豬瘟病毒E2蛋白主要抗原區(qū)高效表達(dá)及間接ELISA抗體檢測(cè)方法的建立和應(yīng)用

陳九，潘麗，馬中元，崔燕*

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，甘肅 蘭州 730000； 2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730000)

豬瘟病毒(classical swine fever virus)可感染所有品種不同年齡的豬和野豬[1]。豬瘟發(fā)病特征是實(shí)質(zhì)器官出血、壞死與梗死；慢性發(fā)病常見(jiàn)纖維素性壞死性腸炎，曾被稱為豬霍亂(hog cholera)[2-4]。豬瘟傳播快、病死率高，在世界范圍流行，是動(dòng)物健康和生豬養(yǎng)殖業(yè)需要面對(duì)的巨大威脅，是豬最重要的病毒性傳染病之一[5]。

豬瘟病毒是黃病毒科瘟病毒屬成員，為單股正鏈RNA病毒，基因組大小約為12.3 kb，包含1個(gè)大的開(kāi)放閱讀框(ORF)，側(cè)翼是2個(gè)非翻譯區(qū)(NTR)[6-8]。ORF編碼大約3 900個(gè)氨基酸的多聚蛋白，由病毒和宿主細(xì)胞蛋白酶協(xié)同翻譯和加工形成12種蛋白，核衣殼蛋白C和3種包膜糖蛋白E0、E1和E2構(gòu)成病毒核酸外的蛋白質(zhì)保護(hù)結(jié)構(gòu)，此外還編碼了8種非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白[9-10]。C、E0、E1、E2基因長(zhǎng)度分別為297、681、585、1 119 nt，其中E2序列最長(zhǎng)[11]。E2蛋白可分為A、B、C、D 4個(gè)抗原區(qū)，位于E2蛋白N端氨基酸殘基690～866，是E2抗原性最強(qiáng)的部分[12]。A抗原區(qū)又分了3個(gè)亞區(qū)A1、A2、A3，A1亞區(qū)和B、C抗原區(qū)是中和抗原表位區(qū)[13]。豬自然感染豬瘟后，產(chǎn)生針對(duì) E2蛋白的中和抗體，時(shí)間快，含量多，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。因此E2蛋白是豬瘟新型疫苗開(kāi)發(fā)和臨床檢測(cè)的首選蛋白[14]。

大腸桿菌表達(dá)蛋白質(zhì)的技術(shù)成熟、成本低、培養(yǎng)周期短、抗污染能力強(qiáng)，并且容易擴(kuò)大生產(chǎn)，方便研究成果迅速轉(zhuǎn)化產(chǎn)生實(shí)際價(jià)值。但大腸桿菌表達(dá)外源蛋白有時(shí)會(huì)出現(xiàn)表達(dá)量低甚至不表達(dá)的情況，這很有可能是因?yàn)檫@些外源基因使用的密碼子是大腸桿菌非偏愛(ài)的密碼子[15]。

本試驗(yàn)對(duì)E2蛋白主要抗原區(qū)稀有密碼子進(jìn)行同義替換以望提高表達(dá)量，并將重組蛋白作為抗原建立豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與感受態(tài)細(xì)胞

含有E2主要抗原區(qū)基因的重組質(zhì)粒pET-30a(+)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，大腸桿菌BL21(DE3)菌種來(lái)自寶生物工程 (大連) 有限公司。

1.2 主要試劑及血清

兔抗豬IgG-HRP、蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自天根生物技術(shù)有限公司；Ni-NTA柱購(gòu)自GeneScript公司；豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒、豬藍(lán)耳病病毒、偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒、豬流行性腹瀉病毒、口蹄疫病毒(O型)的抗體陽(yáng)性血清來(lái)自蘭州獸醫(yī)研究所，由標(biāo)準(zhǔn)疫苗規(guī)范接種仔豬獲得；陰性血清取自未接種疫苗的仔豬；其他試劑全為分析純。

1.3 E2主要抗原區(qū)的密碼子優(yōu)化

根據(jù)研究顯示，E2基因在表達(dá)時(shí)密碼子選擇有較高的偏愛(ài)性[16]。E2基因與大腸桿菌使用頻率差異較大的密碼子有33個(gè)，其中最突出的是GCG、AGA、AGG與CGC；E2基因中共有34個(gè)稀有密碼子，其中存在AGGAGG、AGGAGA、CCCATA、AGAATA、CCCAGG、AGACCC、CTAATA這樣稀有密碼子成對(duì)出現(xiàn)的情況。在NCBI網(wǎng)站查閱豬瘟病毒全部序列(NC_002657.1)，選擇E2蛋白主要抗原區(qū)序列，根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性對(duì)其進(jìn)行稀有密碼子同義替換和優(yōu)化，主要方法是從豬瘟病毒全基因序列中獲取 E2蛋白N端抗原區(qū)對(duì)應(yīng)的編碼序列,使用專業(yè)的計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行稀有密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的序列由南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行合成并直接插入pET-30a(+)，重組質(zhì)粒命名為pET-30a-E2。

1.4 E2原核表達(dá)及純化

將pET-30a-E2轉(zhuǎn)化宿主菌BL21 (DE3)，涂布于含卡那霉素的LB平板選擇培養(yǎng)，挑取單個(gè)白色菌落放入培養(yǎng)管，加入少量LB液體培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)2 h，將培養(yǎng)物按照1∶1 000比例接種在含有50 mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中于37 ℃、220 r/min擴(kuò)增培養(yǎng)，直至OD600達(dá)到0.6～0.8，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。

收集菌液以8 000 r/min離心5 min，棄去上清液收集菌體沉淀，菌體用PBS(pH=7) 緩沖液混合均勻，置于冰上用超聲波破碎菌體，于4℃以10 000 r/min離心15 min，收集上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE確定目的蛋白，包涵體用8 mol/L尿素溶解，離心收集上清液，微孔濾膜過(guò)濾去除雜質(zhì)，按照說(shuō)明書(shū)使用Ni-NTA柱進(jìn)行過(guò)柱純化重組蛋白。

1.5 重組蛋白Western blot測(cè)試抗原性

目的蛋白溶解在變性劑中，使用分步透析法[17]于4 ℃逐步去除變性劑根據(jù)說(shuō)明書(shū)使用蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒對(duì)溶液進(jìn)行蛋白含量檢測(cè)；純化后的蛋白進(jìn)行Western blot試驗(yàn)檢測(cè)與豬瘟病毒血清抗體的結(jié)合能力。

1.6 優(yōu)化間接ELISA反應(yīng)條件

將純化的重組蛋白用作包被抗原，進(jìn)行方陣滴定確定合適的抗原包被量以及血清稀釋度等，用pH=9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋重組蛋白以25、50、100和200 ng/孔包被于酶標(biāo)板，于4 ℃過(guò)夜，5 g/L的牛血清白蛋白試劑作為封閉液進(jìn)行封閉，PBST洗滌3次，血清以1∶10、1∶20、1∶40、1∶80稀釋，每孔100 μL轉(zhuǎn)移至酶標(biāo)板，于37 ℃孵育30 min，PBST洗滌3次，加入100 μL適合稀釋度的兔抗豬IgG-HRP，于37 ℃孵育30 min，PBST洗滌3次，加入TMB底物，于37 ℃顯色10 min，加50 μL終止液測(cè)量OD450值。確定檢測(cè)的條件后，檢測(cè)已知狀態(tài)的血清樣品，再使用MedCalc軟件繪制血清檢測(cè)特征曲線(receiver operating characteristic，ROC)，對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行圖像化便于直觀感受和分析，選擇正確率較高的臨界值確定為豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測(cè)方法的臨床檢測(cè)臨界值。

1.7 間接ELISA重復(fù)性檢測(cè)

使用建立的間接ELISA方法在同一檢測(cè)板和不同檢測(cè)板進(jìn)行8次進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)，測(cè)試間接ELISA的重復(fù)性。

1.8 間接ELISA特異性檢測(cè)

使用建立的間接ELISA方法對(duì)多種常見(jiàn)豬病毒抗體陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，包括豬圓環(huán)病毒、豬藍(lán)耳病病毒、偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒、豬流行性腹瀉病毒、口蹄疫病毒、豬瘟病毒的抗體陽(yáng)性血清。為了使檢測(cè)數(shù)據(jù)更具有適用性，統(tǒng)計(jì)時(shí)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以此測(cè)試間接ELISA的特異性。

1.9 間接ELISA臨床檢測(cè)

使用建立的間接ELISA檢測(cè)566份臨床血清，與愛(ài)德仕生產(chǎn)的豬瘟阻斷ELISA試劑盒進(jìn)行比較，統(tǒng)計(jì)符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 E2基因主要抗原區(qū)序列優(yōu)化

原始序列對(duì)大腸桿菌的密碼子適應(yīng)指數(shù)為0.37，優(yōu)化后的密碼子適應(yīng)指數(shù)為0.83；原始序列CG含量為49.81%，優(yōu)化后CG含量為50.95%;優(yōu)化后的核酸序列使用DNAMAN軟件與原序列進(jìn)行對(duì)比，相似度為72.92%，氨基酸序列不變。密碼子優(yōu)化后原序列中大腸桿菌使用頻率低于10%的密碼子全部被替換，序列中密碼子偏好性普遍上升(見(jiàn)圖1、圖2)。

圖 1 密碼子優(yōu)化前

2.2 重組蛋白的表達(dá)

重組蛋白的分子量約為30 ku，預(yù)期位置出現(xiàn)明顯的條帶，目的蛋白被成功誘導(dǎo)表達(dá)，占總蛋白的41%，表達(dá)產(chǎn)物主要分布在細(xì)菌的包涵體沉淀中(見(jiàn)圖3)。

2.3 重組蛋白的純化

將表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA親和純化柱純化，SDS-PAGE(見(jiàn)圖4)顯示只出現(xiàn)1條與目的蛋白分子質(zhì)量一致的條帶，證明重組蛋白已經(jīng)被純化。

2.4 重組蛋白Western blot試驗(yàn)

復(fù)性后的重組蛋白與豬瘟病毒陽(yáng)性血清進(jìn)行Western blot試驗(yàn)(見(jiàn)圖5)。重組蛋白能與豬瘟病毒抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，在相應(yīng)位置出現(xiàn)明顯條帶，表明重組蛋白與豬瘟病毒抗體結(jié)合能力強(qiáng)，可以用于檢測(cè)豬瘟病毒抗體。

圖 2 密碼子優(yōu)化后

M.蛋白 Marker；1～2. 上清；3～4. 包涵體

圖3 E2重組蛋白的可溶性SDS-PAGE分析

M.蛋白 Marker；1. E2純化蛋白

圖4 E2重組蛋白純化SDS-PAGE分析

M.蛋白 Marker; 1～2.E2蛋白

圖5 E2重組蛋白的Western blot檢測(cè)

2.5 重組蛋白濃度檢測(cè)

根據(jù)說(shuō)明書(shū)使用蛋白定量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行重組蛋白濃度檢測(cè)，顯示純化復(fù)性后溶液中蛋白質(zhì)的含量約為1.5 mg/mL，純化過(guò)程損失部分重組蛋白。

2.6 間接ELISA條件的優(yōu)化

使用方陣滴定法確定最適抗原包被量和血清稀釋度(見(jiàn)表1)。選擇陽(yáng)性血清OD450接近1且P/N較大的條件即抗原包被量為100 ng/孔，血清稀釋度為1∶40。使用不同稀釋度的酶標(biāo)二抗進(jìn)行血清樣品檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)P/N值(見(jiàn)表2)。選擇P/N值比較高的1∶20 000作為酶標(biāo)二抗的工作濃度。

表1 選擇最適抗原包被量和血清稀釋度

血清稀釋度抗原包被量/ng25501002001∶10陽(yáng)性血清1.1261.3972.2942.952陰性血清0.1040.1710.2260.322P/N10.8278.17010.509.6181∶20陽(yáng)性血清1.0651.2331.8942.723陰性血清0.1120.1150.1510.211P/N9.50910.72212.54312.9051∶40陽(yáng)性血清0.6860.8901.4232.099陰性血清0.0910.0860.1130.141P/N7.53810.34913.81614.8871∶80陽(yáng)性血清0.3230.5740.9061.617陰性血清0.0780.0780.0920.136P/N4.1417.5399.84811.809

表2 不同稀釋度的酶標(biāo)二抗P/N值

二抗稀釋度血清樣品12341∶20 00013.512.612.912.51∶30 00011.611.311.711.61∶40 00010.210.310.211.11∶50 0008.58.28.99.8

2.7 間接ELISA的臨界值確定

確定間接ELISA反應(yīng)條件之后，用間接ELISA檢測(cè)164份陰性血清和402份陽(yáng)性血清，統(tǒng)計(jì)檢測(cè)數(shù)據(jù)，制作血清檢測(cè)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)(見(jiàn)圖6)，并繪制ROC曲線(見(jiàn)圖7)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。當(dāng)OD450取值大于0.23則百分之百陽(yáng)性，當(dāng)OD450取值小于0.13則百分之百陰性，在兩者之間存在少量交叉。綜合數(shù)據(jù)確定間接ELISA臨床檢測(cè)最佳臨界值為OD450=0.18，此時(shí)約登指數(shù)為0.866 4。

圖6 血清檢測(cè)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

圖7 血清檢測(cè)ROC曲線確定臨界值

2.8 間接ELISA重復(fù)性試驗(yàn)

使用建立的間接ELISA方法在同一檢測(cè)板和不同檢測(cè)板上進(jìn)行8次重復(fù)檢測(cè)，結(jié)果顯示批內(nèi)變異系數(shù)為3.72%，批間變異系數(shù)為4.75%。重復(fù)檢測(cè)變異系數(shù)均低于5%，說(shuō)明建立的間接ELISA有良好的穩(wěn)定性。

2.9 間接ELISA特異性測(cè)試

使用建立的間接ELISA檢測(cè)多種常見(jiàn)豬病毒抗體陽(yáng)性血清，陰性血清作為對(duì)照，統(tǒng)計(jì)檢測(cè)結(jié)果(見(jiàn)表3)。除豬瘟病毒陽(yáng)性血清，其他血清OD450值均沒(méi)有到達(dá)間接ELISA臨界值甚至遠(yuǎn)低于臨界值，這表明建立的豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測(cè)方法與上述常見(jiàn)豬病毒抗體無(wú)交叉反應(yīng)，特異性強(qiáng)有實(shí)用價(jià)值。

表3 間接ELISA特異性試驗(yàn)

2.10 間接ELISA臨床檢測(cè)

使用建立的豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測(cè)方法和愛(ài)德仕豬瘟阻斷ELISA試劑盒對(duì)566份來(lái)自養(yǎng)殖站的臨床血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，比較2種方法的符合性(見(jiàn)表4)。豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測(cè)方法的樣本陽(yáng)性率為65.37%，IDEXX試劑盒檢測(cè)樣本陽(yáng)性率為71.02%，與愛(ài)德仕的陽(yáng)性符合率為90.80%，陰性符合率為93.29%，總符合率為91.52%。本試驗(yàn)建立的間接ELISA與愛(ài)德仕生產(chǎn)的檢測(cè)試劑盒符合率高。

表4 臨床血清樣品檢測(cè)結(jié)果

檢測(cè)方法愛(ài)德仕 ELISA+-合計(jì)間接ELISA+36511376-37153190合計(jì)402164566

注：“+”表示檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性；“-”表示檢測(cè)結(jié)果陰性。

3 討論

控制豬瘟的策略主要包括不接種疫苗的撲殺政策和系統(tǒng)性疫苗接種預(yù)防措施[18]。執(zhí)行不接種疫苗政策的高密度養(yǎng)殖地區(qū)一旦豬瘟暴發(fā)會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[19]。中國(guó)目前執(zhí)行的豬瘟強(qiáng)制免疫措施要求豬群在一年中任何時(shí)間都要保持免疫率在90%以上[20]。為了控制和消除豬瘟，需要快速準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。全病毒抗原的生產(chǎn)難度高，但通過(guò)重組DNA技術(shù)獲得豬瘟病毒E2蛋白可以替代全病毒抗原[21]。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)已成為生產(chǎn)重組蛋白的有力系統(tǒng)，由Studier等[22]研究的T7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)仍是最成功的系統(tǒng)之一。本試驗(yàn)選擇帶有強(qiáng)啟動(dòng)子T7和His標(biāo)簽蛋白的pET-30a(+)作為基因載體，宿主菌選擇與之相配合的BL21(DE3)，建立一個(gè)高表達(dá)的原核系統(tǒng)條件。

有證據(jù)顯示物種間的密碼子使用偏好并不相同，據(jù)Zhang等[23]的研究，大腸桿菌至少有8個(gè)稀有密碼子，稀有密碼子與表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，如果稀有密碼子串聯(lián)成簇出現(xiàn)則對(duì)表達(dá)的抑制作用更加顯著。豬瘟病毒對(duì)原核表達(dá)系統(tǒng)的密碼子適應(yīng)指數(shù)偏低，E2基因中存在多個(gè)大腸桿菌稀有密碼子，并且存在稀有密碼子串聯(lián)出現(xiàn)的情況；利用計(jì)算機(jī)程序?qū)2主要抗原區(qū)序列進(jìn)行稀有密碼子同義替換，不改變對(duì)應(yīng)的氨基酸不影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和活性[24]。生物密碼子使用偏好的差異導(dǎo)致了異源基因表達(dá)的各種問(wèn)題，但可以通過(guò)合理的基因設(shè)計(jì)和合成克服。全基因表達(dá)對(duì)宿主菌負(fù)擔(dān)較大，本試驗(yàn)只表達(dá)E2蛋白主要抗原區(qū)保留免疫原性[25]。在相關(guān)報(bào)道中不乏有人實(shí)現(xiàn)部分或全長(zhǎng)序列的表達(dá)但表達(dá)量普遍偏低。本試驗(yàn)成功表達(dá)E2主要抗原區(qū)，表達(dá)量占菌體總蛋白的41%，比張永國(guó)等[26]研究的表達(dá)量高10%，獲得的重組蛋白含量是Wong等[27]的40倍，基本實(shí)現(xiàn)高表達(dá)。

E2蛋白在原核表達(dá)中以積聚體存在形成包涵體，有利于大腸桿菌大量表達(dá)外源蛋白，這雖然不是自然構(gòu)象，但只需要通過(guò)細(xì)菌破碎離心就能進(jìn)行收集達(dá)到初步純化的效果，而且有證據(jù)表明大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的截短E2蛋白不會(huì)改變抗原特性，不影響與對(duì)應(yīng)抗體的特異性結(jié)合[27]。

很多豬瘟病毒抗體檢測(cè)技術(shù)以全病毒為基礎(chǔ)，但豬瘟病毒難以培養(yǎng)純化且有散毒風(fēng)險(xiǎn)。本試驗(yàn)構(gòu)建的間接ELISA使用純化重組蛋白作為抗原提高了檢測(cè)質(zhì)量，可以通過(guò)光度定量對(duì)單個(gè)批次的抗原進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，還可以排除雜蛋白引起的可能的非特異性反應(yīng)。與僅檢測(cè)所使用指示抗體單一結(jié)合位點(diǎn)的抗體阻斷ELISA不同，間接ELISA檢測(cè)與包被抗原結(jié)合的所有抗體。在正向間接血凝試驗(yàn) (IHA)、間接ELISA、Dot-ELISA、膠體金免疫層析試紙條 (GICA) 4種檢測(cè)豬瘟病毒抗體的方法中，間接ELISA具有最高的靈敏性；與阻斷ELISA相比，間接ELISA操作更迅速、制備更簡(jiǎn)單。有研究者通過(guò)大量的田間試驗(yàn)數(shù)據(jù)研究后認(rèn)為，在目前中國(guó)的豬瘟強(qiáng)制免疫政策下，豬瘟病毒間接ELISA抗體試劑盒更適合中國(guó)國(guó)情[28-29]。由于E2蛋白在豬瘟病毒中高度保守的抗原結(jié)構(gòu)域，因此任何豬瘟病毒毒株(包括新出現(xiàn)的)所產(chǎn)生的抗體都有可能與其結(jié)合而被檢測(cè)到，這更有利于流行病學(xué)調(diào)查。本試驗(yàn)構(gòu)建的間接ELISA通過(guò)ROC曲線判斷臨界值，相比使用平均值作為臨界值則ROC曲線不易受極端值的影響，更能反映數(shù)據(jù)的特異性和敏感性，提高檢測(cè)準(zhǔn)確性。另外本試驗(yàn)建立的間接ELISA與進(jìn)口阻斷ELISA試劑盒相比在陽(yáng)性符合率、陰性符合率、總符合率方面均超過(guò)90%，在國(guó)內(nèi)類似研究中處于較好水平。這可能與包被蛋白的抗原性和判斷標(biāo)準(zhǔn)的選擇有關(guān)[30]。

本試驗(yàn)重組E2蛋白由大腸桿菌生產(chǎn)，因此可能缺乏自然狀態(tài)下的糖基化等修飾。雖有研究認(rèn)為其對(duì)抗原性影響不大但還是存在差異，有可能影響正確指數(shù)，而且間接ELISA包被抗原的純凈度對(duì)檢測(cè)效果有非常重要的影響。因此對(duì)重組蛋白的純化要求比較高，間接ELISA的高靈敏性對(duì)血清樣品的質(zhì)量要求也較高，取得樣品后要避免污染和及時(shí)檢測(cè)，避免樣品發(fā)生溶血導(dǎo)致非特異反應(yīng)。由于牛病毒性腹瀉病毒與豬瘟病毒的相似性以及自然狀態(tài)下的血清學(xué)交叉反應(yīng)，雖然本試驗(yàn)截取了E2蛋白抗原性最強(qiáng)的部分表達(dá)以削弱牛病毒性腹瀉病毒抗體對(duì)豬瘟病毒抗體檢測(cè)的影響，而且在標(biāo)準(zhǔn)化封閉養(yǎng)殖場(chǎng)豬感染牛病毒性腹瀉病毒的可能性很小，但在臨床懷疑存在牛病毒性腹瀉病毒時(shí)建議搭配RT-PCR檢測(cè)進(jìn)一步確診。

綜上，本試驗(yàn)優(yōu)化了E2主要抗原區(qū)密碼子提高了表達(dá)量，重組蛋白與豬瘟抗體特異性結(jié)合強(qiáng)，構(gòu)建的豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測(cè)方法與愛(ài)德仕生產(chǎn)的試劑盒總符合率達(dá)到91.52%，臨床檢測(cè)結(jié)果理想，可以進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用。