CRISPR 技術(shù)在病毒學(xué)研究中的應(yīng)用

高 帥，李 芳，李 贊，王 濤，趙東明，步志高

（1.天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300072；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150069；3.國家動物疫病防控高級別生物安全實驗室，黑龍江哈爾濱 150069）

CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associate） 是只存在于細菌及古生菌中的獲得性免疫系統(tǒng)，自1987 年被Nakata 研究組偶然發(fā)現(xiàn)以來，科學(xué)家們對其功能和機制的研究不斷深入，逐漸對其有了全面的認識。2013 年，CRISPR 技術(shù)首次作為一種基因編輯手段應(yīng)用于哺乳動物和人類細胞的基因編輯[1-2]，隨后發(fā)展態(tài)勢迅猛，由于其具有操作簡單、效率高、成本低等優(yōu)勢，現(xiàn)在已經(jīng)應(yīng)用于改良農(nóng)作物、構(gòu)建細胞或動物模型、探索疾病機理及精準治療等生物學(xué)的各個領(lǐng)域，已成為當(dāng)今生命科學(xué)領(lǐng)域最受歡迎的基因編輯技術(shù)。本文主要聚焦于近幾年CRISPR 技術(shù)在病毒學(xué)研究中的應(yīng)用，并對其發(fā)展前景進行展望，為相關(guān)領(lǐng)域研究工作的開展提供理論參考和技術(shù)依據(jù)。

1 CRISPR/Cas 系統(tǒng)

根據(jù)Cas 編碼復(fù)合物的不同，CRISPR/Cas 系統(tǒng)主要分為1 類系統(tǒng)（I、III、IV 型，12 個亞型）[3]和2 類系統(tǒng)（II、V、VI 型，9 個 亞型）[4]。1 類CRISPR/Cas 系統(tǒng)需要利用多個效應(yīng)蛋白復(fù)合物，而2 類CRISPR/Cas 系統(tǒng)只需單個效應(yīng)蛋白就可以發(fā)揮作用[5]。目前2 類II 型CRISPR/Cas9 系統(tǒng)、V 型CRISPR/Cas12a（也稱為Cpf1）系統(tǒng)以及VI 型CRISPR/Cas13a 系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)由Cas9 蛋白和gRNA（guide RNA）構(gòu)成。gRNA 包括CRISPR RNA（crRNA）和反式激活RNA（tracrRNA），它可以指導(dǎo)Cas9 蛋白靶向切割DNA 或RNA 從而發(fā)揮基因編輯作用[6]。而Cas12a 切割DNA 和Cas13a 切割RNA 僅需crRNA 協(xié)助。三種系統(tǒng)在分子量大小、結(jié)構(gòu)組成、生理生化功能及作用機制（圖1）上均存在明顯差異[7]，但各有優(yōu)勢，可以根據(jù)實驗需要，選擇性應(yīng)用于生物學(xué)相關(guān)研究。

圖1 CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12a 和CRISPR/ Cas 13a 三大主要CRISPR 系統(tǒng)的作用機制

隨著研究人員對1 類CRISPR/Cas 系統(tǒng)研究的深入，CRISPR 技術(shù)的相關(guān)理論知識與實踐應(yīng)用不斷得到擴展延伸。Dolan 等[8]發(fā)現(xiàn)，1類I 型CRISPR/Cas3 系統(tǒng)可以剪切較長片段的DNA；Pickar-Oliver 等[9]發(fā)現(xiàn)，I 型CRISPR/Cas系統(tǒng)不僅可以激活和關(guān)閉靶基因的表達，而且可以實現(xiàn)人類細胞基因組的特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控等。目前對CRISPR 2 類系統(tǒng)中的Cpf1 研究多圍繞AsCpf1[10]和LbCpf1[11]展開，但是它們只能識別非常特殊的PAM（protospacer adjacent motif）序列，因而其應(yīng)用范圍受到極大限制。Tu 等[12]發(fā)現(xiàn)，與AsCpf1 和LbCpf1 相比，F(xiàn)nCpf1 可以更加靈敏地識別PAM 序列，不僅具備較高的保真性，而且可以應(yīng)用于人類基因組編輯。這些研究成果為進一步利用CRISPR 技術(shù)開展病毒性疾病的基礎(chǔ)研究和基因治療的應(yīng)用研究提供了新工具。

2 CRISPR/Cas 系統(tǒng)用于抗病毒藥物靶點篩選

目前，病毒性疾病的治療方法十分有限，治療效果仍有待提高。CRISPR 技術(shù)的出現(xiàn)與發(fā)展為病毒病的預(yù)防控制和臨床治療帶來了希望。利用CRISPR 技術(shù)可以更方便快捷地找到抑制病毒復(fù)制的潛在藥物靶點，為病毒性疾病的治療和預(yù)防提供更加安全可行的策略與方案。

2.1 篩選黃病毒潛在藥物靶點

登革熱、小頭癥、森林腦炎分別是由黃病毒科的登革熱病毒（DENV）、寨卡病毒（ZIKV）和森林腦炎病毒感染人所引起的傳染性疾病。人群對黃病毒普遍易感，但是目前還沒有針對DENV和ZIKV 的特異性抗病毒療法或疫苗，因此利用CRISPR 技術(shù)篩選黃病毒潛在藥物靶點，對于有效控制和預(yù)防黃病毒感染具有重大意義。2016 年6月，Savidis 等[13]利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)篩選出受體酪氨酸激酶家族AXL 蛋白是DENV 和ZIKV 侵入宿主細胞的關(guān)鍵蛋白，同時鑒定出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白復(fù)合物在黃病毒早期感染中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。同期，研究人員發(fā)現(xiàn)，利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)關(guān)閉宿主細 胞SPCS1（signal peptidase complex subunit 1）基因的表達，不僅可以特異性降低黃病毒感染，而且也不會對宿主細胞造成損害[14]。另外，還有研究人員利用CRISPR 全基因組篩選技術(shù)鑒定出IFI6（interferon alpha-inducible protein6）可以靶向抑制黃病毒感染[15-16]。針對這些可作為潛在治療靶標的宿主蛋白，設(shè)計新型藥物，開發(fā)新型靶向療法，有利于提高黃病毒感染的治療效果。

2.2 篩選人類免疫缺陷病毒潛在藥物靶點

艾滋病是由人類免疫缺陷病毒（HIV）攻擊人類免疫系統(tǒng)，從而使機體易被外界病原體感染的一種嚴重傳染性疾病，病死率較高，嚴重威脅人類生命安全。至今還未研制出根治和預(yù)防艾滋病的特效藥物和有效疫苗。目前，CRISPR 技術(shù)已被運用到HIV 感染的研究中。2016 年12 月，有研究利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)進行全基因組篩選，發(fā)現(xiàn)了5 種HIV 感染必需的宿 主 蛋 白CD4、CCR5、TPST2（tyrosylprotein sulfotransferase 2）、SLC35B2（solute carrier family 35 member B2） 和ALCAM（activated leukocyte cell adhesion molecule）。其 中：CD4和CCR5 作為受體共同促進HIV 感染T 細胞；TPST2 和SLC35B2 可以使CCR5 的酪氨酸殘基硫酸化，從而促進HIV 包膜的識別；ALCAM 可以調(diào)節(jié)細胞聚合，用于HIV 的細胞間傳播[17]。針對這5 種HIV 感染必需的宿主蛋白，設(shè)計開發(fā)新型藥物，可以有效防止耐藥性HIV 毒株的出現(xiàn)，是一種具有廣闊前景的治療手段。

2.3 篩選腸道病毒潛在藥物靶點

腸道病毒主要包括脊髓灰質(zhì)炎病毒（PV）、柯薩奇病毒和埃可病毒。自然狀態(tài)下，該類病毒只感染人這唯一宿主，在世界各地均有分布。目前還沒有研制出針對腸道病毒的特效治療藥物，除了脊髓灰質(zhì)炎疫苗可以起到極好的預(yù)防效果外，其他腸道病毒疫苗都還沒有研制成功，而CRISPR 技術(shù)的出現(xiàn)大大推動了此研究領(lǐng)域的發(fā)展。2019 年5 月，研究人員利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對?？刹《具M行高通量功能性篩選，發(fā)現(xiàn)除了CD55 這一已知的病毒受體外，首次鑒定出FcRn是B 族腸道病毒一種新的脫衣殼受體，從而為腸道病毒新型藥物的研發(fā)提供了理論依據(jù)[18]。

利用CRISPR 宿主全基因組篩選技術(shù)鑒定抗病毒靶點，是目前抗病毒藥物的研究熱點。篩選潛在藥物靶點可以為創(chuàng)新藥物的設(shè)計研發(fā)和病毒性疾病的治療開拓新思路。與靶向病毒蛋白這類傳統(tǒng)治療方法不同，靶向宿主蛋白是一種新型治療方法，具有病毒不易產(chǎn)生抗藥性，且藥物具有潛在廣譜抗病毒特性的優(yōu)勢，對病毒性傳染病防控具有極大的指導(dǎo)意義。

3 CRISPR/Cas 系統(tǒng)用于疫苗開發(fā)

非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）是感染豬科動物并引起烈性傳染病的大DNA 病毒，是威脅全球養(yǎng)豬業(yè)的“頭號殺手”。自1921 年首次發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟以來，對其相關(guān)防控工作以及疫苗開發(fā)研究一直在推進。2018 年，研究人員利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)將Georgia07毒株中基因組的8-DR基因用紅色熒光蛋白替代并獲得重組病毒，首次實現(xiàn)了利用CRISPR 技術(shù)改造ASFV 基因組的目標[19-20]；隨后，有研究利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)靶向ASFV 的p30基因（CP204L），敲除p30基因后，可以高效抑制病毒復(fù)制，因此p30基因可以作為潛在的疫苗設(shè)計靶點，利用其開發(fā)減毒或單循環(huán)活疫苗[21]。2018 年ASFV 在我國沈陽市首次被發(fā)現(xiàn)后[22]，開發(fā)疫苗有效預(yù)防疫情暴發(fā)的形勢更加緊迫。未來CRISPR 技術(shù)可以進一步應(yīng)用于ASFV 基因缺失活疫苗的研究，為世界范圍內(nèi)非洲豬瘟疫情防控提供候選疫苗。相比同源重組置換基因設(shè)計疫苗的方法，利用CRISPR/Cas 系統(tǒng)制備ASFV 多基因缺失弱毒疫苗則更方便快速，可以為非洲豬瘟疫情控制爭分奪秒。

4 CRISPR/Cas 系統(tǒng)應(yīng)用于病毒性疾病診斷

目前常見的病毒性疾病診斷方法主要有PCR檢測、ELISA 抗體檢測、紅細胞吸附試驗等。一般情況下這些方法耗時長，操作步驟繁瑣，且要求操作人員具備一定的專業(yè)水準。CRISPR 技術(shù)的出現(xiàn)與發(fā)展，為病毒性疾病的快速簡便診斷帶來了新契機。2016 年5 月，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)首次被應(yīng)用于核酸檢測診斷，開辟了CRISPR 技術(shù)應(yīng)用于病毒核酸檢測的新紀元[23]。2017 年4 月，基于CRISPR/Cas13a 系統(tǒng)的病毒核酸檢測工具SHERLOCK（specific high sensitivity enzymatic reporter unlocking）問世。該系統(tǒng)首先使用重組聚合酶恒溫擴增技術(shù)（RPA）對病毒核酸樣品進行擴增，以提高其檢測靈敏度，接下來利用Cas13a 的“附屬切割”活性，切割單鏈RNA 上的報告基團，產(chǎn)生可定量的熒光信號，這樣可以靈敏、特異、快速地檢測到血液或尿液樣本中ZIKV 的存在，但缺點是一次只能檢測一種核酸序列，且需要額外的設(shè)備收集熒光數(shù)據(jù)[24]。為解決這些不足，Gootenberg 等[25]對SHERLOCK進行改進獲得SHERLOCKv2：一是在檢測體系中引入輔助性CRISPR 酶 Csm6，進一步提高其檢測靈敏度；二是加入多種Cas 蛋白，根據(jù)蛋白酶不同的切割偏好，選取不同的特異性熒光報告基團，實現(xiàn)一次性檢測多種類型病毒核酸的目的；三是將紙基傳感器引入檢測系統(tǒng)，使操作簡單方便，可直接用肉眼觀察試驗結(jié)果。此外，SHERLOCKv2 與HUDSON（heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases）配套使用，可在2 h 內(nèi)直接對患者樣品進行DENV 檢測[26]。這些研究成果證明了CRISPR/Cas 系統(tǒng)在RNA 病毒性疾病的核酸檢測診斷領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用價值，對病毒性傳染病的及早發(fā)現(xiàn)與控制治療意義非凡。

CRISPR/Cas 系統(tǒng)除了可以診斷RNA 病毒引起的疾病外，還可以診斷DNA 病毒如人乳頭瘤病毒（HPV）和ASFV 引起的疾病。與SHERLOCK 類 似，基 于CRISPR/Cas12a 系 統(tǒng) 的DETECTR（DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter）核酸檢測系統(tǒng)首先通過RPA 擴增DNA 樣品，隨后激活Cas12a 的DNase 活性，隨意切割帶有熒光報告基團的單鏈DNA，釋放熒光信號指示特定的DNA 是否存在，可以從感染多種HPV 亞型的樣本中，準確測定出高風(fēng)險的HPV16和HPV18[27]。DETECTR 不僅為DNA 病毒性疾病的診斷提供了方便快捷的平臺，而且有望在抗生素抗性監(jiān)測和單核苷酸多態(tài)性檢測等方面發(fā)揮巨大的應(yīng)用潛力[28]。側(cè)向流動檢測作為免疫反應(yīng)最常用的分析技術(shù)之一，Wang 等[29]將其與CRISPR/Cas9 系統(tǒng)結(jié)合開發(fā)了CASLFA（CRISPR/Cas9-mediated lateral flow nucleic acid assay），它可以在短時間內(nèi)特異性地檢測到非實驗室環(huán)境下可疑樣品中的ASFV DNA；Bai 等[30]將重組酶輔助擴增技術(shù)（RAA）與CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)相結(jié)合，可以檢測到低至10 amol/L 的ASFVp72基因水平，與橫向流條帶讀數(shù)相結(jié)合，可供現(xiàn)場即時檢測。這些基于CRISPR 的DNA 檢測系統(tǒng)，具有便攜、簡單、靈敏和特異性高的優(yōu)勢，無需醫(yī)療專業(yè)知識和復(fù)雜的輔助設(shè)備即可在醫(yī)療現(xiàn)場使用，在資源匱乏或非實驗室環(huán)境中具有巨大的基因分析潛力。

CRISPR 技術(shù)的病毒核酸診斷系統(tǒng)為病毒病的及早發(fā)現(xiàn)、及早確認和及早控制提供了快捷便利的工具，有望對人類公共衛(wèi)生安全事業(yè)做出重大貢獻。目前CRISPR 技術(shù)在病毒病檢測診斷領(lǐng)域的應(yīng)用仍在不斷發(fā)展，HOLMES[31]、CRISDA[32]和CRISPRChip[33]等檢測系統(tǒng)的出現(xiàn)以及新發(fā)現(xiàn)的Cas14[34]和CasX[35]蛋白的進一步應(yīng)用，都拓展了CRISPR/Cas 系統(tǒng)在病毒學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。

5 CRISPR/Cas 系統(tǒng)應(yīng)用于病毒性疾病的臨床治療

5.1 清除患者體內(nèi)的乙型肝炎病毒

乙肝是由乙型肝炎病毒（HBV）感染所引起的，可通過母嬰垂直傳播的一種常見傳染性疾病。HBV 的共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）在慢性乙肝患者中可以穩(wěn)定存在，作為病毒復(fù)制與表達的模板，導(dǎo)致人體內(nèi)的病毒形成持續(xù)性感染。徹底清除宿主細胞內(nèi)的HBV DNA 是治愈乙肝的標準。雖然乙肝疫苗可以有效阻斷乙肝的垂直傳播，起到很好的保護作用，但是至今還沒有可以徹底清除乙肝患者或病毒攜帶者體內(nèi)病毒的有效手段。CRISPR技術(shù)是目前可以完全治愈乙肝患者的最有前景優(yōu)勢的工具。2014 年，Lin 等[36]針 對HBV-A 型設(shè)計了8 條gRNA，在體內(nèi)和體外依靠CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，對帶有HBV 基因組的重組質(zhì)粒進行切割破壞，從而抑制HBV 感染；2015 年，Wang等[37]針 對HBV-A-D 型設(shè)計了15 條gRNA，其中每兩條gRNA 自由組合所形成的11 種雙gRNA組合介導(dǎo)的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，可以更高效地對HBV 基因組產(chǎn)生破壞，抑制HBV 復(fù)制；最近新發(fā)現(xiàn)，嗜熱鏈球菌（St）CRISPR/Cas9 系統(tǒng)可以安全、高效、精準地在HBV 的cccDNA 中引入突變或者缺失，從而導(dǎo)致cccDNA 失活[38]，這是目前唯一可以讓組織中的cccDNA 永久性失活的方法[39]。這些針對HBV 基因組及cccDNA 的研究，證明了CRISPR 技術(shù)對HBV 基因組進行編輯的高效性和有效性，為完全清除乙肝患者及病毒攜帶者體內(nèi)的HBV 提供了最有前景的治療策略，為其進一步應(yīng)用于臨床治療提供了理論基礎(chǔ)。

5.2 治療艾滋病

自1981 年在美國發(fā)現(xiàn)首例艾滋病病例以來，HIV 已肆虐到世界各地。目前研究人員針對艾滋病的臨床治療主要聚焦在抗HIV 藥物研發(fā)、基因療法、免疫療法與紅細胞誘導(dǎo)等方面，但突破性成果寥寥無幾。自CRISPR 技術(shù)問世以來，研究人員已將其探索性地應(yīng)用到艾滋病臨床治療領(lǐng)域，為艾滋病治療提供新思路和新方向。Kaminski 等[40]針對HIV-1 基因組的長末端重復(fù)序列設(shè)計gRNA，經(jīng)Cas9 編輯后，HIV-1 基因組缺失了9 709 個核苷酸，基本上完全清除了HIV-1 基因組；2019 年7 月，研究人員開發(fā)出一種持續(xù)遞送抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的給藥系統(tǒng)，與CRISPR/Cas9 系統(tǒng)聯(lián)合后，可以有效治療艾滋病，將其應(yīng)用于小鼠動物實驗中，近三分之一的小鼠體內(nèi)沒有檢測到HIV[41]；2019 年9 月，Xu 等[42]首次利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在體外敲除正常造血干細胞中的CCR5基因，再將編輯后的干細胞移植到艾滋病和急性淋巴細胞白血病并發(fā)的患者體內(nèi)，經(jīng)過19 個月的觀察，發(fā)現(xiàn)攜帶CCR5突變的供體細胞能夠在受體體內(nèi)長期存活，且無脫靶效應(yīng)，這個試驗雖然緩解了急性淋巴細胞白血病，但是沒有將HIV 感染效果抑制到預(yù)期水平。該研究初步探索了CRISPR 技術(shù)用于艾滋病臨床治療的可行性和安全性，為艾滋病的完全治愈帶來了新希望。

雖然CRISPR/Cas 系統(tǒng)在疾病的模型構(gòu)建和病毒病的治療領(lǐng)域顯示出強大的應(yīng)用潛力，但是基因編輯技術(shù)現(xiàn)階段應(yīng)用于臨床治療還有許多亟待解決的問題，如脫靶和免疫反應(yīng)等，研究人員需繼續(xù)努力，以克服這些障礙。

6 展望

CRISPR/Cas 系統(tǒng)在病毒學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用主要包括抗病毒藥物靶點的篩選、疫苗開發(fā)、病毒性疾病的核酸檢測診斷、臨床治療等方面，發(fā)展?jié)摿薮?，未來前景可觀。本實驗室已建立了基于CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的人和小鼠的全基因組篩選平臺，用于篩選調(diào)控流感病毒、狂犬病病毒以及艾滋病病毒等復(fù)制的關(guān)鍵宿主基因，目前已取得不錯進展。調(diào)控病毒復(fù)制的關(guān)鍵宿主基因的篩選鑒定及其作用機制研究，將為闡明這些病毒的致病機制提供重要幫助。

隨著對CRISPR/Cas 系統(tǒng)研究的不斷深入，更高效、更精確、更安全的CRISPR 相關(guān)技術(shù)層出不窮，如Campa 等[43]把Cas12a、CRISPR 序列和多個RNA 分子，按順序依次保存在Pol II 啟動子下的轉(zhuǎn)錄本中，可以同時修飾調(diào)節(jié)25 個靶點；CRISPR-AID 技術(shù)可以同時實現(xiàn)基因的激活、干擾以及刪除[44]；新開發(fā)的CRISPR Live FISH 技術(shù)，可以實時觀測活細胞中基因組編輯的動態(tài)情況[45]。這些研究成果豐富了CRISPR 技術(shù)的理論內(nèi)容，奠定了操作性強的實踐基礎(chǔ)，為病毒學(xué)領(lǐng)域的科學(xué)研究不斷提供可靠的理論支撐和強有力的工具。

雖然CRISPR/Cas 系統(tǒng)已被證明是有效的基因編輯技術(shù)，但是仍不可忽視其存在的致癌風(fēng)險[46-47]、脫靶效應(yīng)[48]以及遞送系統(tǒng)的安全準確性不足等問題。以CRISPR/Cas9 系統(tǒng)為例，目前對其優(yōu)化的主要策略分3 種：一是篩選Cas9 蛋白的小分子抑制劑和研究抗CRISPR 蛋白作用機理，有效控制CRISPR/Cas9 系統(tǒng)[49-51]；二是在Cas9上引入特定的多肽鏈調(diào)控其活性[52]，或者開發(fā)Cas9 的同系物和蛋白突變體[53-54]，還可以設(shè)計sgRNA 的二級結(jié)構(gòu)等[55]，這都可以降低系統(tǒng)脫靶率，提高特異性；三是開發(fā)納米膠囊或化學(xué)修飾的sgRNA 脂質(zhì)納米顆粒，精準遞送CRISPR/Cas 系統(tǒng)[56-57]。CRISPR 技術(shù)的不斷完善、改進與創(chuàng)新，為其進一步在病毒學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究提供了理論基礎(chǔ)和創(chuàng)新思路，極大地推動了病毒學(xué)的發(fā)展。