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    牛結(jié)核病污染場(chǎng)4 種檢測(cè)方法評(píng)估

    2020-06-08 11:23:30張建東陳永林馬宏偉劉天駒趙建東米吉提莫合他爾汗顏成旭路廣計(jì)張喜悅
    中國(guó)動(dòng)物檢疫 2020年6期
    關(guān)鍵詞:皮厚結(jié)核病敏感性

    張建東,陳永林,馬宏偉,劉天駒,張 濤,李 釗,趙建東,米吉提·莫合他爾汗,顏成旭,路廣計(jì),張喜悅

    (1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,山東泰安 271000;2.洛陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,河南洛陽(yáng) 471000;3.河北省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,河北石家莊 050000;4.石家莊市動(dòng)物疫病預(yù)防控住中心,河北石家莊 050000;5.濟(jì)源市動(dòng)物疫病控制中心,河南濟(jì)源 459000;6.新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所,新疆烏魯木齊 830000;7.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心,山東青島 266032)

    牛結(jié)核病(bovine tuberculosis,bTB)是由分枝桿菌屬牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis,M.bovis)引起的一種人獸共患慢性消耗性傳染性疾病,給我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重危害[1]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為須通報(bào)動(dòng)物疫病,我國(guó)將其列為二類(lèi)動(dòng)物疫病。牛分枝桿菌感染宿主廣泛,除可感染人外,還可感染50 多種哺乳動(dòng)物[2]。牛結(jié)核病目前尚無(wú)有效疫苗預(yù)防,藥物治療成本太高,所以“檢測(cè)+撲殺”是控制該疫病的主要手段。

    我國(guó)目前的牛結(jié)核病檢測(cè)方法主要包括,結(jié)核菌素(PPD)皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)(TST)、比較皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)(SICTT)、γ-干擾素ELISA試驗(yàn)(IFN-γ-ELISA)、抗體ELISA 試驗(yàn)和膠體金檢測(cè)等[3]。TST 是我國(guó)牛結(jié)核病檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),也是國(guó)際貿(mào)易指定方法。此方法靈敏度高,但特異性差,無(wú)法排除其他結(jié)核桿菌干擾。SICTT 與TST相比,可排除其他桿菌干擾,減少假陽(yáng)性。TST 和SICTT 檢測(cè)成本低,但操作麻煩、耗時(shí)長(zhǎng),結(jié)果判定主觀性強(qiáng)[4]。IFN-γ-ELISA 試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單,但成本較高[5]??贵wELISA是現(xiàn)代抗體檢測(cè)的主要方法,但牛分枝桿菌抗原表位復(fù)雜,不同階段可產(chǎn)生不同抗體,因而導(dǎo)致檢測(cè)陽(yáng)性率偏低[6]。

    結(jié)核病污染場(chǎng)內(nèi),牛分枝桿菌普遍存在,需要敏感性更高的檢測(cè)方法,來(lái)盡量避免漏檢,從而加快凈化進(jìn)程。本試驗(yàn)采用TST、SICTT、IFN-γ-ELISA 和抗體ELISA 4 種檢測(cè)方法,同時(shí)對(duì)牛結(jié)核病污染場(chǎng)的牛群進(jìn)行檢測(cè),比較分析不同試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果,以期為我國(guó)牛結(jié)核病污染場(chǎng)的凈化提供有效的檢測(cè)方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 試劑與儀器 牛PPD、禽PPD、INF-γ 夾心ELISA 檢測(cè)試劑盒(批次P201906-001),均購(gòu)自青島瑞爾公司;牛分枝桿菌ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒(批號(hào)190504),購(gòu)自韓國(guó)安世佳合有限責(zé)任公司。儀器包括:剪毛剪、0.5 mL 注射器、游標(biāo)卡尺、酶標(biāo)儀(包含450 nm 和620~650 nm 濾光片)、CO2培養(yǎng)箱、12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板、肝素鈉采血管、移液器及吸頭等。

    1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 某規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)的300頭泌乳牛。

    1.2 方法

    1.2.1 檢測(cè)方法

    1.2.1.1 TST 試驗(yàn) 按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)》(GB/T 18645—2002)的要求操作和結(jié)果判定:采用牛型PPD,劑量為2 000 IU,分別于注射前和注射后72 h 測(cè)量皮膚厚度,并計(jì)算皮厚差。皮厚差≥4.0 mm,為陽(yáng)性;2.0 mm ≤皮厚差<4.0 mm,為疑似;皮厚差<2.0 mm,為陰性。疑似牛于第1 次檢疫 60 d 后進(jìn)行復(fù)檢,仍為疑似時(shí),60 d 后再?gòu)?fù)檢,如仍為疑似,則判為陽(yáng)性。

    1.2.1.2 SICTT 試驗(yàn) 采用牛PPD 和禽PPD,在牛頸部左側(cè)分點(diǎn)皮內(nèi)注射,注射點(diǎn)間隔12~15 cm,72 h 后,觀察注射部位的炎性反應(yīng),并量取皮皺厚,根據(jù)皮皺厚增加值判定。牛型PPD 皮厚差減去禽型PPD 皮厚差>4 mm,判為陽(yáng)性;1 mm <牛型PPD 皮厚差減去禽型PPD 皮厚差≤4 mm,判為可疑;牛型PPD 皮厚差≤禽型PPD 皮厚差,判為陰性。

    1.2.1.3 IFN-γ-ELISA 試驗(yàn) 采集5 mL 血液肝素抗凝血液,各取1.5 mL 加入3 個(gè)孔中,然后分別取100 μL 的牛型PPD、禽型PPD 和陰性對(duì)照磷酸鹽緩沖液(PBS),加入抗凝全血中,混勻后放于含5% CO2的培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)18 h。用移液器小心吸取培養(yǎng)上清,轉(zhuǎn)入1.5 mL 離心管中,即獲得刺激產(chǎn)生的γ-干擾素上清。取出單抗包被板,每孔加入50 μL 樣品稀釋液,然后加入50 μL 待測(cè)樣品或?qū)φ?,混勻后室溫作? h;洗滌,每孔加入100 μL 酶標(biāo)抗體,室溫作用1 h;洗滌后每孔加入100 μL 底物,室溫避光作用30 min 后,加入終止液,測(cè)定OD450nm值。當(dāng)牛型PPD 刺激上清的OD 值-PBS 刺激上清的OD 值≥0.1,且牛型PPD 刺激上清OD 值-禽型PPD 刺激上清OD值≥0.1,為陽(yáng)性,反之為陰性。

    1.2.1.4 抗體ELISA 試驗(yàn) 按照牛分枝桿菌ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒操作步驟進(jìn)行,計(jì)算S/P值。S/P=(樣品OD450nm平均值-陰性對(duì)照OD450nm平均值)/(陽(yáng)性對(duì)照OD450nm平均值-陰性對(duì)照OD450nm平均值)。S/P≥0.3 為陽(yáng)性,S/P<0.3為陰性。

    1.2.2 評(píng)估方法 以TST 試驗(yàn)為參考標(biāo)準(zhǔn),分別與SICTT、IFN-γ-ELISA、抗體ELISA 檢測(cè)結(jié)果比較,計(jì)算符合率,并運(yùn)用SPSS 軟件進(jìn)行對(duì)比,分析敏感性差異。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 TST 與IFN-γ-ELISA

    對(duì)比結(jié)果(表1)顯示:TST 檢出陽(yáng)性114 份,IFN-γ-ELISA 檢出陽(yáng)性154 份,符合率為72.7%,經(jīng)SPSS 分析,P<0.05,說(shuō)明IFN-γ-ELISA 陽(yáng)性檢出率顯著高于TST,表明其敏感性明顯高于TST。

    表1 TST 與IFN-γ-ELISA 檢測(cè)結(jié)果對(duì)比 單位:份

    2.2 TST 與SICTT

    對(duì)比結(jié)果(表2)顯示:TST 檢出陽(yáng)性114份,SICTT 檢出陽(yáng)性103 份,符合率為96.3%,經(jīng)SPSS 分析,P>0.05,說(shuō)明SICTT 陽(yáng)性檢出率略低于TST,但差異不顯著,表明兩種方法的敏感性相似。

    表2 TST 與SICTT 檢測(cè)結(jié)果對(duì)比 單位:份

    2.3 TST 與抗體ELISA

    對(duì)比結(jié)果(表3)顯示:TST 檢出陽(yáng)性114 份,抗體ELISA 檢出陽(yáng)性21 份,符合率為69.0%,經(jīng)SPSS 分析,P<0.05,說(shuō)明抗體ELISA 陽(yáng)性檢出率顯著低于TST,表明其敏感性明顯低于TST。

    表3 TST 與抗體ELISA 檢測(cè)結(jié)果對(duì)比 單位:份

    3 討論

    近年來(lái),我國(guó)牛結(jié)核病流行率普遍升高,結(jié)核病污染場(chǎng)數(shù)量逐漸增加[7]。本試驗(yàn)利用4 種檢測(cè)方法,對(duì)結(jié)核病污染場(chǎng)的奶牛進(jìn)行檢測(cè)。以TST為參考標(biāo)準(zhǔn),分別與其他3 種方法進(jìn)行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)IFN-γ-ELISA 敏感性最高,明顯大于TST,而其他2 種方法的敏感性都低于TST。在牛結(jié)核病污染場(chǎng)的凈化過(guò)程中,要將所有感染牛盡可能全部篩檢出來(lái),這就需要敏感性高的檢測(cè)方法,因此IFN-γ-ELISA 是首選的檢測(cè)方法。

    TST 試驗(yàn)是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),也是國(guó)際貿(mào)易指定方法,但其結(jié)果判定存在人為誤差,尤其是大量檢測(cè)時(shí),會(huì)出現(xiàn)陽(yáng)性漏檢。在牛結(jié)核病污染場(chǎng)的凈化初期,需要進(jìn)行大量檢測(cè),如果采用TST 檢測(cè),就會(huì)漏檢感染牛,使其繼續(xù)污染牛群[8-9]。SICTT 雖然可排除禽結(jié)核桿菌的干擾,檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確,但其陽(yáng)性檢出率更低,同樣不適合牛結(jié)核病污染場(chǎng)初期的凈化。抗體ELISA 檢測(cè)是現(xiàn)代血清檢測(cè)的主要方法,操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)少,但因不同感染階段的牛分支桿菌抗體比較復(fù)雜,無(wú)法準(zhǔn)確捕獲[10],導(dǎo)致陽(yáng)性檢出率也明顯比TST 偏低,因此也不適合用于牛結(jié)核病污染場(chǎng)初期的凈化檢測(cè)。

    TST 和SICTT 這兩種方法適合在基層推廣,成本低,但主觀性強(qiáng),檢測(cè)過(guò)程對(duì)牛的應(yīng)激影響較大[11]??贵wELISA 檢測(cè)時(shí)間短,出結(jié)果快,但成本較高,陽(yáng)性檢出率偏低[12]。IFN-γ-ELISA 操作復(fù)雜、成本高,檢測(cè)要求較高,不適合在基層推廣,但檢測(cè)敏感性高[13]。因此,在實(shí)際的牛結(jié)核病檢測(cè)中,應(yīng)根據(jù)不同的需要和條件,選擇合適的檢測(cè)方法,也可以不同方法聯(lián)合使用。在條件不允許情況下,可以用TST 對(duì)牛結(jié)核病污染場(chǎng)進(jìn)行檢測(cè)。因IFN-γ-ELISA 是4 個(gè)方法中最敏感的方法[14],所以在條件允許的情況下,在牛結(jié)核病污染場(chǎng)最適合選用,這樣可以盡量避免漏檢感染牛。在牛結(jié)核病污染場(chǎng),患結(jié)核病的牛數(shù)量較多,如果檢測(cè)方法不敏感,就會(huì)導(dǎo)致大量陽(yáng)性牛漏檢,使牛群凈化困難[15]。如果每年春秋兩季,對(duì)牛場(chǎng)進(jìn)行IFN-γ-ELISA 檢測(cè),及時(shí)隔離淘汰陽(yáng)性牛,連續(xù)檢測(cè)幾年,牛場(chǎng)就會(huì)達(dá)到凈化目標(biāo)[16]。

    4 結(jié)論

    評(píng)估認(rèn)為,在TST、SICTT、IFN-γ-ELISA 和抗體ELISA 4 種檢測(cè)方法中,IFN-γ-ELISA 方法敏感性最高,陽(yáng)性檢出率最高,可以盡可能地將感染牛全部檢出,減少漏檢,因此最適合用于牛結(jié)核病污染場(chǎng)初期的凈化。

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