柱前衍生-HPLC法對水蛭的指紋圖譜及其16種氨基酸含量測定研究

顧念念 索亞然 喬藝涵 王昭懿 馮丹 趙霞 孟雪丹 吳怡青 李朝峰 趙崇軍 馬志強 林瑞超 鄒迪新

水蛭藥材為水蛭科動物水蛭HirudonipponicaWhitman、螞蟥WhitmaniapigraWhitman或柳葉螞蟥WhitmaniaacranulataWhitman的干燥全體，具有破血通經(jīng)，逐瘀消癥的功效[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，水蛭具有抗血栓、抗凝血、抑制腫瘤血管生成、抗癌轉(zhuǎn)移及抗炎抗菌等活性，主要有效成分為蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸及一些小分子化合物[2-3]。目前有關(guān)水蛭藥材的氨基酸測定報道較多，而用相似度結(jié)合模式識別的數(shù)據(jù)分析對水蛭藥材進行質(zhì)量評價較少。PITC衍生劑是目前廣泛使用的HPLC氨基酸分析方法，該方法方便、快速，生成的苯氨基硫甲酰衍生物單一、穩(wěn)定；紫外檢測(254 nm)靈敏度高，可達1 pmol，本實驗采用PITC柱前衍生法建立了水蛭藥材的HPLC游離氨基酸指紋圖譜和含量測定的研究方法，綜合指紋圖譜信息、聚類分析及主成分分析將藥材分為3類，結(jié)果表明該方法可為水蛭藥材質(zhì)量控制評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

高效液相色譜儀(Waters 2695)包括2695四元梯度泵、自動進樣器、2489紫外檢測器、在線脫氣機、柱溫箱、Empower色譜工作站。FW-200型高速萬能粉碎機(北京科偉永興儀器有限公司)； KQ-3200B型數(shù)控超聲儀(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)；N-1300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)；電子分析天平(Mettler Toledo 公司)；10-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津泰斯特儀器有限公司)；GTR10-2型高速冷凍離心機(北京時代北利離心機有限公司)；雷磁pH計(上海儀電科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 藥材樣品與試藥

水蛭藥材共18批，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)鑒定系楊瑤君老師鑒定為水蛭科動物螞蟥WhitmaniapigraWhitman的干燥全體，藥材信息見表1。對照品(上海源葉生物科技有限公司)天門冬氨酸Asp(批號B21934)、谷氨酸Glu(批號B21916)、絲氨酸Ser(批號B21932)、甘氨酸Gly(批號B21915)、組氨酸His(批號B21938)、精氨酸Arg(批號B21920)、蘇氨酸Thr(批號B21933)、丙氨酸Ala(批號B21911)、脯氨酸Pro(批號B21914)、酪氨酸Tyr(批號B21924)、纈氨酸Val(批號B21936)、蛋氨酸Met(批號B21913)、異亮氨酸Ile(批號B21937)、亮氨酸Leu(批號B21925)、苯丙氨酸Phe(批號B21910)、賴氨酸Lys(批號B21922)，上述對照品純度均大于98%；無水乙酸鈉(純度大于99%，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)、乙腈、乙酸、正己烷色譜純(Fisher)、三乙胺(TEA)(批號BCBH3144V)、異硫氰酸苯酯(PITC)(批號BCBB1912V)、純水(娃哈哈純凈水)。

表1 藥材批次信息

1.3 HPLC色譜分析條件

博納艾杰爾Venusil AA氨基酸分析專用柱(4.6×250 mm，5μm)；流動相A：0.1 mol/L無水乙酸鈉(pH 6.5)-乙腈(93∶7)，B：乙腈-水(4∶1)；梯度洗脫(0～14 min，0～10% B；14～22 min，10%～20% B；22～37 min，20%～30.7% B；37～41 min，30.7%～31.6% B；41～48 min，31.6%～34% B)，流速0.8 mL/min，柱溫40 ℃，檢測波長254 nm，進樣量10 μL。

1.4 溶液的制備

1.4.1 衍生溶液的配制 TEA乙腈溶液：TEA 1.4 mL，加乙腈8.6 mL，混勻；PITC溶液：取PITC 25μL，加乙腈2 mL混勻。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 分別取氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，加0.1 mol/L鹽酸溶液溶解為適當(dāng)濃度的對照品儲備液，取貯備液適量于同一容量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液定容至刻度，搖勻，分別制成天門冬氨酸Asp、谷氨酸Glu、絲氨酸Ser、甘氨酸Gly、組氨酸His、精氨酸Arg、蘇氨酸Thr、丙氨酸Ala、脯氨酸Pro、酪氨酸Tyr、纈氨酸Val、蛋氨酸Met、異亮氨酸Ile、亮氨酸Leu、苯丙氨酸Phe、賴氨酸Lys質(zhì)量濃度分別為0.0670、0.3938、0.0532、0.0496、0.0260、0.0300、0.0550、0.3444、0.0428、0.0540、0.0858、0.0272、0.0612、0.0914、0.0666、0.0600 mg/mL的測定游離氨基酸樣品的混合對照品溶液；天門冬氨酸Asp、谷氨酸Glu、絲氨酸Ser、甘氨酸Gly、組氨酸His、精氨酸Arg、蘇氨酸Thr、丙氨酸Ala、脯氨酸Pro、酪氨酸Tyr、纈氨酸Val、蛋氨酸Met、異亮氨酸Ile、亮氨酸Leu、苯丙氨酸Phe、賴氨酸Lys質(zhì)量濃度分別為1.2304、1.6528、0.5928、0.6584、0.5588、0.7008、0.4076、0.7336、0.4956、0.5500、0.7340、0.2492、0.4588、0.9060、0.6692、1.0764 mg/mL的測定水解氨基酸樣品的混合對照品溶液。

1.4.3 供試品溶液的制備 取水蛭藥材粉末(過40目篩)5 g，精密稱定，加入蒸餾水25 mL，搖勻，浸提45 min，超聲提取60 min(500 W，100 HZ)，離心(5000 r/min)20 min，取上清液備用。 游離氨基酸樣品的制備：精密取上清液4 mL，加入12 mL乙腈，搖勻，過濾，殘渣加乙腈溶液(乙腈-水=3∶1)洗滌，減壓揮干溶劑后，0.1 mol/L鹽酸溶液定容至10 mL，0.45μm濾膜過濾即可。水解氨基酸樣品的制備：精密取上清液2 mL，加入6 mol/L鹽酸10 mL，搖勻，抽真空，氮氣密封，置110 ℃烘箱中水解24 小時，取出水解管冷卻后轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，水浴揮干鹽酸并水洗數(shù)次至鹽酸徹底揮干，0.1 mol/L鹽酸溶液定容至10 mL，0.45 μm濾膜過濾即可。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)品和供試品的衍生 準(zhǔn)確取氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液200 μL，分別置于1.5 mL離心管中，加入TEA乙腈溶液和PITC乙腈溶液各100 μL至每個離心管，混勻，室溫放置1 小時，各加入正己烷400 μL，振搖后靜置10 min，取下層溶液，0.45 μm濾膜過濾，取濾液200 μL，加800 μL水稀釋，搖勻，進樣10 μL。

1.5 方法學(xué)考察

精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復(fù)性試驗表明相對峰面積RSD均小于3 %，符合標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 指紋圖譜的建立與評價

2.1.1 指紋圖譜的建立 將18批水蛭藥材色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件》(V2.0)進行分析處理，以S10號樣品色譜圖為參照圖譜，生成水蛭藥材氨基酸指紋圖譜(R)，建立了水蛭藥材游離類氨基酸HPLC指紋圖譜，見圖1。

2.1.2 共有峰的標(biāo)定與指認 根據(jù)18批藥材色譜圖，利用相似度軟件進行數(shù)據(jù)匹配，共標(biāo)定出25個色譜峰，并指認16個共有峰，見圖2，游離以及水解樣品圖譜見圖3。

圖1 18批藥材游離氨基酸HPLC圖

注：2:Asp；3:Glu； 6:Ser； 7:Gly； 8:His； 9:Arg； 10:Thr； 11:Ala； 12:Pro； 16:Tyr； 17: Val； 18: Met； 20:Ile； 21: Leu； 23: Phe； 25:Lys圖2 18批藥材對照圖譜

注：1:Asp； 2:Glu； 3:Ser； 4:Gly； 5:His； 6:Arg； 7:Thr； 8:Ala； 9:Pro； 10:Tyr； 11: Val； 12: Met； 13:Ile； 14: Leu； 15: Phe； 16:Lys圖3 藥材水解樣品(A)、游離樣品(B)、混合氨基酸對照品(C)和空白(D)HPLC圖

2.2 相似度評價

采用相似度軟件對藥材的色譜圖進行相似度評價，結(jié)果18批藥材的相似度均>0.960，說明不同批次的藥材之間的游離氨基酸化學(xué)組成一致性較好，符合指紋圖譜的要求，可以建立共有模式。

2.3 聚類分析

將18批藥材的25個共有峰峰面積相對于進樣濃度標(biāo)準(zhǔn)化作為變量導(dǎo)入SAS8.2軟件，以離均差平方和法對其進行聚類，結(jié)果見圖4。當(dāng)判別距離為6時，可以分為三類，S5、S6、S7、S8、S9、S10為一類，S1、S3、S11、S12、S14、S15、S17、S18為二類，S2、S4、S13、S16為三類，表明不同產(chǎn)地的水蛭成分含量存在一定的差異，同一產(chǎn)地水蛭藥材成分也存在差異，原因可能與水蛭生活環(huán)境，所食食物及采收加工方式有關(guān)。

2.4 主成分分析

分別以水蛭藥材游離氨基酸指紋圖譜中25個共有峰的峰面積為變量，采用SIMCA-13.0分析軟件進行主成分分析，并作主成分得分圖和載荷圖，見圖5、圖6。

由圖5可知18批藥材可分為三類，S5、S6、S7、S8、S9、S10為第一類，S1、S3、S11、S12、S14、S15、S17、S18為第二類，S2、S4、S13、S16為第三類，與聚類分析結(jié)果一致。因子載荷是主成分與原始變量的相關(guān)系數(shù)，由圖6可知P6 (Ser)、P7(Gly)、P10(Thr)離原點較遠，即載荷較大，表明這些共有峰在區(qū)分不同批次水蛭藥材中起著很大作用。

圖4 18批藥材聚類分析圖

圖5 18批藥材主成分得分圖

圖6 18批藥材主成分載荷圖

2.5 含量測定

2.5.1 方法學(xué)考察 精密度試驗、穩(wěn)定性試驗表明保留時間和峰面積RSD均小于3 %，重復(fù)性試驗除游離樣品His 、Met 的峰面積RSD為3.65 %、4.30%外，均小于3 %，線性關(guān)系考察r值在0.999 ～1.000之間，符合標(biāo)準(zhǔn)，加樣回收率試驗中游離氨基酸的加樣回收率在98.43%～102.34%，RSD在1.71%～4.23%，水解氨基酸的加樣回收率在97.12%～101.26%，RSD在1.20%～3.77%。

2.5.2 樣品的測定 取18批不同批次的水蛭藥材，按1.4項下方法制備供試品試液，按1.3項色譜條件測定，回歸方程進行計算，結(jié)果見表2、3。

表2 游離氨基酸成分的含量測定結(jié)果(mg/g)

表3 水解氨基酸成分的含量測定結(jié)果(mg/g)

3 討論

本實驗前期以色譜峰的數(shù)目、分離度、峰型等色譜參數(shù)為指標(biāo)，比較了提取溶劑的量(20 mL，25 mL，30 mL)以及浸泡時間(30 min，45 min，60 min)和超聲時間(30 min，45 min，60 min)，對供試品溶液制備方法進行了考察，最終確定25 mL水浸泡45 min，超聲60 min，5000 r/min離心20 min即可提取完全；并考察了不同流動相系統(tǒng)(5 %乙腈0.1 mol/L無水乙酸鈉水溶液 - 80 %乙腈水溶液，7%乙腈0.1 mol/L無水乙酸鈉水溶液-80%乙腈水溶液，10%乙腈0.1 mol/L無水乙酸鈉水溶液-80%乙腈水溶液)，不同流速(0.6 mL/min，0.8 mL/min，1 mL/min)，最終采用峰型較好、出峰時間合適的7%乙腈0.1 mol/L無水乙酸鈉水溶液-80%乙腈水溶液為流動相，流速為0.8 mL/min。

本實驗收集了18批不同產(chǎn)地的水蛭藥材，建立了水蛭藥材的游離類氨基酸指紋圖譜，并較為全面地分析了18批藥材中16種氨基酸的含量，結(jié)果表明不同批次的水蛭藥材氨基酸含量差異很大，水解氨基酸中含量最高的Glu 含量范圍為7.26～18.36 mg/g，游離氨基酸中含量最高的Ala的含量范圍為1.43～ 4.39 mg/g。相似度評價分析發(fā)現(xiàn)18批藥材間相似度在0.960以上，說明藥材間質(zhì)量較穩(wěn)定，而由因子載荷分析可知Ser、Gly、Thr對不同批次水蛭藥材的區(qū)分有較大貢獻，含量測定結(jié)果結(jié)合聚類分析、主成分分析說明即使同一產(chǎn)地的藥材也存在一定的差異。在實驗條件下，游離氨基酸樣品和水解總氨基酸樣品中均未檢測出Cys，與文獻[4]報道一致。

由于中藥指紋圖譜整體性和模糊性的特點，單純比較其相似度說服力弱[5]，因此本實驗結(jié)合聚類分析和主成分分析對不同產(chǎn)地的水蛭藥材進行質(zhì)量評價，從水蛭藥材氨基酸成分著手，較為全面地評價了水蛭藥材中氨基酸成分及其含量，建立了其指紋圖譜和含量測定方法，為水蛭藥材的后續(xù)研究提供一定的參考依據(jù)。