玻璃體腔注射TA對光化學(xué)誘導(dǎo)大鼠BRVO模型血管生成及Notch通路的影響

韓莎莎, 張賀鵬, 李躍峰

0引言

視網(wǎng)膜靜脈阻塞(retinal vein occlusion，RVO)是視網(wǎng)膜血管病變造成的眼部血管病，影響視力，嚴(yán)重時(shí)使患者失明[1]，視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞(branch retinal vein occlusion，BRVO)是其中一種類型，可通過治療緩解癥狀。曲安奈德(triamcinolone acetonide，TA)屬于腎上腺皮質(zhì)激素類藥物，因抗炎和抗過敏作用強(qiáng)且時(shí)間久在眼科疾病中應(yīng)用廣泛，可減少BRVO患者眼內(nèi)新生血管生成[2]，但具體作用機(jī)制尚不明確。新生血管受多種基因調(diào)控，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是作用最強(qiáng)、特異性最高的血管生長因子之一，幾乎參與血管形成的所有步驟[3]；Notch信號通路在血管生成中的作用已明確，可促進(jìn)血管生成[4]，能促進(jìn)VEGF激活從而發(fā)揮促血管生成作用等[5]。本研究通過構(gòu)建化學(xué)誘導(dǎo)大鼠BRVO模型，觀察TA對BRVO大鼠的新生血管的抑制作用并探討其作用機(jī)制，旨在揭示其抑制血管新生的分子機(jī)制。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物雄性SD大鼠購自廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SYXK(粵)2016-0158，體質(zhì)量200～230g，SPF級。所有大鼠均飼養(yǎng)于溫度23℃±2℃、濕度50%±10%，光照/黑暗12h/12h環(huán)境中，均自由飲水飲食。所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)本院動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2試劑與儀器眼內(nèi)灌注液(美國Alcon，進(jìn)口注冊標(biāo)準(zhǔn)：YZB/USA 0661)，孟加拉紅鈉鹽(上海北諾生物科技有限公司，貨號：330000-1G)，戊巴比妥鈉緩沖液(吉林省神經(jīng)精神病醫(yī)院制藥廠，國藥準(zhǔn)字：H1400546)，40mg/mL TA注射液(昆明積大制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字：H53021604)，熒光素鈉注射液(廣州白云山明興制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字：H44023401)，勻漿緩沖液(上海谷研實(shí)業(yè)有限公司，貨號：GOY-0993)，一抗VEGF、血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGF receptor 2，VEGFR2)、Notch1、Jagged1、DLL4、GADPH，二抗羊抗兔、羊抗鼠(英國abcam)。

眼科裂隙燈顯微鏡(意大利CSO，型號：SL990/SL980)，Tonolab系眼壓計(jì)(上海玉研科學(xué)儀器有限公司，型號：iCare Tonnlab)，眼底熒光造影儀(日本Canon、型號：CF-60UD)、光學(xué)相干斷層掃描儀(日本Topcon，型號：3D OCT-1 Maestro)、蛋白印記(Western Blot，WB)曝光儀(上海天能科技有限公司，型號：Tanon4600)。

1.2方法

1.2.1制備光化學(xué)誘導(dǎo)BRVO大鼠模型實(shí)驗(yàn)前對所有大鼠眼科裂隙燈顯微鏡下檢查眼部，未發(fā)現(xiàn)異常。60只大鼠參照文獻(xiàn)中方法右眼單眼構(gòu)建BRVO模型[6-7]。實(shí)驗(yàn)前用眼內(nèi)灌注液配置好質(zhì)量濃度為50mg/mL的孟加拉紅鈉鹽，4℃避光保存?zhèn)溆?。術(shù)前用2.5%戊巴比妥鈉緩沖液45mg/kg腹腔注射麻醉并擴(kuò)瞳。尾靜脈注射孟加拉紅鈉鹽溶液50mg/kg，1min后放置角膜接觸三面鏡。顯微鏡下按照龍盤等[6]操作方法尋找視盤顳側(cè)第一個(gè)視網(wǎng)膜靜脈主干分叉，光凝波長647nm、功率360mW、光斑大小100μm、持續(xù)時(shí)間0.05s激光光凝，單點(diǎn)光凝20點(diǎn)。鏡下觀察血流中斷、形成靜脈血栓，完全阻塞3個(gè)視網(wǎng)膜分支靜脈即為造模成功。造模后4只死亡、3只白內(nèi)障、1只視網(wǎng)膜凹陷、4只視網(wǎng)膜脫落嚴(yán)重，造模成功48只做后續(xù)實(shí)驗(yàn)?？瞻讓φ战M14只大鼠注射同樣體積的眼內(nèi)灌注液處理。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組按隨機(jī)數(shù)字法分為BRVO模型組14只、TA組34只，TA組術(shù)后按參照文獻(xiàn)中方法給藥8μL TA[8]。30G針頭顳側(cè)角膜緣后0.5mm做一穿刺口，微量注射器從穿刺口垂直進(jìn)針約1.5mm，針尖可觀察到在玻璃體內(nèi)，緩慢注入8μL TA，顯微鑷子輕夾穿刺口片刻易于穿刺口閉合。TA組分別在玻璃體腔注射TA后1、7、21d進(jìn)行觀察。BRVO模型組和空白對照組按上述方法注入等體積、等滲眼內(nèi)灌注液，BRVO模型組在光凝后1d做對照實(shí)驗(yàn)，空白對照組同一天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

每組隨機(jī)選4只大鼠眼壓計(jì)測量眼壓狀況；眼底彩照、熒光素眼底血管造影(fundus fluorescein angiography，F(xiàn)FA)及光學(xué)相干斷層掃描(optical coherence tomography，OCT)觀察大鼠眼底血管情況?？瞻讓φ战M、BRVO組另外10只，TA組其余大鼠中TA注射1、7、21d選10只WB檢測血管生成相關(guān)因子VEGF、VEGFR2，Notch通路重要因子Notch1、Jagged1、DLL4蛋白表達(dá)情況。

1.2.3眼壓計(jì)測量眼壓狀況空白對照組、BRVO模型組、玻璃體腔注射TA后1、7、21d組分別在早上9∶00按1.2.1方法麻醉大鼠，麻醉10min后眼壓計(jì)測每只大鼠右眼眼壓，每只眼睛測量3次，取平均值。

1.2.4 FFA及OCT檢測大鼠眼底血管情況各組大鼠檢測眼壓后散瞳，10% 2mL/kg熒光素鈉注射液腹腔注射，待熒光素鈉循環(huán)至眼底，眼底熒光造影儀按規(guī)范操作以視盤和激光光凝點(diǎn)為中心對大鼠右眼行FFA檢查；FFA檢查后行OCT檢查，之后再行眼底照相。測量損傷處視網(wǎng)膜及損傷250μm處視網(wǎng)膜厚度，由兩位操作熟練的工作人員測量和分析結(jié)果，取兩位測量人員測量平均值為損傷處視網(wǎng)膜和損傷250μm處視網(wǎng)膜厚度。

圖1 各組大鼠眼底照相觀察視網(wǎng)膜情況比較 A:空白對照組;B:BRVO模型組;C:玻璃體腔注射TA后1d組;D:玻璃體腔注射TA后7d組;E:玻璃體腔注射TA后21d組。白色箭頭:視網(wǎng)膜變白；黑色箭頭:視盤凹消失；黃色箭頭:視網(wǎng)膜血管收縮；藍(lán)色箭頭:血管擴(kuò)張和彎曲。

圖2 各組大鼠FFA情況比較 A:空白對照組;B:BRVO模型組;C:玻璃體腔注射TA后1d組;D:玻璃體腔注射TA后7d組;E:玻璃體腔注射TA后21d組。黑色箭頭：熒光滲漏；白色箭頭：血管擴(kuò)張和彎曲；矩形：血管阻塞。

1.2.5 WB檢測大鼠視網(wǎng)膜VEGF、VEGFR2、Notch1、Jagged1、DLL4蛋白表達(dá)情況各組選取10只大鼠快速處死，解剖顯微鏡下摘取大鼠右眼視網(wǎng)膜，WB檢測大鼠視網(wǎng)膜VEGF、VEGFR2、Notch1、Jagged1、DLL4蛋白表達(dá)情況。-80℃冰箱保存待用。

冰箱中取出視網(wǎng)膜，每個(gè)組織加100μL勻漿緩沖液，冰上勻漿，低溫離心機(jī)4℃、10000r/min離心15min，取上清放入新的離心管中測總蛋白。每孔總蛋白上樣量20μL，經(jīng)SDS-凝膠電泳分離后，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，3%牛血清白蛋白稀釋VEGF、VEGFR2、Notch1、Jagged1、DLL4、GADPH，一抗4℃孵育過夜；加入對應(yīng)二抗室溫孵育1h。WB曝光儀檢測目標(biāo)蛋白信號并分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，先采用單因素方差分析各組間總體比較，若存在差異則使用Dunnett-t檢驗(yàn)行組間兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)比較各組大鼠眼壓比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.3817,P=0.025)。各組大鼠損傷處視網(wǎng)膜厚度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.292,P=0.007)。各組大鼠損傷250μm處視網(wǎng)膜厚度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.982,P<0.001)。各組大鼠VEGF蛋白含量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=73.272,P<0.001)。各組大鼠VEGFR2蛋白含量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=23.636,P<0.001), 見表1。

2.2各組大鼠眼底照相情況比較空白對照組眼底血管排列整齊、狀態(tài)清晰。BRVO模型組眼底出現(xiàn)水腫，視網(wǎng)膜變白，血管排列紊亂，并伴隨有視盤凹消失、視網(wǎng)膜血管收縮癥狀。玻璃體腔注射TA后1d組水腫減輕，視網(wǎng)膜蒼白減少，出現(xiàn)血管擴(kuò)張和彎曲，視網(wǎng)膜血管紊亂。玻璃體腔注射TA后7d組視網(wǎng)膜變白加重，血管擴(kuò)張和彎曲現(xiàn)象嚴(yán)重。玻璃體腔注射TA后21d組血管彎曲減輕、視網(wǎng)膜變白消失，視盤凹恢復(fù)，見圖1。

2.3各組大鼠FFA情況比較正常組視網(wǎng)膜熒光在血管中均勻分布。BRVO模型組視網(wǎng)膜血管熒光素滲漏明顯。玻璃體腔注射TA后1d組未觀察到熒光滲漏情況，但血管擴(kuò)張彎曲嚴(yán)重、血管部分血管熒光不完整。玻璃體腔注射TA后7、21d組無熒光現(xiàn)象，血管彎曲現(xiàn)象逐漸緩解，見圖2。

2.4各組大鼠OCT檢查比較與正常對照組相比，BRVO模型組損傷處視網(wǎng)膜、損傷250μm處視網(wǎng)膜厚度增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.050、0.016)。與BRVO模型組相比，玻璃體腔注射TA后1d組損傷250μm處視網(wǎng)膜厚度減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.048)；玻璃體腔注射TA后7、21d組損傷處視網(wǎng)膜、損傷250μm處視網(wǎng)膜厚度均減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1，圖3。

2.5各組大鼠視網(wǎng)膜血管生成相關(guān)因子VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)情況與空白對照組相比，BRVO模型組VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與BRVO模型組相比，玻璃體腔注射TA后1、7d組VEGFR2蛋白表達(dá)降低，玻璃體腔注射TA后21d組VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1，圖4。

2.6各組大鼠視網(wǎng)膜Notch通路重要因子Notch1、Jagged1、DLL4蛋白表達(dá)情況與空白對照組相比，BRVO模型組Notch1、Jagged1蛋白表達(dá)升高，DLL4蛋白表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與BRVO模型組相比，玻璃體腔注射TA后1、7、21d組Notch1、Jagged1蛋白表達(dá)降低，玻璃體腔注射TA后TA7、21d組DLL4蛋白表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2,圖5。

李夏[16]針對真空碳熱還原法提鋅進(jìn)行了研究。先采用真空碳熱還原法提取鋅，得到含鋅、氯化鈉、氯化鉀及部分微量金屬的冷凝物；再經(jīng)過水洗去除冷凝物中的氯化鈉、氯化鉀；隨后采用真空蒸餾法去除鉛、鋁等微量金屬元素，得到含碳和鋅的成分，利用熔析法去除碳，得到鋅；最后，真空控氧法得到納米氧化鋅。該方法較為新穎，但真空碳還原的要求較高，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

圖3 各組大鼠OCT檢查比較 A:空白對照組;B:BRVO模型組;C:玻璃體腔注射TA后1d組;D:玻璃體腔注射TA后7d組;E:玻璃體腔注射TA后21d組。

組別眼壓(n=4,mmHg)損傷處視網(wǎng)膜厚度(n=4,μm)損傷250μm處視網(wǎng)膜厚度(n=4,μm)VEGF(n=10)VEGFR2(n=10)空白對照組17.58±0.85186.88±51.56191.52±16.320.04±0.020.39±0.13BRVO模型組23.85±3.66a286.77±63.22a245.53±27.88a0.76±0.21a0.56±0.09a玻璃體腔注射TA后1d組25.63±5.62217.85±69.37208.17±11.52c0.81±0.130.47±0.08c玻璃體腔注射TA后7d組21.56±3.57110.88±57.34c167.56±16.41c0.68±0.120.35±0.11c玻璃體腔注射TA后21d組18.81±0.86c156.23±42.56c186.68±11.56c0.21±0.09c0.17±0.04c F3.38175.29210.98273.27223.636P0.0250.007<0.001<0.001<0.001

注：aP<0.05vs空白對照組；cP<0.05vsBRVO模型組。

圖4 各組大鼠視網(wǎng)膜VEGF、VEGFR2表達(dá)情況。

圖5 各組大鼠視網(wǎng)膜Notch通路重要因子Notch1、Jagged1、DLL4蛋白表達(dá)情況。

3討論

RVO屬常見的眼底血管病，臨床表現(xiàn)為視網(wǎng)膜血液瘀滯、靜脈迂曲擴(kuò)張、視網(wǎng)膜出血和水腫等血管異常癥狀，會導(dǎo)致患者視力下降或部分視野缺陷，分為中央RVO和BRVO，且BRVO發(fā)病率高于中央RVO[9]。Khayat等[10]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜缺血會造成視力喪失、增加新血管并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)BRVO模型組眼底彩照發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜變白，血管排列紊亂，視盤凹消失，視網(wǎng)膜血管收縮，F(xiàn)FA發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜血管熒光素滲漏明顯、出現(xiàn)血管不完整，阻塞現(xiàn)象，造模成功。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，BRVO模型組損傷處視網(wǎng)膜、損傷250μm處視網(wǎng)膜厚度增加，眼壓升高，BRVO使眼壓升高，視網(wǎng)膜受到損害，血管出現(xiàn)異常。玻璃體腔注射TA可緩解大鼠BRVO癥狀[11]，TA作為腎上腺皮質(zhì)激素類藥物，可減輕充血，降低毛細(xì)血管的通透性，在眼科疾病中應(yīng)用廣泛，可緩解BRVO引起的血管增生現(xiàn)象[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，與BRVO模型組相比，隨著時(shí)間延長，TA使視網(wǎng)膜水腫減輕、視網(wǎng)膜蒼白減少、血管擴(kuò)張和彎曲、視盤凹恢復(fù)，血管彎曲現(xiàn)象逐漸緩解，損傷處視網(wǎng)膜、損傷250μm處視網(wǎng)膜厚度降低，眼壓降低。提示TA可使眼底血管水腫、視網(wǎng)膜血管收縮現(xiàn)象逐漸好轉(zhuǎn)，可緩解視網(wǎng)膜及其250μm處視網(wǎng)膜損傷癥狀，可緩解BRVO帶來眼壓升高癥狀，對治療BRVO有一定的療效，但具體機(jī)制尚未清楚。

組別Notch1Jagged1DLL4空白對照組0.24±0.060.17±0.060.12±0.03BRVO模型組1.21±0.42a0.36±0.08a0.01±0.00a玻璃體腔注射TA后1d組0.68±0.21c0.16±0.04c0.02±0.01玻璃體腔注射TA后7d組0.63±0.19c0.13±0.02c0.11±0.02c玻璃體腔注射TA后21d組0.28±0.06c0.12±0.02c0.13±0.02cF28.95638.99293.611P<0.001<0.001<0.001

注：aP<0.05vs空白對照組；cP<0.05vsBRVO模型組。

VEGF是血管生成中最關(guān)鍵的血管生成刺激因子，幾乎參與所有生理和病理性血管生成過程，已被驗(yàn)證可以促進(jìn)血管生成[13]。VEGFR2是VEGF介導(dǎo)血管生成的主要受體，VEGF過表達(dá)可激活VEGFR2，激活后的VEGFR2可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂、促進(jìn)細(xì)胞增殖，進(jìn)而促進(jìn)血管生成[14]。臨床上抗VEGF注射聯(lián)合玻璃體切除的動靜脈鞘管切開術(shù)可用于治療BRVO[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，BRVO模型組VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)升高。與BRVO模型組相比，玻璃體腔注射TA后7d組VEGFR2蛋白表達(dá)降低，玻璃體腔注射TA后21d組VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)降低。提示BRVO可使促血管生成因子VEGF、VEGFR2表達(dá)量升高進(jìn)而促進(jìn)血管形成，加快BRVO疾病進(jìn)程；TA可降低促血管生成因子生成，緩解血管生成，從而治療BRVO。

Notch信號通路可使血管穩(wěn)定性加強(qiáng)、促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞分化以及促進(jìn)血管動靜脈分化，加速血管生成[16]。在信號通路中Notch1可促進(jìn)血管新生及血管發(fā)展，Jagged1和DLL4是Notch信號通路中兩個(gè)重要配體，在血管形成中存在平衡關(guān)系，起相反作用。Jagged1能促進(jìn)血管動脈化和促進(jìn)造血干細(xì)胞形成，可抑制DLL4的激活從而加強(qiáng)血管生成作用，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)可激活VEGF[17]。DLL4可抑制血管出芽過程中端細(xì)胞的形成從而抑制血管新生[18]。但是尚未發(fā)現(xiàn)Notch信號通路在BRVO中相關(guān)研究。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，BRVO模型組Notch1、Jagged1蛋白表達(dá)升高，DLL4蛋白表達(dá)降低，提示BRVO可能通過激活Notch信號通路，促進(jìn)血管動脈化和促進(jìn)造血干細(xì)胞形成、抑制端細(xì)胞形成、從而加速血管形成。與BRVO模型組相比，玻璃體腔注射TA后1、7、21d組Notch1、Jagged1蛋白表達(dá)降低，玻璃體腔注射TA后7、21d組DLL4蛋白表達(dá)升高，提示TA可緩解BRVO激活的Notch信號通路，減少血管動脈化和造血干細(xì)胞生成，促進(jìn)端細(xì)胞形成，抑制血管形成；同時(shí)抑制血管生成刺激因子VEGF的表達(dá)，使血管生成相關(guān)細(xì)胞的分裂、增殖受到抑制，進(jìn)而抑制血管形成，達(dá)到緩解BRVO疾病目的。

綜上所述，TA可能通過抑制Notch通路激活，抑制VEGF表達(dá)，減輕血管生成，實(shí)現(xiàn)對BRVO保護(hù)作用。本研究只對BRVO模型組光凝1d進(jìn)行了研究，沒有做后期對照研究，是本文不足之處，也是下一步研究重點(diǎn)；且深入探討Notch通路與VEGF的作用機(jī)制是下一步需要深入探討的內(nèi)容。