方法的合并SEN(0.84)高于采用MSP方法的合并SEN(0.42),反之，在合并SPE中后者(0.87)高于前者(0.60)。說明兩種檢測(cè)方法均存在一定的局限性。

目前諸多研究中提到多基因或者多種標(biāo)志物蛋白聯(lián)合構(gòu)建診斷模板能提高診斷的準(zhǔn)確性，例如在LU等[20]的研究中發(fā)現(xiàn)將3個(gè)異常甲基化基因和1個(gè)miRNA組合以建立甲基化HBV相關(guān)HCC預(yù)測(cè)模型，獲得了高靈敏度和特異性(>80%)，然而在WU等[9]的研究指出，DNA甲基化的結(jié)合可能會(huì)增加評(píng)估的風(fēng)險(xiǎn)影響準(zhǔn)確性，在董曉剛等[16]的研究中2個(gè)不同的信號(hào)傳導(dǎo)通路的基因(P16、RASSF1A)甲基化聯(lián)合檢測(cè)卻可能提高 HCC 檢出率，因此若聯(lián)合不同信號(hào)通路的異常基因可能對(duì)構(gòu)建診斷模板意義更大。此外，DONG等[21]在其一項(xiàng)病例對(duì)照研究中指出，血清RASSF1A甲基化和AFP水平的組合可能是一種有前途的非侵入性生物標(biāo)志物。

本次Meta分析也存在一定的局限性。在納入的部分文獻(xiàn)中，HCC患者數(shù)量相對(duì)對(duì)照組較少，而且納入的HCC患者的病因未得到詳盡的闡述，無法完成不同病因(乙肝、丙肝、脂肪肝等)引起的HCC診斷的亞組分析；同時(shí)納入研究的異質(zhì)性也可能影響Meta分析的結(jié)果。