基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的肺痹湯有效成分測(cè)定及藥代動(dòng)力學(xué)特征初探

郝慶勛 李國(guó)棟 韋婉 謝潔 焦揚(yáng)

“肺痹湯”為首都國(guó)醫(yī)名師周平安教授治療間質(zhì)性肺疾病的常用經(jīng)驗(yàn)方，可明顯改善特發(fā)性肺纖維化患者咳嗽、氣短等呼吸道癥狀，并有效地減少年平均肺部感染次數(shù)，提高生存質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期。全方以益氣解毒，化痰通絡(luò)為法，由生黃芪、金銀花、浙貝母、丹參等組成，寒熱并用，補(bǔ)中寓通，共奏益氣解毒活血、清熱化痰通絡(luò)之功效。本課題組前期在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，肺痹湯具有抗博來(lái)霉素大鼠肺纖維化作用，其主要機(jī)制可能是肺痹湯可降低博來(lái)霉素大鼠血清中細(xì)胞外基質(zhì)含量[1]；在體外實(shí)驗(yàn)中，本課題組發(fā)現(xiàn)肺痹湯及其主要成分對(duì)人胚肺成纖維二倍體細(xì)胞(medical research council cell strain 5，MRC-5)的增殖具有抑制作用[2]。為進(jìn)一步明確肺痹湯水煎劑及入血成分，本實(shí)驗(yàn)基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法技術(shù)(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)，測(cè)定肺痹湯水煎劑及灌胃大鼠體內(nèi)血藥濃度變化，研究口服肺痹湯后其主要成分在大鼠體內(nèi)的代謝變化，為該方治療間質(zhì)性肺疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為臨床合理用藥提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠19只，雌雄不限，SPF級(jí)，體重(250±20)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK(京)2016-0006，合格證號(hào)：11400700248337。所有動(dòng)物均適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后使用。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 肺痹湯的組成：生黃芪、金銀花、浙貝母、丹參、當(dāng)歸、穿山龍、生甘草，購(gòu)自北京同仁堂飲片有限責(zé)任公司，經(jīng)鑒定為正品，符合《中華人民共和國(guó)藥典》要求。肺痹湯水煎劑由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院藥房按照質(zhì)量比3∶3∶2∶2∶2∶2∶1比例，濃煎成生藥濃度為2.83 g/mL的復(fù)方制劑，置于4℃冰箱中低溫保存。檢測(cè)時(shí)將肺痹湯水煎劑稀釋4倍(取5 mL復(fù)方制劑加入15 mL超純水，置于渦旋機(jī)混勻)，取出1 mL稀釋液于EP管中，置于高速冷凍離心機(jī)內(nèi)離心處理(1400 rpm，10 min，4℃)，離心完畢后取80 μL上清液進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品：芒柄花甘(批號(hào)：OB12877)，綠原酸(批號(hào)：OB12831)，貝母素乙(批號(hào)：OB12894)，甘草酸(批號(hào)：OB12897)，甘草苷(批號(hào)：OB12809)，薯蕷皂苷(批號(hào)：OB12823)，丹酚酸B(批號(hào)：OB12871)，環(huán)黃芪醇(批號(hào)：OB12803)，丹參酮IIA(批號(hào)：OB12852)，肉桂酸(批號(hào)：OB12834)，均購(gòu)自北京歐北生物科技有限公司，純度均≥98%。乙腈、甲酸為色譜純；甲醇為分析純(美國(guó)Fisher公司)。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2.2 儀器 UPLC分析檢測(cè)肺痹湯水煎劑(美國(guó)Waters SYNAPT G2儀)；UPLC分析檢測(cè)肺痹湯灌胃大鼠含藥血漿(美國(guó)Waters ACQUITYUPLC儀)；渦旋振蕩器(型號(hào)VORTEX-5)；R200D型電子分析天平(德國(guó)Sartorius公司)；UV型超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)；ME235S電子分析天平(德國(guó)Sartourious公司)；高速冷凍離心機(jī)(型號(hào)：Centrifuge 5427 R，上海年悅儀器公司)；可視氮吹儀(型號(hào)KD200，上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司)；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，20 mL、100 mL Research plus移液槍(德國(guó) Eppendorf公司)。

1.3 溶液的制備

標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備：天平精準(zhǔn)稱量甘草苷、甘草酸、貝母素乙、環(huán)黃芪醇、綠原酸、芒柄花甘、肉桂酸、丹酚酸并用純甲醇溶解，配成標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，再用甲醇溶液稀釋成1600 ng/mL、800 ng/mL、400 ng/mL、200 ng/mL、100 ng/mL、50 ng/mL、20 ng/mL、5 ng/mL、1 ng/mL的工作液，貯藏在4℃冰箱中冷藏待用。

1.4 色譜條件

1.4.1 肺痹湯水煎劑檢測(cè)色譜條件 以0.1‰甲酸-水(A)和乙腈(B)為流動(dòng)相，分離色譜柱為ACQUITY UPLC?BEH C18 (2.1 mm×50 mm，1.7 μm)。柱溫45℃，流速0.4 mL/min，進(jìn)樣體積2 μL。梯度洗脫程序?yàn)椋?～10 min，5%→20% B；10～15 min，20%→95% B；15～20 min，95% B；20.1～25 min，5% B。

1.4.2 肺痹湯灌胃大鼠含藥血漿檢測(cè)色譜條件 以0.1‰甲酸-水(A)和甲醇(B)為流動(dòng)相，分離色譜柱為ACQUITY UPLC?BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)。柱溫40℃，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣體積2 μL。梯度洗脫程序?yàn)椋?～1 min，5% B；1～3 min，5%→50% B；3～4 min, 50%→95% B；4～5 min，95% B。

1.5 質(zhì)譜條件

1.5.1 肺痹湯水煎劑檢測(cè)質(zhì)譜條件 質(zhì)譜分析使用UPLC-Q-TOF質(zhì)譜儀。實(shí)驗(yàn)參數(shù)：毛細(xì)管電壓2.7 kV，離子源溫度120℃，錐孔電壓：40 V，脫溶溫度400℃，脫溶氣體流量800 L/h。

1.5.2 肺痹湯灌胃大鼠血漿檢測(cè)質(zhì)譜條件 質(zhì)譜分析使用Xevo TQ-S質(zhì)譜儀(Waters，Milford，MA，USA)。實(shí)驗(yàn)參數(shù)：毛細(xì)管電壓2.5 kV，脫溶溫度400℃，脫溶氣體流量800 L/h，錐形氣體流150 L·h-1，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)的質(zhì)譜掃描方式；測(cè)定芒柄花甘檢測(cè)離子；m/z 475.1583-267.1373；甘草苷檢測(cè)離子：m/z 417.2221-255.1298；綠原酸檢測(cè)離子：m/z 353.1908-191.1373；內(nèi)標(biāo)的檢測(cè)離子：m/z 147.2119-103.1623；用進(jìn)樣器取20 μL供試品，注入高效液相儀。每種分析物的碰撞能量和錐電壓根據(jù)多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)設(shè)定。定量數(shù)據(jù)由Waters Mass Lynx TM Software 4.1獲取和處理。

1.6 肺痹湯灌胃大鼠血漿制備

1.6.1 單次給藥組 SD大鼠19只，隨機(jī)選取7只作為單次給藥組，實(shí)驗(yàn)前12小時(shí)禁食，自由飲水。按10 mL/kg給大鼠以肺痹湯水煎劑灌胃。單次給藥組灌胃1次后開始采血。于灌胃后0 h、0.25 h、0.5 h、0.75 h、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h經(jīng)股動(dòng)脈插管采血0.5 mL，共12次，放置于肝素化EP管中，以4000 rpm于高速冷凍離心機(jī)中離心10分鐘，完畢后取上層血漿200 μL，放置于-20℃冰箱待測(cè)。

1.6.2 給藥7天組 SD大鼠19只，隨機(jī)選取7只作為給藥7天組，實(shí)驗(yàn)前12小時(shí)禁食，自由飲水。按10 mL/kg給大鼠以肺痹湯水煎劑灌胃，連續(xù)給藥7天，每日1次。于第7次灌胃后0 h、0.25 h、0.5 h、0.75 h、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h經(jīng)股動(dòng)脈插管采血0.5 mL，共12次，放置于肝素化EP管中，以4000 rpm于高速冷凍離心機(jī)中離心10分鐘，完畢后取上層血漿200 μL，放置于-20℃冰箱待測(cè)。

1.6.3 空白對(duì)照組 SD大鼠19只，隨機(jī)選取5只，灌胃等量生理鹽水7天，末次灌胃后1小時(shí)經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，每只采血量約5 mL，室溫下靜置4小時(shí)后離心(4℃，4000 rpm，15 min)，分離上清液約20 ml，放置于-20℃冰箱待測(cè)。

1.7 血漿樣品處理方法

室溫下融化血漿樣品，精確吸取100 μL樣品，加入20 μL內(nèi)標(biāo)肉桂酸溶液，渦旋混勻，再加入300 μL甲醇沉淀蛋白，將沉淀蛋白后溶液置于離心機(jī)中，以14000 rpm離心10 min，取上清液，于30℃氮吹儀中氮?dú)獯蹈桑?00 μL甲醇復(fù)溶，渦旋混勻后，與高速冷凍離心機(jī)中以14000 rpm離心10 min，取上清液進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。

1.8 方法學(xué)質(zhì)控樣品制備

1.8.1 精密度與重復(fù)性質(zhì)控樣品制備 分別制備芒柄花甘、綠原酸、甘草苷的低、中、高濃度為20、200和1200 ng/mL 的血漿質(zhì)控樣品，按照血漿樣品處理方法準(zhǔn)確處理樣品，每個(gè)濃度分別平行制備3份，重復(fù)3個(gè)批次。根據(jù)每批的當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算質(zhì)控樣品所測(cè)定濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值(relative standard deviation，RSD)，從而考察精密度與重復(fù)性。

1.8.2 基質(zhì)效應(yīng)與回收率質(zhì)控樣品制備 分別制備芒柄花甘、綠原酸、甘草苷的低、中、高濃度分別為20、200和1200 ng/mL的血漿質(zhì)控樣品，按照血漿處理方法，每個(gè)濃度分別平行制備3份，以低、中、高3個(gè)濃度的大鼠血漿樣品測(cè)得的峰面積與大鼠空白血漿經(jīng)蛋白沉淀處理后加入相應(yīng)濃度的對(duì)照品溶液的峰面積之比，計(jì)算回收率RSD值。以上述大鼠空白血漿加入對(duì)照品溶液的峰面積與對(duì)應(yīng)濃度的對(duì)照品溶液的峰面積之比，計(jì)算方法的基質(zhì)效應(yīng)RSD值。

1.8.3 穩(wěn)定性質(zhì)控樣品制備 分別制備芒柄花甘、綠原酸、甘草苷的低、中、高濃度分別為20、200和1200 ng/mL的血漿質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度分別平行制備6份，按照血漿處理方法，將處理好的質(zhì)控樣品于室溫下分別放置0 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h，按照血漿檢測(cè)色譜的條件分別上機(jī)檢測(cè)，記錄峰面積并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所得血藥濃度—時(shí)間數(shù)據(jù)以Phoenix WinNonlin 7.5軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，由 Microsoft excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和制圖。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

分別取100 μL空白大鼠血漿依次加入100 μL濃度為1、5、20、50、200、400、800、1600 ng/mL的系列混合對(duì)照品溶液和20 μL內(nèi)標(biāo)溶液，按照血漿樣品處理方法對(duì)樣品進(jìn)行處理和測(cè)定，每個(gè)濃度平行制備3份樣品，每條標(biāo)準(zhǔn)曲線包含8個(gè)濃度。分別以對(duì)照品濃度(X)為橫坐標(biāo)，以對(duì)照品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(Y)為縱坐標(biāo)，用加權(quán)(1/C)最小二乘法進(jìn)行線性回歸，建立各成分在大鼠血漿中的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:芒柄花甘血漿藥物濃度的回歸方程為：y=34.3544x+665.491，r=0.996；綠原酸回歸方程：y=61.4076x+18187.6，r=0.998；甘草苷回歸方程：y=134.778x+362.923，r=0.995；(權(quán)重=1/X2)。線性范圍為1～1600 ng/mL。定量下限為1 ng/mL。

2.2 方法學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將“1.8”中各組血漿質(zhì)控樣品按照相應(yīng)方法條件檢測(cè)后，得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見表1。

2.3 肺痹湯及血漿質(zhì)量控樣品檢測(cè)圖譜

取上述肺痹湯水煎劑上清液，空白血漿上清液，含藥血漿上清液按條件進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，通過將肺痹湯水煎劑與“1.1”中制備的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量比對(duì)后，共得出9種有效成分，包括甘草苷、甘草酸、綠原酸、丹參酮、芒柄花甘、貝母素乙、環(huán)黃芪醇、丹酚酸B、薯蕷皂苷。色譜圖見圖1。

表1 方法學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將大鼠灌胃7天的含藥血漿圖譜與“1.3”制備的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照液進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量比對(duì)后，得出3種入血成分，分別是：芒柄花苷、綠原酸、甘草苷。對(duì)比后發(fā)現(xiàn)三種化合物的表達(dá)時(shí)間分別是：芒柄花甘為9.1分鐘，綠原酸為1.19分鐘，甘草苷為5.1分鐘，空白血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)及其他雜質(zhì)不干擾血漿樣品的測(cè)定，其他峰可能為代謝產(chǎn)物。色譜圖見圖2。

2.4 大鼠含藥血漿藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

2.4.1 單次給藥組 單次給藥組的血漿，按照血漿樣品條件進(jìn)行處理，計(jì)算血藥濃度，通過Phoenix WinNonlin 7.5軟件計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表2。

表2 單次給藥組藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.4.2 給藥7天組 給藥7天組的血漿，按照血漿樣品條件進(jìn)行處理，計(jì)算血藥濃度，通過Phoenix WinNonlin 7.5軟件計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表3。

注：A甘草苷；B甘草酸；C綠原酸；D丹參酮；E芒柄花甘；F貝母素乙；G環(huán)黃芪醇；H丹酚酸B；I薯蕷皂苷?qǐng)D1 肺痹湯水煎劑九種有效成分圖譜

注：A大鼠空白血漿；B大鼠灌胃7天血漿。圖2 大鼠空白血漿和大鼠灌胃7天血漿圖譜

表3 給藥7天組藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

3 討論

目前中藥血清藥理學(xué)研究主要針對(duì)單味藥，以中藥復(fù)方為研究對(duì)象的尚不多見。在臨床工作中，中藥治療間質(zhì)性肺疾病療效肯定[3]。本課題組的前期研究表明，肺痹湯含藥血清可抑制成纖維細(xì)胞的增殖，減少TGF-β1的分泌，阻斷TGF-β1/Smad信號(hào)通路，從而減少膠原的合成與分泌，減輕纖維組織的增生[2]。肺痹湯方中以生黃芪為君，具有補(bǔ)肺益氣，益衛(wèi)固表功效；金銀花為臣，辛散宣透，清熱解毒，通絡(luò)散結(jié)，切合肺纖維化肺絡(luò)痹阻的病機(jī)；生黃芪、當(dāng)歸相配伍補(bǔ)氣行血，益氣以行血通絡(luò)；浙貝母可清熱化痰，散結(jié)開郁；丹參活血祛瘀，安神除煩；穿山龍祛風(fēng)除濕，止咳化痰，活血通絡(luò)，諸藥配伍可益氣解毒，化痰通絡(luò)。處方中生黃芪主要成分之一為芒柄花甘，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，拮抗病毒作用[4-5]；金銀花主要成分為綠原酸，具有抗菌抗病毒，抗炎解熱作用[6-7]；生甘草中甘草苷具有鎮(zhèn)咳平喘、抗炎、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能作用[8-9]。有關(guān)實(shí)驗(yàn)表明穿山龍主要成分薯蕷皂苷元可以降低MRC-5細(xì)胞增殖，起到抗纖維化作用[10]。肺痹湯經(jīng)過多年臨床實(shí)踐，可明顯改善特發(fā)性肺纖維化患者咳嗽、氣短等呼吸系統(tǒng)相關(guān)癥狀，有效地改善了患者的生存質(zhì)量[11-12]。

LC-MS是現(xiàn)代藥物研究中不可或缺的技術(shù)，尤其以分離度高、靈敏度高、專屬性強(qiáng)、速度快等優(yōu)勢(shì)廣泛應(yīng)用于中藥化學(xué)成分的研究。在前期的臨床與實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)上，本研究為進(jìn)一步明確肺痹湯有效物質(zhì)基礎(chǔ)，參照生物利用度和生物等效性試驗(yàn)的指導(dǎo)原則及相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法，建立了LC-MS方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肺痹湯中的生黃芪、金銀花、生甘草等藥物的有效成分可以在大鼠血漿中測(cè)出，可見，本方的臨床療效具有明確的藥物化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了肺痹湯中相關(guān)成分的檢測(cè)條件，在ESI離子化方式下，芒柄花甘、綠原酸、甘草苷在負(fù)離子模式檢測(cè)的響應(yīng)高于正離子模式下的響應(yīng)。此方法便于快速檢測(cè)灌胃復(fù)方后的大鼠體內(nèi)肺痹湯的有效成分。在對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)處理時(shí)，由于肺痹湯檢測(cè)成分都為水溶性的物質(zhì)，極性較大，查閱相關(guān)資料發(fā)現(xiàn)，水溶性大的物質(zhì)若采用液-液萃取的方法其提取率較低，本實(shí)驗(yàn)使用甲醇蛋白沉淀的方法方便快速，可以得到較為理想的質(zhì)譜響應(yīng)。

本研究為肺痹湯藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為進(jìn)一步開展治療機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。通過藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析后可知，給藥7天組與單次給藥組比較，AUC0-t、Cmax明顯增高，MRT0-t顯著升高，t1/2顯著延長(zhǎng)，CLz/F明顯減少。由此推論，肺痹湯多次給藥可以提高復(fù)方有效成分在體內(nèi)暴露量，所以在臨床上肺痹湯治療間質(zhì)性肺疾病適宜長(zhǎng)期服用，從而增加有效成分在體內(nèi)的蓄積，更好地發(fā)揮治療作用。