2017—2018 年山東省奶牛場犢牛腹瀉相關(guān)病毒病原學(xué)檢測

張 亮，張云飛，蔣仁新，任亞初，張 淼，3，楚會萌，解曉莉，程凱慧，楊 美，王基隆，孫陽陽，楊宏軍

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心，山東濟南 250100；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；3.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212400）

犢牛腹瀉是犢牛飼養(yǎng)過程中的常見疾病之一，通常會引起犢牛脫水、酸中毒、電解質(zhì)失衡，導(dǎo)致牛只出現(xiàn)精神萎靡、食欲不振，排水樣便、稀便或者軟便，以及嘔吐、脫水、體重減少等臨床癥狀，一年四季均可發(fā)生，但高發(fā)于寒冷的冬季及早春季節(jié)[1]。犢牛腹瀉可使?fàn)倥Ｋ劳?、發(fā)育不良以及治療費用增加，嚴(yán)重影響奶牛養(yǎng)殖的健康和可持續(xù)發(fā)展[2]。目前，全世界奶牛場的犢牛腹瀉發(fā)病率在20%～100%之間不等。根據(jù)是否有病原引起，可將腹瀉分成非傳染性腹瀉和傳染性腹瀉[3]。其中病毒是導(dǎo)致犢牛傳染性腹瀉的重要原因之一，常見的有牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV），牛輪狀病毒（bovine rotavirus，BRV），牛腸道病毒（bovine enterovirus，BEV）和牛冠狀病毒（bovine coronavirus，BCoV）等[4]。

BVDV 可引起以黏膜發(fā)炎、糜爛、壞死以及腹瀉為特征的急性熱性牛傳染病，呈世界性分布，廣泛存在于歐美等養(yǎng)牛發(fā)達國家[5]。BEV 感染性不明顯，通常只引起牛的輕度腹瀉或隱性感染，但常因侵犯其他器官而引起各種臨床綜合征，或在一定條件下引發(fā)顯著癥狀[6]。BCoV 可引起新生犢牛出血性腹瀉和呼吸道感染以及成年牛冬季血痢，遍布全世界[7]。BRV 可引起以精神沉郁、厭食、腹瀉、脫水為主要特征的犢牛急性胃腸傳染病，在世界范圍內(nèi)造成嚴(yán)重經(jīng)濟損失[8]。目前關(guān)于山東省犢奶牛4 種病原調(diào)查的報道較少。本研究對山東省犢奶牛群進行上述4 種病毒的病原學(xué)檢測，以期為了解山東省奶牛消化道疾病病毒性病原的流行狀況以及犢牛腹瀉的防控和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源

2017—2018 年，從山東省13 個地級市的51家奶牛場收撿犢牛腹瀉糞便樣品624 份（表1）。其中：對來自46 家牧場的535 份樣品進行BVDV檢測，36 家牧場的314 份樣品進行BEV 檢測，42家牧場的362 份樣品進行BCoV 檢測，30 家牧場的209 份樣品進行BRV 檢測。

表1 犢牛腹瀉樣品來源分布

1.2 主要試劑

AMV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自Vazyme 公司；rTaqDNA 聚合酶、MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0 試劑盒，購自TaKaRa 公司；引物，購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 樣品采集與核酸提取

用無菌棉拭子采集犢牛新鮮腹瀉糞樣，放入含2 mL 無菌生理鹽水的管中，冷凍后加冰塊保溫寄送至實驗室。將樣品充分混勻，反復(fù)凍融3 次后，取1 mL，12 000 r/min 離心5 min，取上清，備用。

1.4 PCR 檢測

按照TaKaRa 公司的MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0 試劑盒說明，從上清中提取病毒核酸樣品。將提取后的核酸樣品，參照Vazyme公司的AMV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書制備cDNA，用于后續(xù)PCR 檢測。分別參照文獻[9-12]，設(shè)計BVDV、BEV、BCoV 和BRV 檢測引物，交由上海生工有限公司合成。采用Vazyme 公司AMV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，對樣品核酸反轉(zhuǎn)錄后進行PCR 擴增。擴增產(chǎn)物通過凝膠電泳儀，檢測是否存在目的條帶，進而判定樣品是否為陽性。

1.5 統(tǒng)計分析

將13 個地級市分為魯西北（德州、聊城、濱州、東營）、魯中（濟南、泰安、淄博、濰坊）、魯西南（濟寧、臨沂、日照）和半島（青島、煙臺）4個地理區(qū)域。對檢測結(jié)果采用SPSS 20.0 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，Pearson 卡方檢驗進行顯著性差異分析，采用Graphpad Prism 8 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原檢出率

采用特異性PCR 對BVDV、BRV、BEV和BCoV 進行檢測。結(jié)果（圖1～2）顯示：BVDV、BEV、BCoV、BRV 個體檢出率分別為34.58%（185/535）、11.78%（37/314）、8.84%（32/362）、17.70%（37/209），群體檢出率分別為47.83%（22/46）、38.89%（14/36）、35.71%（15/42）、33.33%（10/30）。BVDV個體檢出率和群體檢出率均顯著高于其他3 種病毒（P＜0.01）。

圖1 檢測樣品中4 種病毒的個體檢出率對比

圖2 檢測樣品中4 種病毒的群體檢出率對比

2.2 區(qū)域分布

對4 種病毒的檢測結(jié)果，按照山東省地理區(qū)域進行統(tǒng)計分析。結(jié)果（表1）顯示，魯中地區(qū)BVDV 個體檢出率為46.08%，顯著高于其他區(qū)域（P＜0.01），而其他3 個區(qū)域間的BVDV 個體檢出率以及其他病毒檢出率在全省不同地域的分布無明顯差異（P＞0.05）。

表2 山東省不同區(qū)域4 種病毒的個體檢出率統(tǒng)計 %

2.3 時間分布

對2017—2018 年樣品檢測結(jié)果進行統(tǒng)計和對比分析。結(jié)果（圖3）顯示：2018 年BVDV 檢出率較2017 年顯著增加（P＜0.01），其他病毒略有下降，但下降幅度不顯著（P＞0.05）。

圖3 2017—2018 年山東省4 種病毒檢出率對比

3 討論

本次檢測數(shù)據(jù)顯示，山東省奶牛養(yǎng)殖場犢牛腹瀉樣品中，BVDV 的個體檢出率（34.58%）和群體檢出率（47.83%）顯著高于其他病原，而且與2017 年相比顯著增加，表明BVDV 是導(dǎo)致山東省犢牛腹瀉的主要病毒性因素，且有流行加重趨勢，建議重點加強防控。

本次檢測的BVDV 檢出率高于Deng 等[14]2015年報道的32.06%的全國奶牛陽性率和孫力等[15]報道的24.6%的新疆地區(qū)陽性率，但低于宋維彪等[16]報道的51.59%的青海省牦牛陽性率。目前國內(nèi)多數(shù)牧場未對進出場的牛只進行BVDV 檢測，且BVDV 疫苗免疫率較低，從而導(dǎo)致了BVDV 在牧場間或牧場內(nèi)的傳播和流行[7]。在牛只轉(zhuǎn)運時無需檢測BVDV 以及BVDV 疫苗免疫率低的背景下，山東省較全國其他省份BVDV 流行嚴(yán)重可能與山東省奶牛集約化養(yǎng)殖程度高、流動性大相關(guān)。

要控制BVDV 的區(qū)域流行和傳播，牧場可根據(jù)自身情況和經(jīng)濟承受能力，開展BVDV 防控和凈化工作。對于低陽性率牧場，淘汰陽性牛和群體監(jiān)控是牧場安全的有力保障；對于高陽性率或進出場牛只頻繁的牧場，可通過疫苗免疫、分群飼養(yǎng)、監(jiān)測新生犢牛和進場牛、淘汰持續(xù)感染（PI）牛等綜合措施逐步開展凈化。在BVDV 高發(fā)季節(jié)、高陽性率牧場，開展?fàn)倥Ｉ嵯?、進出場消毒和初乳巴氏消毒等有效的消毒措施，可有效降低BVDV的傳播風(fēng)險。

4 種腹瀉相關(guān)病毒性病原引起的腹瀉是嚴(yán)重影響犢牛發(fā)育和成活率的主要疾病之一，目前尚無特效治療方法。國內(nèi)僅有BVDV 滅活疫苗，一般只用于本病流行地區(qū)2 月齡至2 歲牛的免疫，對育成母牛和種公?？捎谂浞N前再接種1 次，這樣多數(shù)?？梢垣@得免疫[13]。對于其他3 種病毒，目前尚無成品疫苗使用，感染發(fā)病時可應(yīng)用收斂劑和補液等進行保守治療，同時配合抗生素治療[17]。平時應(yīng)該加強檢疫，對引進牛只嚴(yán)格進行血清學(xué)檢測，防止引入帶毒牛。一旦發(fā)生腹瀉，對病牛進行隔離治療或處理。4 種病原引發(fā)疾病的預(yù)防關(guān)鍵在于加強飼養(yǎng)管理。新生犢牛及時喂服初乳、降低圈內(nèi)地面冷輻射和加強圈舍消毒，可有效降低犢牛腹瀉發(fā)生率。另外，國內(nèi)科研工作者應(yīng)加快新流行毒株的分離，篩選出免疫原性好的毒株進行疫苗研制，通過疫苗免疫來更好地預(yù)防BVDV、BCoV 等感染的發(fā)生。

本次檢測涉及的樣品均來自牧場送檢的犢牛腹瀉糞便樣品，僅對BVDV、BEV、BCoV 和BRV 進行了檢測分析，并未檢測細(xì)菌及其他病毒的感染情況，也沒有對所有樣品全部檢測4 種病原，無法分析樣品中病原的混合感染情況，因此無法明確引起犢牛腹瀉的具體病因，檢測結(jié)果也不能真實反映這些病原的流行情況，但可以說明這些病原是引起犢牛腹瀉的重要影響因素，應(yīng)引起重視。

4 結(jié)論

檢測表明，4 種腹瀉相關(guān)病原在山東省內(nèi)奶牛群中流行廣泛，以BVDV 流行最為嚴(yán)重，尤其是魯中地區(qū)，且有流行加重趨勢，建議有針對性地開展防控與凈化工作。