PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白在膽管癌中的表達(dá)及其臨床意義

黃利勇 吳芳華 鄭志剛

【摘要】 目的：探討PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白PI3K、Akt、PTEN在膽管癌（cholangiocarcinoma，CCA）中的表達(dá)及其臨床意義。方法：收集2010年1月-2017年1月本院47例CCA患者的癌組織及對應(yīng)癌旁組織標(biāo)本，另選擇同期14例正常膽管組織標(biāo)本。比較CCA、癌旁組織及正常膽管組織中PI3K、Akt與PTEN蛋白的陽性表達(dá)率，并分析PI3K、Akt與PTEN蛋白在CCA組織中陽性表達(dá)的相關(guān)因素及相關(guān)性。結(jié)果：CCA組織中PI3K與Akt的陽性表達(dá)率均高于癌旁組織和正常膽管組織（P<0.05）;CCA組織中PTEN陽性表達(dá)率均低于癌旁組織和正常膽管組織（P<0.05）;CCA組織、癌旁組織及正常膽管組織的PI3K、Akt及PTEN陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。有無神經(jīng)侵犯、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及TNM分期是PI3K、Akt及PTEN蛋白在CCA組織中陽性表達(dá)的相關(guān)因素（P<0.05）。PI3K、Akt與PTEN在CCA組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.635、-0.506，P<0.001），而PI3K與Akt在CCA組織中的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.332，P=0.023）。結(jié)論：PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路在CCA組織中過度表達(dá)，可能參與了CCA的發(fā)生與發(fā)展，可作為生物學(xué)行為的評估指標(biāo)，PI3K/Akt信號通路可望成為CCA臨床干預(yù)的分子靶點。

【關(guān)鍵詞】 膽管癌 PI3K/Akt信號通路 PTEN

[Abstract] Objective： To investigate the expression and clinical significance of protein PI3K， Akt and PTEN which correlated with PI3K/Akt signaling pathway in cholangiocarcinoma （CCA）. Method： Cancer tissues and corresponding paracancer tissue specimens of 47 CCA patients were collected from our hospital from January 2010 to January 2017. Another 14 normal bile duct specimens were selected. The positive expression rates of PI3K， Akt and PTEN proteins in CCA， paracancer and normal bile duct tissues were compared， and the relevant factors and correlations of PI3K， Akt and PTEN proteins expressions in CCA tissues were analyzed. Result： The positive expression rates of PI3K and Akt in CCA tissues were higher than those in paracancer and normal bile duct tissues （P<0.05）. The positive expression rate of PTEN in CCA tissues was lower than that in paracancer and normal bile duct tissues （P<0.05）. There were significant differences in the positive expression rates of PI3K， Akt and PTEN in CCA， paracancer and normal bile duct tissues （P<0.05）. The presence of nerve invasion， depth of infiltration， lymph node metastasis and TNM stage were the relevant factors for the positive expression of PI3K， Akt and PTEN in CCA tissues （P<0.05）. PI3K and Akt were negatively correlated with the expression of PTEN in CCA tissues （r=-0.635， -0.506， P<0.001）， while PI3K was positively correlated with the expression of Akt in CCA tissues （r=0.332， P=0.023）. Conclusion： The PI3K/Akt signaling pathway is overexpressed in CCA tissues， which may be involved in the occurrence and development of CCA， and can be used as an evaluation indicator of biological behavior， PI3K/Akt signaling pathway is expected to become a molecular target for clinical intervention of CCA.

近年來，膽管癌（cholangiocarcinoma，CCA）的發(fā)病率逐年升高，因極具侵襲轉(zhuǎn)移特性，且發(fā)病隱匿，導(dǎo)致大多數(shù)患者確診即為晚期，盡管根治性手術(shù)切除對部分膽管癌患者預(yù)后有所獲益，但5年生存率仍不高，中位生存時間僅1～2年，預(yù)后極差，因此一直是臨床上的難治性疾病之一[1-2]。在人類腫瘤譜中均發(fā)現(xiàn)有活動異常的信號通路，推測其可能參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B， PI3K/Akt）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在多種惡性腫瘤中存在異常失調(diào)現(xiàn)象，此通路中相關(guān)成分突變可引起通路功能異常，不僅參與癌細(xì)胞增殖分化和凋亡，還與癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移、促腫瘤新生血管生成以及拮抗放化療等密切相關(guān)[3-4]。PI3K作為催化磷脂酰肌醇物質(zhì)的特異性激酶，通過活化Akt參與細(xì)胞增殖、分化及凋亡，Akt是PI3K下游靶蛋白，可啟動下游底物調(diào)控細(xì)胞周期、抑制凋亡及促血管生成，而負(fù)性調(diào)控因子PTEN功能丟失可激活PI3K/Akt信號通路，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展。本研究對PI3K、Akt及PTEN在CCA中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，旨在探討其在CCA發(fā)生發(fā)展中的作用及其與CCA生物學(xué)行為的關(guān)系，從而為CCA的預(yù)防及治療提供新思路，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2010年1月-2017年1月本院47例CCA患者的癌組織及對應(yīng)癌旁組織（距離腫瘤2～3 cm）標(biāo)本。另選擇同期14例正常膽管組織標(biāo)本（因外傷等原因切除的標(biāo)本）。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡25～75歲，均接受CCA根治手術(shù)且經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查確診為CCA;術(shù)前均未接受放化療等腫瘤相關(guān)治療;有完整的臨床病理資料及隨訪資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往或同期合并有其他惡性腫瘤相關(guān)疾病的患者。所有患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書，本研究已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法與試劑 采用免疫組化（SP）法檢測PI3K、Akt及PTEN蛋白在CCA組織、癌旁組織及正常膽管組織中的表達(dá)情況。所有標(biāo)本手術(shù)切除后均經(jīng)10%甲醛固定及石蠟包埋，4 μm厚度連續(xù)切片。主要試劑包括兔抗人PI3K單克隆抗體、兔抗人Akt單克隆抗體、兔抗人PTEN多克隆抗體、SP二抗及DAB試劑盒均全套購自北京中杉生物技術(shù)有限公司，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。用公司提供的已知陽性組織作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn) 采用雙盲法由兩位有經(jīng)驗的病理醫(yī)師對切片免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行判讀。PI3K、Akt及PTEN蛋白的陽性表達(dá)均以細(xì)胞漿出現(xiàn)背景清晰的棕黃或棕褐色顆粒為標(biāo)準(zhǔn)。PI3K及PTEN蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì);Akt蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，部分表達(dá)于細(xì)胞核。判定標(biāo)準(zhǔn)：（1）按切片中陽性細(xì)胞所占百分比計分：陽性細(xì)胞<25%為0分，26%～50%為1分，51%～75%為2分，>75%為3分;（2）按切片中陽性染色強(qiáng)度計分：無顯色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例及陽性染色強(qiáng)度進(jìn)行綜合評分，兩項乘積≤4分記為陰性表達(dá)，>4分記為陽性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 23.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗;計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析;生存分析采用Kaplan-Meier法，組間比較采用log-rank檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較 CCA及癌旁組織標(biāo)本男31例，女16例;年齡42～72歲，平均（52±11）歲。正常膽管組織標(biāo)本男9例，女5例;年齡25～75歲，平均（46±17）歲。兩組一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 PI3K、Akt及PTEN蛋白在CCA、癌旁組織及正常膽管組織中的表達(dá) CCA組織中PI3K與Akt的陽性表達(dá)率均高于癌旁組織和正常膽管組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;CCA組織中PTEN陽性表達(dá)率均低于癌旁組織和正常膽管組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;CCA組織、癌旁組織及正常膽管組織的PI3K、Akt及PTEN陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但癌旁組織和正常膽管組織PI3K、AKT及PTEN陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.3 CCA組織中PI3K、AKT及PTEN蛋白陽性表達(dá)的相關(guān)因素分析 有無神經(jīng)侵犯、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及TNM分期為PI3K、Akt及PTEN蛋白在CCA組織中陽性表達(dá)的相關(guān)因素，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.4 PI3K、AKT及PTEN蛋白在CCA組織中表達(dá)的相關(guān)性 PI3K、Akt均與PTEN在CCA組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.635、-0.506，P<0.001），而PI3K與Akt在CCA組織中的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.332，P=0.023）。見表3。

3 討論

CCA是惡性程度極高、預(yù)后較差的惡性腫瘤之一。由于肝膽外科技術(shù)的發(fā)展與一系列新治療方法的建立，CCA的無病生存期已逐漸延長，但是其復(fù)發(fā)率仍然很高，遠(yuǎn)期療效較差[5-6]。在分子生物學(xué)方面，目前研究認(rèn)為CCA的發(fā)生發(fā)展與侵襲轉(zhuǎn)移是多基因、蛋白及細(xì)胞因子共同調(diào)控的復(fù)雜過程。PI3K/Akt是細(xì)胞中普遍存在的一種信號通路，可通過調(diào)控細(xì)胞周期、能量代謝及蛋白合成等途徑在細(xì)胞增殖、分化與凋亡過程中發(fā)揮重要生理功能，此通路中某些成分的改變可導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，而所致的功能缺失或獲得在腫瘤細(xì)胞的增殖分化與侵襲轉(zhuǎn)移等過程中起重要作用[7-9]。抑癌基因PTEN可通過對PI3K/Akt信號通路的負(fù)性調(diào)控而發(fā)揮抑制腫瘤形成的功能，PTEN失活則可降低對該通路的抑制作用而導(dǎo)致細(xì)胞癌變[10]。PI3K/Akt信號通路在CCA發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，主要表現(xiàn)為抑制肝癌細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞生存、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移及腫瘤血管生成，因此，針對本通路的靶向治療已成為CCA研究焦點。

癌基因PI3K是磷脂激酶家族重要成員，為一種由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110組成的異源二聚體，主要存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，具有激酶活性，可將刺激性信號由細(xì)胞膜傳導(dǎo)至細(xì)胞漿[11-12]。PI3K具有抗細(xì)胞凋亡作用，Bertram等[13]研究證實PI3K抗凋亡功能可能通過抑制Fas凋亡而實現(xiàn)的。Banumathy等[14]則認(rèn)為PI3K可引起Akt突變而使細(xì)胞失去正常生理功能，且誘發(fā)腫瘤生成，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。本研究結(jié)果顯示，CCA組織中PI3K蛋白陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織及正常膽管組織（P<0.05），提示PI3K可能與CCA發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，而其機(jī)制則可能是通過促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和抑制CCA細(xì)胞凋亡而實現(xiàn)。且分析顯示當(dāng)存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高侵襲性及腫瘤分期晚等高危因素時，CCA中PI3K蛋白的陽性表達(dá)率相應(yīng)增高，提示在CCA的侵襲轉(zhuǎn)移方面PI3K亦發(fā)揮著作用。

Akt為一種主要存在胞漿中在進(jìn)化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，由480個氨基酸殘基組成，是PI3K下游蛋白。AKT的基本結(jié)構(gòu)含有催化活性區(qū)，活性區(qū)中包含Thr308及Ser473位點，Akt通過血小板-白細(xì)胞C激酶同源區(qū)與PI3K相結(jié)合而使兩位點磷酸化而被激活，進(jìn)而發(fā)揮調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡的生理功能[15-17]。早期Liu等[18]通過基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)HCC細(xì)胞中Akt的表達(dá)較正常肝臟組織明顯升高。而Duronio等[19]研究證實Akt失活的等位基因可以改變其致癌現(xiàn)象。亦有研究顯示Akt可激活內(nèi)皮型NO合酶磷酸化而產(chǎn)生與血管新生關(guān)系密切的NO[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，CCA組織中Akt蛋白陽性表達(dá)率高于癌旁組織與正常膽管組織，且隨著侵襲性增高和病理分期升高其陽性率增加，提示CCA中Akt的表達(dá)增高與惡性進(jìn)展密切相關(guān)，可能在CCA惡性演進(jìn)中發(fā)揮重要作用。Akt抑制劑MK-2206是當(dāng)前針對PI3K/Akt通路的研究熱點，抑制Akt的功能可消除PI3K/Akt通路介導(dǎo)的增殖信號，抑制周期細(xì)胞活性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[21]。

PTEN定位于人類第10q23.3染色體上，是具有雙特異性磷酸脂酶活性的抑癌基因。其通過催化PI3K（3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇脫磷酸）去磷酸化還原為PIP2（4，5-二磷酸磷脂酰肌醇）實現(xiàn)對PI3K/Akt信號通路的負(fù)性調(diào)節(jié)，達(dá)到抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[10]。因此PTEN的缺失或失活會引起PI3K/Akt信號通路高度激活，導(dǎo)致此通路的活化及促進(jìn)下游信號分子活性。PTEN在多種腫瘤組織中低表達(dá)，如結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、小細(xì)胞肺癌等[22-23]。已有研究證實PTEN表達(dá)缺失與CCA發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[24]。本研究發(fā)現(xiàn)PTEN在CCA組織中陽性表達(dá)率明顯低于癌旁組織及正常膽管組織（P<0.05），其表達(dá)與腫瘤大小、病理分級、侵襲性及病理分期均相關(guān)，表明PTEN參與了CCA發(fā)生發(fā)展，PIEN表達(dá)缺失或低表達(dá)導(dǎo)致其抑制正常細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的能力降低，進(jìn)而使細(xì)胞癌變、增強(qiáng)細(xì)胞增殖、分化能力，與CCA惡性進(jìn)展、高侵襲轉(zhuǎn)移特性密切相關(guān)。

本研究中PI3K、Akt均與PTEN在CCA組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.635、-0.506，P<0.001），表明PI3K、Akt與PTEN在CCA發(fā)生發(fā)展中可能相互拮抗，CCA中PTEN表達(dá)缺失可能引起PI3K、Akt的活化失去抑制作用，導(dǎo)致PI3K、Akt過度表達(dá)，使PI3K/AKT通路處于持續(xù)活化狀態(tài)，造成細(xì)胞增殖加快，促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展。此外，PI3K與AKT在CCA組織中的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.332，P=0.023），提示PI3K和Akt兩者協(xié)同促進(jìn)CCA發(fā)生、發(fā)展及惡化進(jìn)展。

綜上所述，PI3K/Akt信號通路在CCA中過度表達(dá)可能與抑癌基因PTEN表達(dá)缺失有關(guān)，進(jìn)而使PI3K、Akt的活化失去抑制作用，造成該通路持續(xù)活化，促進(jìn)CCA細(xì)胞發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移等惡性進(jìn)展。PI3K/Akt信號通路中的相關(guān)蛋白可作為生物學(xué)行為的評估指標(biāo)，今后圍繞PI3K/Akt信號通路開展CCA基因治療，有望成為抑制CCA惡性進(jìn)展、提高患者生存率的新手段。

參考文獻(xiàn)

[1] Murad S D，Kim W R，Therneau T，et al.Predictors of pretransplant dropout and posttransplant recurrence in patients with perihilar cholangiocarcinoma[J].Hepatology，2012，56（3）：972-981.

[2] Hameed A，Pang T，Chiou J，et al.Percutaneous vs.endoscopic pre-operative biliary drainage in hilar cholangiocarcinoma-a systematic review and meta-analysis[J].HPB （Oxford），2016，18（5）：400-410.

[3] Jung K H，Choi M J，Hong S，et al.HS-116，a novel phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor induces apoptosis and suppresses angiogenesis of hepatocellular carcinoma through inhibition of the PI3K/AKT/mTOR pathway[J].Cancer Lett，2012，316（2）：187-195.

[4] Sabine V S，Crozier C，Brookes C L，et al.Mutational analysis of PI3K/AKT signaling pathway in tamoxifen exemestane adjuvant multinational pathology study[J].J Clin Oncol，2014，32（27）：2951-2958.

[5] Krasinskas A M.Cholangiocarcinoma[J].Surg Pathol Clin，2018，11（2）：403-429.

[6] Baheti A D，Tirumani S H，Rosenthal M H，et al.Diagnosis and management of intrahepatic cholangiocarcinoma：A comprehensive update for the radiologist[J].Clin Radiol，2014，69（12）：463-470.

[7] Zhang Y，Zhang J W，Lv G Y，et al.Effects of STAT3 gene silencing and rapamycin on apoptosis in hepatocarcinoma cells[J].Int J Med Sci，2012，9（3）：216-224.

[8] Bhaskar P T，Hay N.The two TORCs and Akt[J].Dev Cell，2007，12（4）：487-502.

[9] Engelman J A.Targeting PI3K signalling in cancer：opportunities，challenges and limitations[J].Nat Rev Cancer，2009，9（8）：550-562.

[10] Jiang B H，Liu L Z.PI3K/PTEN signaling in angiogenesis and tumorigenesis[J].Adv Cancer Res，2009，102（1）：19-65.

[11] Paz-Ares L，Blanco-Aparicio C，Garcia-Carbonero R，et al.

Inhibiting PI3K as a therapeutic strategy against cancer[J].Clin Transl Oncol，2009，11（9）：572-579.

[12] Engelman J A，Luo J，Cantley L C.The evolution of phosphatidylinositol 3-kinases as regulators of growth and metabolism[J].Nat Rev Genet，2006，7（8）：606-619.

[13] Bertram J，Peacock J W，Tan C，et al.Inhibition of the phosphatidylinositol 3'-kinase pathway promotes autocrine Fas-induced death of phosphatase and tensin homologue-deficient prostate cancer cells[J].Cancer Res，2006，66（9）：4781-4788.

[14] Banumathy G，Cairns P.Signaling pathways in renal cell carcinoma[J].Cancer Biol Ther，2010，10（7）：658-664.

[15] Pande S，Browne G，Padmanabhan S，et al.Oncogenic cooperation between PI3K/Akt signaling and transcription factor Runx2 promotes the invasive properties of metastatic breast cancer cells[J].J Cell Physiol，2013，228（8）：1784-1792.

[16] Yang N Y，F(xiàn)ernandez C，Richter M，et al.Crosstalk of the EphA2 receptor with a serine/threonine phosphatase suppresses the Akt-mTORC1 pathway in cancer cells[J].Cell Signal，2011，23（1）：201-212.

[17] Meric-Bernstam F，Akcakanat A，Chen H，et al.PIK3CA/PTEN mutations and Akt activation as markers of sensitivity to allosteric mTOR inhibitors[J].Clin Cancer Res，2012，18（6）：1777-1789.

[18] Liu L X，Liu Z H，Jiang H C，et al.Gene expression profiles of hepatoma cell line HLE[J].World J Gastroenterol，2003，9（4）：683-687.

[19] Duronio V.The life of a cell：apoptosis regulation by the PI3K/PKB pathway[J].Biochem J，2008，415（3）：333-344.

[20] Gordan J D，Simon M C.Hypoxia-inducible factors：central regulators of the tumor phenotype[J].Curr Opin Genet Dev，2007，17（1）：71-77.

[21] Simioni C，Martelli A M，Cani A，et al.The AKT inhibitor MK-2206 is cytotoxic in hepatocarcinoma cells displaying hyperphosphorylated AKT-1 and synergizes with conventional chemotherapy[J].Oncotarget，2013，4（9）：1496-1506.

[22]詹曉娟，余研，戴益琛，等.結(jié)直腸癌組織中PTEN、VEGF-A、MVD表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系[J].癌癥進(jìn)展.2016，14（12）：1239-1242.

[23] Boosani C S，Agrawal D K.PTEN modulators：a patent review[J].Expert Opin Ther Pat，2013，23（5）：569-580.

[24] Yothaisong S，Dokduang H，Techasen A，et al.Increased activation of PI3K/AKT signaling pathway is associated with cholangiocarcinoma metastasis and PI3K/mTOR inhibition presents a possible therapeutic strategy[J].Tumour Biol，2013，34（6）：3637-3648.

（收稿日期：2020-02-27） （本文編輯：田婧）