間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體對(duì)視網(wǎng)膜新生血管影響的研究進(jìn)展

楊曉英，徐國興

0引言

視網(wǎng)膜新生血管疾病屬于全球范圍內(nèi)視力喪失的常見疾病[1]，目前視網(wǎng)膜血管疾病藥物治療的最新進(jìn)展包括玻璃體內(nèi)應(yīng)用緩釋類固醇治療黃斑水腫和眼內(nèi)注射血管內(nèi)皮生長因子抗體及干細(xì)胞移植等，以消退眼內(nèi)新生血管形成。干細(xì)胞由于制備方便、可高效擴(kuò)增、具有免疫調(diào)節(jié)和組織修復(fù)能力等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為一線臨床治療的潛在方案。干細(xì)胞治療盡管潛力極大，但也存在較多問題，如移植細(xì)胞的低生存力、先天異質(zhì)性等。最近有報(bào)道稱，來源于間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的外泌體具有與MSCs相似的功能，外泌體包裹的抗炎藥物可以從鼻孔運(yùn)輸?shù)酱竽X以治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)炎癥性疾病[2]。以類似的方式，眼外注射外泌體使它們從眼球下空間快速遞送到脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜中。因此，眼外注射外泌體成為一種安全的給藥途徑，為治療視網(wǎng)膜新生血管疾病提供新的治療思路[3]。

1 MSCs衍生的外泌體

1.1 MSCs衍生的外泌體概述MSCs是一群自我更新和分化的多能前體細(xì)胞，在特定條件下具有分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肌細(xì)胞等的能力[4]。MSCs可以常規(guī)從自體或同種異體組織中獲得[5]。MSCs不僅可以通過自我增殖和分化取代受損組織，還可以通過旁分泌調(diào)節(jié)作用，作為重要的微環(huán)境調(diào)節(jié)劑來改變受損組織的微環(huán)境。由于獲得方便，免疫原性低，無倫理爭議和可分泌營養(yǎng)因子等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是治療和移植的重要資源[6]。盡管具有如此潛在的治療應(yīng)用前景，但是仍面臨一些技術(shù)障礙，如移植細(xì)胞的低生存力，先天異質(zhì)性，與供體衰老有關(guān)的不明因素和潛在的致瘤性等[7]。目前，多項(xiàng)研究報(bào)道，來源于MSCs的外泌體具有與MSCs相似的功能，包括修復(fù)受損組織，抑制炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等。外泌體是一種可從許多不同類型的細(xì)胞分離的直徑約100(30～120)nm的細(xì)胞外囊泡(EV)[8]。EV是由脂質(zhì)雙層包圍的天然納米顆粒，受微環(huán)境影響而釋放。EV將其膜信號(hào)或親本細(xì)胞的內(nèi)部內(nèi)容物(包括核酸、脂質(zhì)、線粒體和蛋白質(zhì))傳遞到靶細(xì)胞中，從而導(dǎo)致靶細(xì)胞發(fā)生的生理變化[9-10]。與MSCs相比，間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體(MSCs-Exo)具有穩(wěn)定性好，易保存，無免疫原性，易于獲取，轉(zhuǎn)化方便等優(yōu)點(diǎn)，由于尺寸較小，外泌體可以很容易地穿過生物屏障并進(jìn)入靶器官[8]。因此，它為許多疾病的治療提供了一種新方法。

1.2 MSCs衍生的外泌體來源和組成

1.2.1 MSCs衍生的外泌體的來源外泌體最初是在1983年發(fā)現(xiàn)的，以前認(rèn)為它只是浪費(fèi)細(xì)胞。然而，研究人員發(fā)現(xiàn)，這種微小的膜囊泡中存在細(xì)胞的各種復(fù)雜成分。例如，一些具有特定功能的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)組分分布在囊泡[11-12]的表面上。外泌體中的蛋白質(zhì)可分為兩類：第一種是廣譜蛋白質(zhì)，其與外泌體的生物起源和功能相關(guān)，例如抗原結(jié)合蛋白。第二種是特異性蛋白質(zhì)，其呈現(xiàn)特定的細(xì)胞功能。具有不同來源的外泌體的生理功能是多種多樣的。外泌體將重要的生物分子(如受體和配體)轉(zhuǎn)運(yùn)到靶細(xì)胞，并反過來觸發(fā)這些生物分子的釋放。外泌體作為微環(huán)境的重要組成部分，是由大多數(shù)細(xì)胞分泌的膜囊泡，直徑為40～150nm。在各種活細(xì)胞和細(xì)胞膜的多囊體融合后，外泌體以胞吐作用的形式釋放到細(xì)胞外環(huán)境中[13-15]。

1.2.2 MSCs衍生的外泌體的組成研究表明，不同組織來源的MSCs有助于消除炎癥反應(yīng)和組織修復(fù)和再生，主要是通過細(xì)胞外囊泡依賴性旁分泌方式。細(xì)胞外囊泡可以基于直徑細(xì)分為3類：直徑在40～100nm之間的外泌體，直徑在100～1000nm之間的微泡和直徑在500～1000nm之間的凋亡小體。在許多情況下，“細(xì)胞外囊泡”被稱為外泌體和微泡的組合。外泌體通過內(nèi)體膜的向內(nèi)出芽產(chǎn)生的小膜囊泡(30～100nm)通過將復(fù)雜的生物信息[包括mRNA，微小RNA(miRNA)和可溶性蛋白質(zhì)]轉(zhuǎn)移到這些靶細(xì)胞中來調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的功能[16]。載于外泌體或微泡中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核苷酸和其他成分可以被運(yùn)輸?shù)绞荏w細(xì)胞并影響各種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)[17]。MSCs-Exo保留了其親本MSCs的一些特征，如免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)神經(jīng)突向外生長，促進(jìn)血管生成[18]，以及修復(fù)受損組織的能力。

2 MSCs衍生的外泌體的功能

2.1修復(fù)受損組織先前的研究表明，不同來源的MSCs，包括人臍帶血、骨髓、胚胎和胎膜等，可用于組織修復(fù)。Ding等[19]研究去鐵胺刺激人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體通過促進(jìn)血管新生而促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制，研究表明MSCs衍生的外泌體通過PI3K/AKT途徑誘導(dǎo)血管化，促進(jìn)糖尿病皮膚創(chuàng)傷動(dòng)物模型的皮膚創(chuàng)傷恢復(fù)。去鐵胺可能導(dǎo)致外泌體被觸發(fā)，以便在無細(xì)胞治療應(yīng)用中顯示出增強(qiáng)的血管生成潛能。Kim等[20]研究從人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體刺激人皮膚的再生機(jī)制，發(fā)現(xiàn)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體具有多種與皮膚修復(fù)有關(guān)的生長因子。經(jīng)局部處理后，能促進(jìn)人皮膚Ⅰ型膠原和彈性蛋白的產(chǎn)生，降低人皮膚中MMP-1的生成。體外結(jié)果顯示，人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體集成在人真皮成纖維細(xì)胞(HDFS)中，從而促進(jìn)HDFS細(xì)胞遷移和膠原合成，對(duì)人類皮膚的創(chuàng)面修復(fù)有重要意義。

2.2抑制炎癥反應(yīng)MSCs衍生的外泌體不僅可促進(jìn)血管生成，修復(fù)受損相關(guān)組織，還具有抗炎作用。Sun等[21]研究人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體通過減輕炎癥反應(yīng)促進(jìn)脊髓損傷小鼠功能的恢復(fù)，通過制備了人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體，對(duì)脊髓損傷小鼠行尾靜脈注射。結(jié)果表明，來源于hucmsc的外泌體能有效觸發(fā)巨噬細(xì)胞從m1向m2表型的極化，并顯著降低促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IFN-γ、g-csf、mcp-1和mip-1α水平，同時(shí)增加抗炎細(xì)胞因子水平，對(duì)脊髓損傷后的功能恢復(fù)有明顯的促進(jìn)作用。

2.3調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)外泌體通過使用多個(gè)來向所有類型的免疫細(xì)胞明顯地向T淋巴細(xì)胞傳遞消極信息機(jī)制。例如，已經(jīng)顯示來自MSCs和腫瘤來源的外泌體可以抑制淋巴細(xì)胞的增殖。以前顯示由乳腺癌釋放的外泌體可直接抑制CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞[22]。類似地，來自人類脂肪組織的MSCs衍生的外泌體證明了這一點(diǎn)有可能減少T細(xì)胞增殖。另外由外泌體實(shí)施的機(jī)制是通過誘導(dǎo)免疫效應(yīng)細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡。微泡或外泌體已發(fā)現(xiàn)在其表面上表達(dá)FASL和TRAIL以包括淋巴細(xì)胞為靶向[23-25]。抑制炎性細(xì)胞因子如IFN-γ和IL-17的產(chǎn)生是MSCs衍生的外泌體用于抑制免疫應(yīng)答的另一種機(jī)制[26]。

2.4外泌體在多種疾病中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用Ono等[27]發(fā)現(xiàn)miR-23b在BM2細(xì)胞處理后上調(diào)MSCs-Exo，從而通過抑制靶基因MARCKS誘導(dǎo)休眠。抑制的MARCKS最終促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞的休眠。Huang等[28]表明MSCs-Exo參與心臟和血管，發(fā)揮抗凋亡，心臟再生，抗心臟重塑，抗炎，新血管形成和抗血管重塑的作用。最近對(duì)在低氧，無血清條件下培養(yǎng)的人MSCs衍生的外泌體的全面蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，這些外泌體表達(dá)涉及血管生成的多種因子，包括與核因子κB(NFκB)，血小板衍生生長因子相關(guān)的信號(hào)蛋白表皮生長因子(EGF)和成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)等。此外，它被認(rèn)為是MSCs移植治療的一種新的潛在分子機(jī)制[29]?？傊?，外泌體和多種疾病之間存在密切關(guān)系。然而，視網(wǎng)膜新生血管疾病在外泌體的研究則相對(duì)有限。

2.5外泌體在視網(wǎng)膜新生血管疾病的最新進(jìn)展Hajrasouliha等[3]研究來自視網(wǎng)膜星形膠質(zhì)細(xì)胞的外泌體抑制激光誘導(dǎo)的脈絡(luò)膜新生血管的抗血管生成的機(jī)制，通過構(gòu)建激光誘導(dǎo)的CNV模型，將外泌體注射入小鼠玻璃體腔內(nèi)，發(fā)現(xiàn)來自視網(wǎng)膜星形膠質(zhì)細(xì)胞的外泌體含有多種抑制激光誘導(dǎo)的脈絡(luò)膜新生血管形成的抗血管生成成分。說明視網(wǎng)膜星形膠質(zhì)細(xì)胞外泌體具有治療脈絡(luò)膜新生血管的臨床應(yīng)用潛力，可用作幾種疾病的輔助療法，包括滲出性年齡相關(guān)性黃斑變性(ARMD)，增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病和與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的血管生成等。He等[8]通過從人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞中成功分離外泌體，與RPE細(xì)胞共培養(yǎng)，并構(gòu)建暴露于藍(lán)光下激光誘發(fā)視網(wǎng)膜損傷小鼠模型，于小鼠玻璃體內(nèi)注射不同劑量外泌體，觀察并比較它們?cè)诩す庹T發(fā)視網(wǎng)膜損傷小鼠模型中的作用，發(fā)現(xiàn)MSCs衍生的外泌體通過下調(diào)VEGF-A改善RPE細(xì)胞中的藍(lán)光刺激和激光誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷。推測MSCs-Exo可能是玻璃體內(nèi)注射的最佳候選者，可能克服潛在干細(xì)胞移植治療相關(guān)的障礙和風(fēng)險(xiǎn)，如長期病理分化、保存不良等。Moisseiev等[30]通過成功構(gòu)建OIR模型，于玻璃體腔內(nèi)注射外泌體，發(fā)現(xiàn)通過低氧、無血清條件下從間充質(zhì)干細(xì)胞分離的外泌體注射入OIR小鼠眼內(nèi)能較好耐受，對(duì)視網(wǎng)膜缺血有保護(hù)作用，且無免疫及炎癥反應(yīng)發(fā)生。外泌體治療后視網(wǎng)膜缺血程度和新生血管發(fā)展減少。說明外泌體可作為一種新的非細(xì)胞治療方式。

3展望

MSCs-Exo具有免疫調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)神經(jīng)軸突向外生長，促進(jìn)血管生成以及修復(fù)受損組織等能力，且更加安全穩(wěn)定，在視網(wǎng)膜新生血管疾病應(yīng)用方面具有廣闊前景。但外泌體的研究尚處于實(shí)驗(yàn)階段，仍需在與人眼更加相似的大型動(dòng)物眼內(nèi)進(jìn)行模擬，從而檢測安全性及更好地理解MSCs-Exo作用，并且能夠應(yīng)用于臨床之前時(shí)還需研究遠(yuǎn)期劑量問題。相信隨著研究的深入，外泌體療法會(huì)為視網(wǎng)膜新生血管疾病患者提供新的希望。