1株致禽霍亂多殺性巴氏桿菌的病原學(xué)與分子生物學(xué)鑒定

李偉杰，祁鑫，田野，豈曉鑫，蔣桃珍*

(1. 中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2. 北京市獸藥監(jiān)察所，北京 102629)

禽霍亂(fowl cholera)是由多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)引起的多種禽類(lèi)的出血性敗血癥，是危害我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的重要細(xì)菌性傳染病之一，雞、鴨和鵝等都有易感性[1]。病禽、康復(fù)禽或健康帶菌禽是本病的主要傳染源，禽霍亂造成雞的死亡損失通常發(fā)生于產(chǎn)蛋雞群。本文采用細(xì)菌分離培養(yǎng)、16S rDNA、Biolog、莢膜分型多重PCR、脂多糖多重PCR、動(dòng)物試驗(yàn)等方法對(duì)湖南某雞場(chǎng)病死雞體內(nèi)分離的1株菌株G-2進(jìn)行了病原學(xué)和分子生物學(xué)系統(tǒng)鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料

無(wú)菌采集湖南某雞場(chǎng)病死雞的肝、脾和心血等，置4 ℃冰箱待檢。

1.1.2 菌種

試驗(yàn)參考菌株多殺性巴氏桿菌CVCC 390，莢膜A型，由中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心提供。

1.1.3 培養(yǎng)基和試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)購(gòu)自O(shè)XOID公司，馬丁肉湯購(gòu)自北京中海生物科技有限公司，BUG培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Biolog公司，馬血清購(gòu)自Gibco公司，革蘭染色液試劑盒購(gòu)自Solarbio公司，PCR相關(guān)試劑、瓊脂糖購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

78和114日齡SPF雞購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離及純化

按照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 541-2016[2]，無(wú)菌采集死亡雞的肝、脾和心血，將病料少許接種于TSB中，37 ℃培養(yǎng)16～24 h，用一次性接種環(huán)挑取培養(yǎng)物劃線接種含5%雞血清的TSA培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16～24 h，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.2.2 菌株的培養(yǎng)及觀察

菌株劃線接種含5%雞血清的TSA培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌落形態(tài)及培養(yǎng)特性觀察，用一次性接種環(huán)蘸取少量培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色，觀察染色特性及菌體形態(tài)。

1.2.3 菌株DNA的提取

采用熱裂解法提取菌株DNA，用槍頭挑取菌株TSA培養(yǎng)物加入到含100 μL無(wú)菌去離子水的離心管中，反復(fù)吹打，沸水浴10 min后立即放入-20 ℃冰箱冷凍5 min，然后放入高速離心機(jī)12 000 r/min 離心1 min，上清液即為PCR擴(kuò)增用DNA模板。

1.2.4 菌株16S rDNA鑒定

PCR擴(kuò)增用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：10×Ex Buffer 5 μL，dNTP(2.5 μmol/L)4 μL，引物27F(10 μmol/L)1 μL，引物1492R(10 μmol/L)1 μL，ExTaq酶(5 U/μL)0.25 μL，DNA模板2 μL，補(bǔ)加無(wú)菌去離子水至50 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物送交中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。將序列提交到http://www.ezbiocloud.net/identify進(jìn)行序列比對(duì)，用Mega 7.0軟件分析序列的同源性，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.5 菌株Biolog鑒定

挑取活化的菌株TSA平板上的單菌落劃線接種BUG培養(yǎng)基(含5%脫纖綿羊血)過(guò)夜培養(yǎng)，用無(wú)菌棉拭子蘸取單菌落加入到接種液A中，調(diào)整濁度至96%，用移液器將菌懸液加入Gen Ⅲ鑒定板中，每孔100 μL，放入濕盒中，置于36 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后，用Biolog微生物鑒定儀讀取結(jié)果。

1.2.6 菌株莢膜多重PCR分型

莢膜分型引物合成參考文獻(xiàn)[3]，多殺性巴氏桿菌A、B、D、E、F血清型特異性基因片段hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ、fcbD引物序列見(jiàn)表1。取菌株DNA 模板2 μL加入到如下50 μL反應(yīng)體系中：10×ExBuffer 5 μL，dNTP(2.5 μmol/L)4 μL，上游引物(10 μmol/L)各2 μL，下游引物(10 μmol/L)各2 μL，ExTaq酶(5 U/μL)0.5 μL，補(bǔ)加無(wú)菌去離子水至50 μL，置于PCR儀中依照下述參數(shù)擴(kuò)增：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min，擴(kuò)增PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)[4]。

表1 多殺性巴氏桿菌莢膜分型引物

莢膜分型基因引物序列(5'→3')擴(kuò)增片段大小/bpAhyaD-hyaCTGCCAAAATCGCAGTCAGTTGCCATCATTGTCAGTG1 044BbcbDCATTTATCCAAGCTCCACCGCCCGAGGTTTCAATCC760DdcbFTTACAAAAGAAAGACTAGGAGCCCCATCTACCCACTCAACCATATCAG657EecbJTCCGCAGAAAATTATTGACTCGCTTGCTGCTTGATTTTGTG511FfcbDAATCGGAGAACGCAGAAATCAGTTCCGCCGTCAATTACTCTG851

1.2.7 菌株脂多糖多重PCR分型

引物合成參考文獻(xiàn)[5]，多殺性巴氏桿菌脂多糖外核編碼基因簇引物序列見(jiàn)表2。取菌株DNA模板2 μL加入到如下50 μL反應(yīng)體系中：10×Ex Buffer 5 μL，dNTP(2.5 μmol/L)4 μL，上游引物(10 μmol/L)各2 μL，下游引物(10 μmol/L)各2 μL，ExTaq酶(5 U/μL)0.5 μL，補(bǔ)加無(wú)菌去離子水至50 μL。置于PCR儀中依照下述參數(shù)擴(kuò)增：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表2 多殺性巴氏桿菌脂多糖分型引物

基因型基因引物序列(5'→3')擴(kuò)增片段大小/bpL1pcgDACATTCCAGATAATACACCCGpcgBATTGGAGCACCTAGTAACCC1 307L2nctACTTAAAGTAACACTCGCTATTGCnctATTTGATTTCCCTTGGGATAGC810L3gatGTCCTTATCTGACATTGAAATCGgatGCTAGACATCTGGTGGTTGCG415L4latBTTTCCATAGATTAGCAATGCCGlatBCTTTATTTGGTCTTTATATATACC550L5rmlAAGATTGCATGGCGAAATGGCrmlCCAATCCTCGTAAGACCCCC1 175L6nctBTCTTTATAATTATACTCTCCCAAGGnctBAATGAAGGTTTAAAAGAGATAGCTGGAG668L7ppgBCCTATATTTATATCTCCTCCCCppgBCTAATATATAAACCATCCAACGC931L8natGGAGAGTTACAAAAATGATCGGCnatGTCCTGGTTCATATATAGGTAGG255

1.2.8 多位點(diǎn)序列分型

根據(jù)文獻(xiàn)[6]建立的禽源多殺性巴氏桿菌RIRDC MLST 分型方法，對(duì)分離株的7個(gè)看家基因：腺苷酸環(huán)化酶基因(adk)、酯酶基因(est)、6-磷酸-甘露糖異構(gòu)酶基因(pmi)、葡萄糖-6磷酸脫氫酶基因(zwf)、蘋(píng)果酸脫氫酶基因(mdh)、谷氨酸脫氫酶基因(gdh)、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶基因(pgi)進(jìn)行擴(kuò)增及測(cè)序，引物序列見(jiàn)表3。所獲序列經(jīng)MEGA 7.0軟件編輯后，提交到RIRDC MLST在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)(https://pubmlst.org/pmultocida/)，獲得菌株的序列型。

1.2.9 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

取菌株馬丁肉湯過(guò)夜培養(yǎng)物稀釋制備菌懸液，肌肉注射78和114日齡SPF雞，連續(xù)觀察2 d，記錄發(fā)病和死亡情況，并對(duì)死雞進(jìn)行細(xì)菌分離，按1.2.1～1.2.8進(jìn)行鑒定。

表3 多殺性巴氏桿菌MLST的引物

基因引物序列(5'-3')擴(kuò)增片段大小/bpadkTTTTTCGTCCCGTCTAAG CGGGGAAAGGGACACAAGC570estGGGGAAAGGGACACAAGCCCAAATTCTTGGTTGGTTGG641pmiTGCCTTGAGACAGGGTAAGCGCCTTAACAAGTCCCATTCG739zwf-1AATCGGTCGTTTGACTGAGCTGCTTCACCTTCAACTGTGC808mdhATTTCGGGATCAGGGTTAGCGGAAAACCGGTAATGGAAGG620gdhATCGACTTCTTCCGCAGACCGCGGGTGATATTGGTGTAGG702pgiACCACGCTATTTTTGGTTGCATGGCACAACCTCTTTCACC784

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀和剖檢變化

發(fā)病雞場(chǎng)病死率約為30%，患病雞羽毛粗亂、精神沉郁、食欲減退、呼吸困難、腹瀉、體溫升高，臨死前部分雞出現(xiàn)發(fā)紺。隨機(jī)對(duì)20只患病雞進(jìn)行剖檢，20/20可見(jiàn)心包積有淡黃色液體并混有纖維素；19/20肺臟淤血水腫，可見(jiàn)散在分布的針尖狀灰白色壞死點(diǎn)，表面有大量白色滲出物，呈肺炎癥狀；16/20肝臟腫大，呈棕紅色，表面分布針尖大小灰白色、邊緣整齊、大小一致的壞死點(diǎn)；20/20十二指腸出血。

2.2 菌落形態(tài)及培養(yǎng)特性

按照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 541-2016，從患病雞體內(nèi)分離獲得1株純培養(yǎng)物，命名為G-2株。菌株G-2在TSA培養(yǎng)基上形成邊緣圓潤(rùn)整齊，表面光滑，乳白色半透明菌落。革蘭染色為陰性球桿菌。

2.3 16S rDNA鑒定

菌株16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，大小約為1 500 bp(圖1)。將16S rDNA序列提交到http://www.ezbiocloud.net/identify進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果與多殺性巴氏桿菌殺禽亞種模式菌株NCTC10204的相似性最高，為100.00%；與多殺性巴氏桿菌多殺亞種模式菌株ATCC 43137的相似性為99.93；與多殺性巴氏桿菌敗血亞種模式菌株NCTC 11995的相似性為98.56%。選取相似性大于97%的菌株16S rDNA序列，用Mega 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(NJ法)，以貓嗜血桿菌ATCC 49733為外源，菌株G-2與多殺性巴氏桿菌殺禽亞種NCTC 10204在同一分支(圖2)。

M.DL2000 DNA Maker；1. 陰性對(duì)照；2. 菌株G-2

圖1 菌株G-2 16S rDNA PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.4 Biolog鑒定

菌株培養(yǎng)18 h后，通過(guò)Biolog鑒定儀讀取結(jié)果，菌株G-2與多殺性巴氏桿菌殺禽亞種具有良好的匹配性，可能性為0.899，相似性為0.722，位距為3.451，鑒定結(jié)果為多殺性巴氏桿菌殺禽亞種。

圖2 菌株G-2 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.5 莢膜分型

菌株G-2擴(kuò)增出了與陽(yáng)性對(duì)照CVCC 390大小一致的片段，約為1 044 bp(圖3)，為多殺性巴氏桿菌莢膜A型特異性片段，判定菌株G-2為莢膜A型。

2.6 脂多糖多重PCR

菌株G-2擴(kuò)增出1 307 bp左右的片段(圖4)，為脂多糖L1型特異性片段，判定菌株為脂多糖L1型。

M. DL2000 Maker；1. 陰性對(duì)照；2. 陽(yáng)性對(duì)照CVCC 390；3. G-2

圖3 菌株G-2莢膜分型PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

M. DL2000 Maker；1. G-2; 2. 陰性對(duì)照

圖4 菌株G-2脂多糖多重PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.7 MLST分型

對(duì)多殺性巴氏桿菌G-2株分別進(jìn)行adk、est、pmi、zwf、mdh、gdh和pgi7個(gè)看家基因的擴(kuò)增和測(cè)序，將序列在線提交到RIRDC MLST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，得到各個(gè)基因的等位基因編號(hào)，所有等位基因的編號(hào)組成菌株的序列型，結(jié)果顯示G-2株為ST129型。

2.8 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

將菌株TSB過(guò)夜培養(yǎng)物稀釋成不同的濃度，肌肉注射78日齡和114日齡SPF雞，每個(gè)稀釋度注射2只，連續(xù)觀察2 d。動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果表明：78日齡SPF雞注射7、10、13、17和20個(gè)CFU在1 d內(nèi)引起全部雞死亡，114日齡SPF雞注射10、13和17個(gè)CFU在2 d內(nèi)引起全部雞死亡；臨床癥狀表現(xiàn)為羽毛粗亂、精神沉郁、厭食、呼吸困難、腹瀉、發(fā)熱，臨死前部分雞出現(xiàn)發(fā)紺。剖檢死亡雞發(fā)現(xiàn)心包積液、肺腫病變、肝臟壞死點(diǎn)、十二指腸出血，采集死亡雞只的肝臟和心血進(jìn)行分離，獲得菌落形態(tài)一致的菌株，經(jīng)鑒定為多殺性巴氏桿菌殺禽亞種。

3 討論

禽霍亂是由多殺性巴氏桿菌引起的雞和火雞等禽類(lèi)的一種接觸性傳染病，多為散發(fā)，3～4月齡育成雞、成年雞易發(fā)。禽霍亂造成成雞的死亡通常發(fā)生于產(chǎn)蛋雞群，其發(fā)病率和死亡率高，給養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展和公共衛(wèi)生造成嚴(yán)重威脅[7]。為避免經(jīng)濟(jì)損失，疫苗預(yù)防接種是比較經(jīng)濟(jì)安全的方式。同時(shí)養(yǎng)禽場(chǎng)應(yīng)建立必要的飼養(yǎng)管理和衛(wèi)生防疫制度，特別是在引種時(shí)要嚴(yán)格檢疫，防止疫病的傳入。一旦發(fā)生疫情，應(yīng)及時(shí)采取隔離、消毒等防治措施。

本研究對(duì)從湖南禽霍亂雞體內(nèi)分離到的1株病原菌，通過(guò)菌落形態(tài)、染色特性、16S rDNA 和Biolog鑒定，確認(rèn)該菌株為多殺性巴氏桿菌殺禽亞種。采用莢膜多重PCR分型、脂多糖多重PCR分型和多位點(diǎn)序列分型對(duì)其基因型進(jìn)行了鑒定，該菌株為莢膜A型、脂多糖L1型、ST129型。這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[8-10]。目前我國(guó)禽源多殺性巴氏桿菌的莢膜型以A型為主，多位點(diǎn)序列分型以ST129型為主。動(dòng)物回歸試驗(yàn)證實(shí)該菌株能引起SPF雞典型的禽霍亂癥狀，肌肉注射7 CFU活菌可致死78日齡SPF雞，10 CFU活菌可致死114日齡SPF雞。結(jié)合臨床癥狀和剖檢變化，可以確診為禽霍亂。該疫病的準(zhǔn)確和快速確診，可以為后續(xù)預(yù)防提供技術(shù)依據(jù)，同時(shí)為養(yǎng)殖場(chǎng)制定免疫程序提供參考。