基于UPLC-LTQ-Orbitrap-MS分析刺果番荔枝葉的化學(xué)成分

肖治均 楊欣欣 梅矩銘 王梓軒 李婭琦 劉春生 雷海民 徐擁軍 陳嚇第 王學(xué)勇 馬長華

腫瘤是一種多見疾病，其發(fā)病率與死亡率在世界范圍內(nèi)迅速增長[1]。刺果番荔枝作為一種天然的抗癌藥物，俗稱作“癌癥殺手”，能導(dǎo)致多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，已經(jīng)證實(shí)其對肝癌、前列腺癌、乳腺癌和皮膚癌有一定的抑制作用[2-5]。刺果番荔枝AmronamuricataL.又稱紅毛榴蓮，為番荔枝科，番荔枝屬(Annoaceae)中的一個(gè)栽培種，原產(chǎn)于南美洲。目前，在中國海南、云南、廣東和廣西等地均有引種栽培[6]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，番荔枝內(nèi)酯類和生物堿類是該植物的主要化學(xué)成分，具有抗腫瘤、抗瘧和抗寄生蟲的活性[7]。自20世紀(jì)80年代以來，人們發(fā)現(xiàn)該植物的種子和葉片具有抗癌和抑菌作用，引起了研究者的廣泛關(guān)注，在南美和非洲等地，該植物已被用于治療癌癥，具有發(fā)展為天然抗癌藥的潛力[8-9]。

天然植物化學(xué)成分復(fù)雜，利用傳統(tǒng)的提取、分離、純化并結(jié)合NMR技術(shù)研究天然植物中的化學(xué)成分，不僅方法繁瑣，且耗時(shí)費(fèi)力[10]。近年來，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用( LC-MS )技術(shù)已成為天然植物中化學(xué)成分快速分離與鑒定的強(qiáng)有力手段[11-13]。LTQ-Orbitrap-MS是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)新質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，其綜合了LTQ的多級質(zhì)譜功能以及Orbitrap的高分辨能力，可在較短時(shí)間內(nèi)同時(shí)實(shí)現(xiàn)對母、子離子的高分辨采集和多級質(zhì)譜碎裂，顯著提高了復(fù)雜體系中化學(xué)成分的快速鑒別與分析能力[14-15]。目前，對刺果番荔枝中化學(xué)成分的研究僅限于傳統(tǒng)提取分離手段結(jié)合半制備色譜法等，且多集中于種子和根部[16-20]，未見LC-MS法表征刺果番荔枝葉化學(xué)成分的報(bào)道。

本研究擬利用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS技術(shù)對刺果番荔枝葉中多種化學(xué)成分進(jìn)行快速準(zhǔn)確識別，通過查閱文獻(xiàn)，總結(jié)各類化合物的裂解規(guī)律，建立各類化合物的識別方法，以期為刺果番荔枝葉的提取分離與藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

LTQ-Orbitrap XL線性離子阱-串聯(lián)靜電軌道場質(zhì)譜儀，配有熱電噴霧離子源(HESI)，Xcalibur 2.1 工作站(美國Thermo Fisher Scientific公司)，DFT-50A-型粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)，BS110S 1/1 萬天平(德國Sartorius儀器有限公司)，KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 藥材與試劑

刺果番荔枝葉采于厄瓜多爾瓜亞基爾市，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院劉春生教授鑒定為番荔枝科，番荔枝屬刺果番荔枝AmronamuricataL.的干燥葉片。乙腈(質(zhì)譜純，F(xiàn)isher公司)，甲酸(質(zhì)譜純，德國 Merk公司)，超純水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)，其他試劑均為市售分析純(北京化工廠)。

1.3 供試品溶液的制備

取適量干燥刺果番荔枝葉，粉碎機(jī)粉碎，過 60 目篩，精密稱定粉末1.0 g置100 mL錐形瓶中，精密加入 95% 乙醇50 mL，超聲提取( 功率300 W，頻率40 kHz ) 30 min，取出，冷卻至室溫，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜濾過，即得刺果番荔枝葉樣品溶液。

1.4 色譜條件

Acquity UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動相0.1% 甲酸水( A )-乙腈(B)；梯度洗脫程序：0～9 min (5%～60% B)，9～12 min (60% ～ 70% B)，12～28 min (70%～90% B)，28～29 min (90%～5% B)，29～33 min (5%～5% B)；流速為0.3 mL/min；進(jìn)樣量2 μL；進(jìn)樣室溫度4 ℃；柱溫 30 ℃。

1.5 質(zhì)譜條件

LTQ-Orbitrap XL線性離子阱-串聯(lián)靜電軌道場質(zhì)譜儀，HESI 電噴霧離子源，正負(fù)離子檢出模式，離子源溫度 350 ℃，電離源電壓 4 KV，毛細(xì)管電壓：35 V，管透鏡電壓：110 V，鞘氣和輔助氣均為高純氮?dú)?純度>99.99%)，鞘氣流速 40 arb，輔助氣流速：20 arb；激活能量單位：0.25 q；激活時(shí)間：30 ms；歸一化碰撞能量：35%；傅里葉高分辨掃描范圍m/z100～1500 Da；樣品采用傅里葉變換高分辨全掃方式(FT，F(xiàn)ull scan，Resolution 30000)，二級和三級質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴性(data-dependent acquisistion) ddMS2和 ddMS3掃描，選取上一級豐度最高的3個(gè)色譜峰進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離( CID )碎片掃描。

1.6 化學(xué)成分的鑒定

色譜及質(zhì)譜條件下，分別測定正、負(fù)離子模式下刺果番荔枝葉的總離子流圖，使用Xcalibur軟件( Thermo Fisher Scientific )對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通過一級高分辨率質(zhì)譜信息推導(dǎo)其可能的分子式，質(zhì)譜偏差范圍 δ ≤ 5×10-6。由Reaxys數(shù)據(jù)庫檢索番荔枝屬化學(xué)成分相關(guān)信息，包括化合物名稱、分子式和結(jié)構(gòu)式。根據(jù)各化合物的特征裂解規(guī)律分析鑒別化合物，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)報(bào)道對鑒別的化學(xué)成分做進(jìn)一步確認(rèn)。

2 結(jié)果

在質(zhì)譜正、負(fù)離子模式下共推測鑒定出 45 個(gè)化合物，包括16個(gè)生物堿類，14個(gè)番荔枝內(nèi)酯類，8個(gè)黃酮類和7個(gè)其他類化合物。刺果番荔枝葉在正負(fù)離子模式下質(zhì)譜的BPI圖見圖 1，45 個(gè)化合物的詳細(xì)數(shù)據(jù)見表 1。

注： ( A )正離子；( B )負(fù)離子圖1 刺果番荔枝葉 UPLC-LTQ-Orbitrap-MS質(zhì)譜基峰離子流圖

表1 刺果番荔枝葉化學(xué)成分質(zhì)譜鑒定結(jié)果

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

2.1 刺果番荔枝葉中生物堿類成分的UPLC-LTQ-Orbitrap-MS分析

在刺果番荔枝葉質(zhì)譜的正離子模式下共檢測出16個(gè)生物堿類化合物，其中包括芐基異喹啉類8個(gè)( 化合物5、7、11、13、18、19、20和21 )，阿樸啡類5個(gè)( 化合物6、8、9、22和23 )和四氫原小檗堿類生物堿2個(gè)( 化合物28和29 )。

2.1.1 芐基異喹啉類生物堿的鑒定 芐基異喹啉類生物堿的質(zhì)譜特征是C1的芐基裂解，生成四氫異喹啉離子和互補(bǔ)的芐基離子，裂解主要受氮原子支配，主要裂解方式是以氮原子為中心的 α 裂解等，且多涉及骨架的裂解[21]。利用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS技術(shù)結(jié)合化合物的裂解規(guī)律以及文獻(xiàn)報(bào)道從刺果番荔枝葉中鑒定的芐基異喹啉類生物堿有化合物5去甲烏藥堿[22]、7烏藥堿、11和20網(wǎng)狀番荔枝堿[23]與其異構(gòu)體、13和21 N-甲基烏藥堿與其異構(gòu)體、18蓮心季銨堿和19杏黃罌粟堿。

2.1.2 阿樸啡類生物堿的鑒定 阿樸啡類生物堿主要的裂解行為表現(xiàn)在B環(huán)上的逆狄爾斯-阿德爾(RDA)裂解，失去CH2= N-R基團(tuán)，R基團(tuán)可為H和CH3，即得到[M+H-29]+和[M+H-43]+離子，用以區(qū)分N上是否含有甲基[24]。從刺果番荔枝葉中鑒定的阿樸啡類生物堿有化合物6新木姜子堿、8 Apoglaziovine、9異紫堇塊莖堿、22 Lirinidine和23降月桂堿。

2.1.3 四氫原小檗堿類生物堿 四氫原小檗堿類的基本骨架是苯二亞甲基與四氫異喹啉的兩處連接，構(gòu)成一個(gè)中間有兩個(gè)脂肪環(huán)的四環(huán)系統(tǒng)，C環(huán)發(fā)生RDA裂解，生成兩個(gè)互補(bǔ)的碎片離子?；衔?8紫堇達(dá)明堿和29番荔枝寧是從刺果番荔枝葉中鑒定出的四氫原小檗堿類生物堿。

2.1.4 其他類生物堿的鑒定 除上述三種生物堿類化合物，從刺果番荔枝葉中還鑒定出一個(gè)其他類生物堿，化合物N-p-香豆酰胺 (N-p-Coumaroyltyramine)，質(zhì)譜上的分子離子峰m/z284.12903[M+H]+，推測其可能的分子式為 C17H18NO3，質(zhì)量偏差為0.910×10-6，形成m/z146.97[M+H-C8H11NO]+的基峰，經(jīng)高分辨精確分子量和碎片信息推測化合物24為N-p-香豆酰胺(N-p-Coumaroyltyramine)。

2.2 刺果番荔枝葉中黃酮類成分的UPLC-LTQ-Orbitrap-MS分析

在刺果番荔枝葉質(zhì)譜負(fù)離子模式下，鑒定出7個(gè)黃酮類化合物( 化合物12蘆丁[25]、14金絲桃苷、15山奈酚3-O-蕓香糖苷、16水仙苷、17紫云英苷、26槲皮素[26]和27山奈酚 )，此黃酮類化合物在質(zhì)譜上表現(xiàn)出的裂解規(guī)律多以糖基的丟失和苷元發(fā)生特征裂解丟失H2O、-CH3、-CO以及-OCH3等基本官能團(tuán)和發(fā)生RDA裂解。

2.3 刺果番荔枝葉中番荔枝內(nèi)酯類成分的UPLC-LTQ-Orbitrap-MS分析

番荔枝內(nèi)酯類化合物( Annonaceous acetogenins ACGs)，分子中除了1個(gè)五元內(nèi)酯環(huán)的端基外，鏈中還有1至2個(gè)四氫呋喃環(huán)，另外還含有羥基，這類化合物的質(zhì)譜碎片離子是由于四氫呋喃環(huán)或羥基引起的 α-裂解所致，所得離子還能連續(xù)失水或由內(nèi)酯環(huán)失去一氧化碳[27]。正離子模式下鑒定出14個(gè)番荔枝內(nèi)酯類化合物( 化合物31 Annoglaxin、32和34 Murihexocin B與其異構(gòu)體、35、36和37 Annomonicine與其異構(gòu)體、38番荔枝素A、39和42 Neoannonine與其異構(gòu)體、40 Corepoxylone、41異番荔枝素、43 Annonacinone、44番荔枝寧-VI和45 Corepoxylone)。

2.4 其他類成分的鑒定

通過刺果番荔枝葉的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，還鑒定出除生物堿、黃酮和番荔枝內(nèi)酯以外的化合物，如化合物1蔗糖[28]、2奎尼酸、3咖啡酸和4綠原酸。

3 討論

本文應(yīng)用 UPLC-LTQ-Orbitrap-MS 技術(shù)對刺果番荔枝葉中的化學(xué)成分進(jìn)行表征分析，通過分析高分辨精確分子量、色譜保留時(shí)間和多級質(zhì)譜碎片離子等信息，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，共鑒定出45個(gè)化合物，包括生物堿類、番荔枝內(nèi)酯類、黃酮類和其他類化合物，其中以生物堿類和番荔枝內(nèi)酯類化合物居多，與文獻(xiàn)報(bào)道的刺果番荔枝發(fā)揮主要的抗癌類成分一致。其中去甲烏藥堿和番荔枝寧據(jù)現(xiàn)代藥理研究表明具有鎮(zhèn)靜、強(qiáng)心和抗瘧活性[29-30]；番荔枝內(nèi)酯類化合物除具有神經(jīng)毒性和殺蟲效果外，還具有良好的抗腫瘤和細(xì)胞毒性作用[31]，是發(fā)揮抗癌作用的主要藥效物質(zhì)。刺果番荔枝葉中的化學(xué)成分豐富，生物活性多樣，可對其發(fā)揮藥效的作用機(jī)制深入研究。本研究為刺果番荔枝葉中化學(xué)成分的定性研究提供了一種快速準(zhǔn)確的鑒定方法，為刺果番荔枝葉的提取分離以及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了進(jìn)一步的參考。但本實(shí)驗(yàn)只是通過一級高分辨的精確分子量、二級特征碎片信息和相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)報(bào)道推斷化合物的可能裂解途徑，缺少化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品的比對，其準(zhǔn)確性有待進(jìn)一步驗(yàn)證，尤其是同分異構(gòu)體的存在。