不同濃度人源性抗菌肽LL-37/PLGA/β-TCP復(fù)合支架對兔骨髓間充質(zhì)干細胞增殖、分化的影響

羅萬榮 易偉宏 胡廣詢

【摘要】 目的：研究不同濃度人源性抗菌肽LL-37/聚乳酸聚乙醇酸共聚物（PLGA）/β-磷酸三鈣（β-TCP）復(fù)合支架對于兔骨髓間充質(zhì)干細胞（rBMSCs）增殖、分化的影響。方法：制備LL-37/PLGA/β-TCP復(fù)合支架材料，按LL-37濃度分為0、1、5、10 μmol/L組，另設(shè)置空白rBMSCs培養(yǎng)基為N組，每組三個培養(yǎng)皿，細胞密度為5×105個/皿。掃描電鏡下觀察不同濃度LL-37/PLGA/β-TCP復(fù)合支架形態(tài)。采用CCK-8檢查方法檢測各組干預(yù)rBMSCs 0、24、48、72、96、120 h后rBMSCs細胞增殖活力。干預(yù)rBMSCs 24 h后，采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）檢測各組成骨相關(guān)基因堿性磷酸酶（ALP）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-1（BMP-1）及骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（BMP-7）的mRNA相對表達量。干預(yù)rBMSCs 24 h后，采用ELISA檢測各組ALP、BMP-1及BMP-7的蛋白水平。每個實驗獨立重復(fù)三次。結(jié)果：LL-37/PLGA/β-TCP復(fù)合支架材料隨著LL-37濃度增加而呈現(xiàn)多孔、細胞吸附增多的趨勢，促進細胞貼附生長。干預(yù)24 h后，10 μmol/L組細胞增殖能力明顯高于N組（P<0.05）;隨著干預(yù)時間延長，1、5、10 μmol/L組均對rBMSCs有促進增殖作用，且呈濃度依賴作用。1、5、10 μmol/L組ALP、BMP-1及BMP-7的mRNA相對表達量與蛋白表達水平均高于N組（P<0.05）;1、5、10 μmol/L組ALP、BMP-1及BMP-7的mRNA相對表達量與蛋白表達水平均呈高表達，且呈濃度依賴。結(jié)論：LL-37/PLGA/β-TCP復(fù)合支架可以顯著促進rBMSCs增殖與分化，是一種潛在的骨組織工程支架。

【關(guān)鍵詞】 人源性抗菌肽 PLGA/β-TCP復(fù)合支架 兔骨髓間充質(zhì)干細胞 堿性磷酸酶 骨形態(tài)發(fā)生蛋白

[Abstract] Objective： To investigate the effects of concentrations of human antimicrobial peptide LL-37/polylactic acid-polyglycolic acid copolymer （PLGA）/β-tricalcium phosphate （β-TCP） composite scaffolds on proliferation and differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells （rBMSCs）. Method： LL-37/PLGA/β-TCP composite scaffolds were prepared. The scaffolds were divided into 0， 1， 5， 10 μmol/L group according to the concentration of LL-37. In addition， the blank rBMSCs medium was set as group N， three plates in each group and cell density of 5×105/plates. The morphology of LL-37/PLGA/β-TCP composite scaffolds with different concentrations were observed under scanning electron microscope. The proliferation activity of rBMSCs was detected by CCK-8 after 0， 24， 48， 72， 96 and 120 h of rBMSCs intervention. After 24 h of rBMSCs intervention， the relative mRNA expression of osteogenesis-related genes alkaline phosphatase （ALP）， bone morphogenetic protein-1 （BMP-1） and bone morphogenetic protein-7 （BMP-7） were detected by fluorescence quantitative polymerase chain reaction （qPCR）. After 24 h of rBMSCs intervention， the protein levels of ALP， BMP-1 and BMP-7 were detected by ELISA. Each experiment was repeated three times independently. Result： With the increase of LL-37 concentration， LL-37/PLGA/β-TCP composite scaffolds showed a trend of porous and cell adsorption， which promoted cell adhesion and growth. After 24 h of intervention， the proliferation ability of 10 μmol/L group was significantly higher than that of N group （P<0.05）. With the extension of intervention time， the 1， 5 and 10 moL/L group all had the effect of promoting rBMSCs proliferation， and the effect was concentration dependent. The relative mRNA expression and protein expression level of ALP， BMP-1 and BMP-7 in 5， 10 μmol/L group were higher than those in N group （P<0.05）. The relative mRNA expression and protein expression level of ALP， BMP-1 and BMP-7 in 1， 5， 10 μmol/L group were all highly expressed and concentration dependent. Conclusion： The LL-37/PLGA/β-TCP composite scaffold can significantly promote rBMSCs proliferation and differentiation. It is a potential bone tissue engineering scaffold.

慢性骨髓炎、開放性骨折重度污染等一直是骨科的常見病、疑難病，尤其清創(chuàng)后常出現(xiàn)的大塊骨缺損和創(chuàng)面感染，更是棘手的兩大難題[1-2]。一般認為骨質(zhì)缺損長度超過2 cm或骨周徑缺損超過50%即為大段骨缺損[3]。目前對于大段骨缺損的治療方式主要有牽引成骨、自體或異體植骨和組織工程技術(shù)等[1，4-5]。牽引成骨治療周期長，手術(shù)復(fù)雜，有學(xué)習(xí)曲線長、并發(fā)癥多等缺點[4-5]。自體骨移植被認為是治療骨缺損的金方法，然而此方法額外增加患者創(chuàng)傷，且骨來源不足，容易受到限制[6]。異體骨移植移植費用昂貴，存在術(shù)后感染、恢復(fù)緩慢等缺點[7]。隨著近年來骨組織工程技術(shù)的發(fā)展，因其具有創(chuàng)傷小、來源不受限制等優(yōu)點，逐漸受到大家重視[1，8]。聚乳酸聚乙醇酸共聚物（PLGA）和β-磷酸三鈣（β-TCP）是一種被食品和藥物管理局批準能用于人體內(nèi)的醫(yī)用材料。因其具有良好的生物安全性、生物相容性以及低毒性，不易表現(xiàn)出抗原性或免疫原性，已被廣泛使用[6，9]。LL-37是一種人源性抗菌肽（AMPs），廣泛存在于骨髓、睪丸、中性粒細胞、單核細胞以及多處鱗狀上皮細胞中，具有抗菌活性的堿性多肽物質(zhì)，因其優(yōu)越的廣譜抗菌活性及免疫調(diào)節(jié)作用而逐漸受到臨床學(xué)者關(guān)注[10]。本研究選用PLGA/β-TCP為支架，復(fù)合不同濃度的LL-37，觀察不同濃度的LL-37/PLGA/β-TCP復(fù)合支架對兔骨髓間充質(zhì)干細胞（rabbit bone marrow mesenchymal stem cells，rBMSCs）增殖和分化的影響，為LL-37/PLGA/β-TCP復(fù)合支架作為新的骨組織工程技術(shù)材料治療骨缺損提供實驗學(xué)依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 rBMSCs購買于中國廣州賽業(yè)生物科技有限公司，PLGA/β-TCP購置于購自上海麥克林生化科技有限公司;LL-37、PBS、DMEM高糖培養(yǎng)基購買于美國sigma公司、胎牛血清（FBS）及0.25%胰蛋白酶買自于中國索萊寶科技有限公司;RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Mix買自中國南京諾唯贊生物科技有限公司;CCK-8試劑盒買自日本Dojindo有限公司;堿性磷酸酶（ALP）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-1（BMP-1）及骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（BMP-7）ELISA試劑盒買自美國Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 rBMSCs的培養(yǎng)、傳代與LL-37/PLGA/β-TCP復(fù)合支架的制備 rBMSCs的培養(yǎng)、傳代：將rBMSCs放入恒溫培養(yǎng)箱孵育過夜后進行換液，每2天換液1次，待其鋪滿瓶底80%～90%體積時使用0.25%胰酶消化，并以1︰3比例傳代。LL-37/PLGA/β-TCP復(fù)合支架的制備與分組：向PLGA/β-TCP支架材料中加入LL-37，配成終濃度為1 mmol/L的母液。隨后向rBMSCs培養(yǎng)基中加入不同體積的LL-37/PLGA/β-TCP復(fù)合支架母液，使最終濃度為1、5、10 μmol/L，即為1、5、10 μmol/L組。另設(shè)僅加入PLGA/β-TCP復(fù)合支架材料，LL-37濃度為0 μmol/L為0 μmol/L組與空白rBMSCs培養(yǎng)基為N組，每組細胞密度為5×105個/皿，各3個培養(yǎng)皿。所有實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.2 掃描電鏡下觀察不同濃度LL-37/PLGA/β-TCP復(fù)合支架形態(tài) rBMSCs 孵育24 h后置于電鏡下觀察0、1、5、10 μmol/L復(fù)合支架形態(tài)。

1.2.3 CCK-8檢測各組rBMSCs增殖的情況 將rBMSCs以1×105個/mL的密度接種于96孔板，每孔100 μL，放入培養(yǎng)箱中過夜，待細胞貼壁后同上述分組方法處理，再次將其放入恒溫培養(yǎng)箱中，孵育0、24、48、72、96、120 h后吸棄上清。PBS清洗后加入含10 μL CCK-8溶液的培養(yǎng)基，放入恒溫培養(yǎng)箱孵育3 h后用酶標儀中檢測各孔在450 nm的吸光度。

1.2.4 qPCR檢測各組成骨相關(guān)基因堿性磷酸酶（ALP）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-1（BMP-1）及骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（BMP-7）的mRNA相對表達量 rBMSCs 孵育24 h后使用Trizol提取各組細胞中RNA，然后根據(jù)說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，上機檢測ALP、BMP-1及BMP-7的mRNA相對表達量。選用β-Actin為對照基因，對目標檢測基因進行標準化。試驗所需引物見表1。

1.2.5 采用ELISA法檢測各組ALP、BMP-1、BMP-7的蛋白表達水平 rBMSCs 孵育24 h后分別各組收集細胞上清液，嚴格按照試劑盒說明檢測各組ALP、BMP-1、BMP-7含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 23.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，所有實驗均獨立重復(fù)三次，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度LL-37/PLGA/β-TCP復(fù)合支架下電鏡形態(tài) LL-37/PLGA/β-TCP復(fù)合支架材料隨著LL-37濃度增加而呈現(xiàn)多孔、細胞吸附增多的趨勢，促進細胞貼附生長，見圖1。

2.2 各組rBMSCs增殖情況 干預(yù)24 h，0、1及5 μmol/L組rBMSCs增殖與N組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），而10 μmol/L組rBMSCs增殖明顯高于N組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。干預(yù)48 h，1、5、10 μmol/L組rBMSCs增殖能力均明顯高于N組（P<0.01）;隨著干預(yù)時間延長，1、5、10 μmol/L組均對rBMSCs有促進增殖作用，且呈濃度依賴作用。見表2和圖2。

2.3 各組ALP、BMP-1、BMP-7的mRNA相對表達量比較 1、5、10 μmol/L組ALP、BMP-1和BMP-7的mRNA表達量均明顯高于N組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。1、5、10 μmol/L組ALP、BMP-1、BMP-7的mRNA均呈高表達，且呈濃度依賴性（P<0.05）。見表3和圖3。

2.4 各組ALP、BMP-1、BMP-7的蛋白表達水平比較 1、5、10 μmol/L組ALP、BMP-1和BMP-7的蛋白表達水平均明顯高于N組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。1、5、10 μmol/L組ALP、BMP-1、BMP-7蛋白均呈高表達，且呈濃度依賴性（P<0.05）。見表4和圖4。

3 討論

大段骨缺損一直都是骨科臨床的治療難點，隨著骨組織工程技術(shù)的進展，應(yīng)用骨組織工程技術(shù)治療骨或軟骨缺損逐漸成了研究的熱點。骨組織工程具有三大關(guān)鍵要素，即種子細胞、支架材料和生長因子。骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSC）是一種在骨髓基質(zhì)中具有多種分化潛能的細胞亞群，其在特定刺激下可以分化為多種細胞，如成骨細胞、軟骨細胞、成纖維細胞以及神經(jīng)細胞等[11]。因其具有方便獲取、可多次傳代以及較低的排斥反應(yīng)，是一種骨組織工程技術(shù)的優(yōu)選種子細胞，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于骨或軟骨缺損的實驗研究及臨床[12-14]。

PLGA是一種國際公認的可降解、具有良好生物相容性的材料，被廣泛認為是骨組織良好替代支架[15-16]。然PLGA因不具備成骨誘導(dǎo)性且親水性差，不利于細胞的黏附和分化，因此多應(yīng)用于與其他材料組成復(fù)合材料，以同時具備生物相容性、生物安全性、低毒性以及良好的與細胞黏附能力[16]。β-TCP因其化學(xué)性質(zhì)及晶體結(jié)構(gòu)與骨骼礦物非常相似，同時可以具備可吸收性、生物相容性，但其存在脆性大、韌性差等缺陷，限制了其在骨科方面的臨床應(yīng)用[17]。通過結(jié)合PLGA與β-TCP，運用3D打印技術(shù)按質(zhì)量比為4︰1的比例制備了PLGA/β-TCP支架，同時具有了多孔仿生結(jié)構(gòu)、良好的生物相容性、骨導(dǎo)電性和生物降解性，在體外和體內(nèi)的實驗中取得了良好的成骨效果[18-19]。

外源性的生長因子是骨組織工程技術(shù)治療骨缺損的過程中起到?jīng)Q定性作用的另一關(guān)鍵因素?？咕囊蚱渚哂袕V譜抗菌特性，同時具有免疫調(diào)節(jié)能力，對機體固有免疫及獲得性免疫均有顯著增強作用，是近年來成為研究的熱點[20-21]。有研究顯示，LL-37具有顯著的抗細菌、趨化、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤等作用[10]。筆者發(fā)現(xiàn)目前尚未有文章報道聯(lián)合使用LL-37及PLGA/β-TCP支架對于骨缺損的治療。因此本研究以rBMSCs為種子細胞，以PLGA/β-TCP支架為支架材料，同時加入LL-37作為外源性生長因子，觀察不同濃度的LL-37/PLGA/β-TCP復(fù)合支架對于rBMSCs增殖和成骨分化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)證明LL-37/PLGA/β-TCP具有良好的生物相容性及細胞黏附能力，能有效促進rBMSCs增殖，促進rBMSCs成骨相關(guān)基因（ALP、BMP-1和BMP-7）高表達。

綜上所述，LL-37/PLGA/β-TCP具有良好的作為骨組織工程支架的替代材料的潛能，可有效促進rBMSCs增殖和分化。在下一步研究工作中，筆者將通過動物實驗進一步探索該復(fù)合支架在生物體內(nèi)的成骨作用機理，為治療大段骨缺損骨組織工程治療實驗學(xué)依據(jù)。

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（收稿日期：2020-01-06） （本文編輯：田婧）