馬錢子對斑馬魚幼魚肝臟毒性的初步研究

趙霞 趙崇軍 魏紫櫻 韓志偉 鄒迪新 林瑞超

馬錢子在歷代應(yīng)用中發(fā)揮著重要的作用，有效亦有毒，馬錢子中毒事件時有發(fā)生，嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用[1-2]。馬錢子歸肝經(jīng)，有文章報道長期服用可導(dǎo)致肝腎功能異常。因此本試驗主要利用斑馬魚模型研究馬錢子肝毒性機(jī)制[3-4]。在前期研究中，主要是利用斑馬魚的肝臟表型對由馬錢子的肝臟毒性進(jìn)行了定性評價[5]，本研究的目的是利用斑馬魚肝臟形態(tài)、肝功能、生理參數(shù)及肝臟毒性相關(guān)基因的表達(dá)水平來定量評價馬錢子對斑馬魚肝臟的影響。這是首次對斑馬魚中馬錢子誘導(dǎo)的肝毒性進(jìn)行初步、系統(tǒng)的研究，可為馬錢子的肝毒性機(jī)制提供有價值的見解。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

動物：AB系斑馬魚，購自中國斑馬魚資源中心(武漢)，飼養(yǎng)于本實驗室循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)。

儀器：蔡司體視熒光顯微鏡(Zeiss Axio Zoom V16)，LRH-250Z型恒溫生化培養(yǎng)箱(廣州滬瑞明儀器有限公司)，RJLDL-50G型離心機(jī)(無錫瑞江分析儀器有限公司)，微型漩渦混懸(WH-90A，上海振榮科學(xué)儀器有限公司)，滅菌鍋(MLS-3751L，日本panasonic公司)，Epoch 酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)，UV-2000紫外-可見分光光度計(尤尼柯上海儀器有限公司)，HQ10-20H超純水儀(長沙聚豐環(huán)?？萍加邢薰?，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(北京東方科技發(fā)展有限公司)，凝膠電泳(NanoDrop 2000)，CFX96 Touch Systems (bio-rad, USA)，TransStart Top Green qPCR Super Mix (TransGen Biotech)。

材料：馬錢子(編號#160611)由安國圣山藥業(yè)有限公司提供。油紅O(s19039-100g)，吖啶橙(s47568-5g)，4%多聚甲醛(p1110)購置于北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司。SOD試劑盒(A001-3)、CAT試劑盒(A007-1)、AST試劑盒(C010-2)、ALT試劑盒(C009-2)、MDA試劑盒(A003-4)均購置于南京建成生物工程研究所，Bradford蛋白定量試劑盒(W042)(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司)。PBS緩沖液(21-040-CVR)(Corning，美國)。M3-氨基苯甲酰胺麻醉(MESAB-22)購置于美國密蘇里州圣路易斯西格瑪奧德里奇公司。H2O2購于北京化工廠，甲酰胺，SSC緩沖液(pH=7.0)購于北京生物技術(shù)有限公司。1，2-丙二醇溶液(中國廣東西龍科學(xué)有限公司)。RNA保護(hù)液、TaKaRa Mini BEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒均購于日本Takara，(Takara，日本東京)。FastKing RT試劑盒(北京天根生化科技有限公司)。斑馬魚特異性PCR(北京博基因技術(shù)有限公司)。NaCl、KCl、CaCl2、Na2HPO4、K2HPO4、MgSO4、NaHCO3均為分析純，購置于北京化工，移液器(德國Eppendorf公司)，12孔板(Corning，美國)。

1.2 斑馬魚

本實驗中進(jìn)行的所有斑馬魚相關(guān)實驗都是根據(jù)《中華人民共和國科技部動物管理辦法》，并經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)后所進(jìn)行的。斑馬魚培養(yǎng)條件為：暗/光周期為10：14小時。水產(chǎn)養(yǎng)殖條件需要控制[溫度(28.5±0.5)℃，pH值7.0～7.4,導(dǎo)電率480～510 μS/cm，硬度50～70 mg/L(CaCO3)]。斑馬魚胚胎是以1∶1的雌雄比(5～8月齡)自然配對交配產(chǎn)生，28.5℃下在胚胎培養(yǎng)水中進(jìn)行孵育，并且實驗開始前需在蔡司立體熒光顯微鏡下取出死亡和未受精的胚胎。

1.3 樣本的制備

馬錢子(50.0 g)粉碎后過40目篩，用10倍量蒸餾水加熱回流提取2小時。過濾后，將殘渣用蒸餾水重復(fù)上述操作提取2次，每次1小時。3次回流上清液混合，過濾、離心(3000g)30分鐘，采用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對上清液進(jìn)行減壓濃縮。并在室溫下真空干燥。獲得的干燥提取物在干燥器中保存直到使用為止。使用時用胚胎培養(yǎng)水將提取物復(fù)溶，配置成實驗所需母液(400 μg/mL)，然后稀釋至工作濃度。

1.4 斑馬魚暴露

選取健康正常的3天的斑馬魚幼魚，置于12孔微板中，每孔20條。4天時，快速吸取胚胎培養(yǎng)水并加入4 mL不同濃度的暴露液。對照組均用等量的新鮮胚胎水平行處理。為了保證實驗結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性，每個濃度設(shè)置2個重復(fù)孔，每個培養(yǎng)板由5個劑量組和1個對照組組成。如果對照組胚胎的死亡或畸形率>10%，則該實驗認(rèn)為無效而終止。實驗暴露過程中的溫度、濕度、光周期等外界條件與培養(yǎng)環(huán)境相同。

1.5 量毒曲線評價

為了建立致死曲線，在實驗暴露終點，對不同處理組中存活的斑馬魚進(jìn)行計數(shù)。實驗重復(fù)了三次。得到死亡率曲線，并用Logistic回歸分析計算LC10(SPSS統(tǒng)計為Windows，Version 17.0)。

1.6 肝臟形態(tài)和生理參數(shù)的評估

在亞致死濃度條件下(

參考已發(fā)表文章，以超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)活性及丙二醛(malondialdehyde，MDA)等肝功能指標(biāo)及相關(guān)生理指標(biāo)確認(rèn)馬錢子對斑馬魚幼魚的肝毒性[6-7]。在暴露終點，從不同處理組中隨機(jī)抽取80條斑馬魚，用清水洗兩次，轉(zhuǎn)移到1.5 mL升離心管中；將斑馬魚置于冰水中進(jìn)行安樂死，每個樣品加10倍體積PBS冰浴勻漿，離心(3000g，10分鐘)。收集上清液，根據(jù)相應(yīng)檢測試劑盒中提供的指示測定上清液中SOD、CAT、ALT、AST活性及MDA含量，整個實驗至少重復(fù)三次。

1.7 油紅O染色觀察肝臟脂肪

在實驗暴露終點，用胚胎水沖洗兩次，固定在4%多聚甲醛中，4℃條件下過夜。隨后PBS洗滌，用含6 mL無菌水、3.3 mL 30%的H2O2、0.5 mL甲酰胺和0.25 mL SSC緩沖液(pH=7.0)的溶液處理。隨后，PBS中洗滌后，依次在85%和100%的1，2-丙二醇溶液中浸泡10分鐘，然后在0.5%新配置的油紅O中并在室溫黑暗中過夜染色。隨后，將斑馬魚分別用100%和85%的1，2-丙二醇洗30分鐘左右，再用PBS洗兩次。斑馬魚在80%的1，2-丙二醇中貯藏，顯微鏡明亮視野成像拍攝。油紅O染色的所有步驟在室溫下慢速搖床上進(jìn)行。當(dāng)肝臟與周圍組織之間有明顯的細(xì)線且肝臟內(nèi)可見3個以上的脂滴時，認(rèn)為該結(jié)果為脂肪變性陽性[8-9]。

1.8 吖啶橙染色觀察凋亡細(xì)胞

吖啶橙染色法被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞凋亡檢測，可用于檢測斑馬魚幼魚中的凋亡細(xì)胞[10]。將暴露處理后的幼魚用胚胎水沖洗三次，并暴露在含5 μg/mL吖啶橙的胚胎水中，避光處理20分鐘。去除吖啶橙溶液后，用PBS溶液沖洗2次后，將斑馬魚樣本置于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.9 RNA提取與實時定量PCR(Q-RT-PCR)檢測

樣品制備：每組隨機(jī)抽取40條斑馬魚，用胚胎水沖洗2次，轉(zhuǎn)移到含有1 mL RNA保護(hù)液的1.5 mL離心管中，儲存在-20℃。用TaKaRa Mini BEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒提取總RNA。通過凝膠電泳和紫外分光度計檢測RNA的完整性。采用FastKing RT試劑盒將各組等量的總RNA樣本逆轉(zhuǎn)錄至cDNA。采用CFX96 Touch Systems與TransStart Top Green qPCR Super Mix 進(jìn)行實時定量PCR分析。所有步驟均按照制造商提供的不同試劑盒說明進(jìn)行。用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計了斑馬魚特異性PCR引物。兩步PCR擴(kuò)增協(xié)議如下：95°C 3分鐘，60°C循環(huán)40次，20秒，95°C 15秒，60°C 10秒，95℃ 15秒。見表1。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 急性毒性評價

在實驗暴露終點，通過統(tǒng)計不同處理組中存活的斑馬魚數(shù)目來計算其死亡率，進(jìn)而獲得馬錢子對斑馬魚幼魚的量毒曲線。結(jié)果表明200 μg/mL或更高濃度馬錢子處理24小時后，斑馬魚全部死亡。80 μg/mL以下暴露致斑馬魚的死亡率接近0%，對照組死亡率最低(死亡率<10%)。不同處理組中斑馬魚幼魚的死亡率如圖1顯示。結(jié)果表明，隨著暴露濃度的增加，斑馬魚幼魚的死亡率呈濃度依賴性增加。由于劑量效應(yīng)，根據(jù)死亡率曲線計算得到馬錢子對斑馬魚幼魚LC10為76.523 μg/mL。見圖1。

2.2 馬錢子對肝臟形態(tài)學(xué)的影響

通過三個特定的表型終點(肝臟變性，肝臟大小的變化和卵黃囊保留)來評估肝毒性[11]。對照組中可明顯觀察到斑馬魚肝臟與周圍組織的邊界清晰，肝臟灌注循環(huán)血細(xì)胞，見圖2(d)。與對照組相比，馬錢子誘導(dǎo)使肝臟變暗，肝組織輪廓模糊，表明肝臟變性和/或壞死[12]。見圖2。

圖1 不同濃度馬錢子提取物處理24小時后斑馬魚幼魚的量毒曲線

2.3 肝臟表型的定量分析

每個實驗條件下用20條斑馬魚幼魚評價肝臟面積和光密度，通過肝臟大小和光密度的變化來定量評價馬錢子的肝臟毒性?？瞻讓φ战M及不同濃度藥液處理24小時后，在暴露終點，隨著濃度的增加，處理組中肝臟面積和光密度呈濃度依賴性增加，并且與對照組相比具有顯著差異(P<0.01)。見表2。

注：(a)馬錢子暴露組斑馬魚幼魚肝臟組織退化，卵黃囊保留；(b)馬錢子暴露組斑馬魚幼魚肝臟腫大；(c)馬錢子暴露組斑馬魚幼魚肝臟顏色較深；(d)空白對照組肝臟清晰、健康。L：肝臟；Y：卵黃囊圖2 馬錢子提取物處理斑馬魚幼魚24小時后肝臟形態(tài)學(xué)變化(×50)

表2 馬錢子處理24小時后斑馬魚幼魚肝臟表型(肝臟面積和光密度)

注： 與空白對照組比較，表示aP<0.01。

2.4 酶活性測定

每個實驗條件下用80條斑馬魚評價肝功能和生理參數(shù)，為進(jìn)一步評估肝臟損害，在實驗暴露終點，利用試劑盒對肝功能(ALT/GPT，AST/GOT)，和一系列的生化指標(biāo)(MDA，SOD，CAT)進(jìn)行評價[15-16]。與對照組相比，中、高劑量組CAT活性下降，并具有極顯著差異(P<0.01)，低劑量組CAT酶活性有顯著差異(P<0.05)。與對照組相比，馬錢子暴露組中SOD活性低于對照組，并具有極顯著差異(P<0.01)。與對照組相比，中、高劑量組MDA活性升高，并具有極顯著差異(P<0.01)，低劑量組MDA活性升高，有顯著差異(P<0.05)。與對照組相比，中、高劑量組ALT/GPT活性升高，并具有極顯著差異(P< 0.01)。低濃度處理對ALT/GPT 活性無明顯影響。與對照組相比，馬錢子暴露組AST/GOT活性高于對照組，并具有極顯著差異(P<0.01)。見表3。

2.5 全脂油紅O染色和吖啶橙染色

油紅O能與斑馬魚幼魚中性脂結(jié)合[13]。染色結(jié)果顯示，處理組肝臟中的脂質(zhì)含量與對照組相比有顯著性差異，見圖3(a)，表明用馬錢子處理的幼魚發(fā)生了脂肪變性，見圖3(b)黑色箭頭。

吖啶橙作為一種異色染料，可與凋亡細(xì)胞中的DNA發(fā)生反應(yīng)，發(fā)出綠色熒光，通過這種熒光可以有效快速地識別凋亡細(xì)胞的確切區(qū)域，因此被廣泛用于檢測包括斑馬魚模型在內(nèi)的不同組織中的細(xì)胞凋亡[14]。如早期研究所述，低濃度的馬錢子提取物可引起斑馬魚幼體細(xì)胞凋亡(

2.6 氧化應(yīng)激與馬錢子肝毒性的關(guān)系

越來越多的證據(jù)表明氧化應(yīng)激損傷與中草藥相關(guān)肝損傷(herb-induced liver injury，HILI)的發(fā)生密切相關(guān)。實時定量PCR(Q-RT-PCR)結(jié)果表明，和空白對照組相比，馬錢子暴露處理能夠顯著引起超氧化物歧化酶1(superoxidedismutase1，sod1)、醌氧化還原酶1(nad(p)hquinoneoxidoreductase1，nqo1)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P 2(glutathiones-transferasep2，gstp2)、B細(xì)胞淋巴瘤2(b-celllymphoma-2，bcl-2)基因表達(dá)水平呈濃度依賴性降低，具有顯著性(見表4)，而谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P 2(glutathiones-transferasep2，gstp2)基因的表達(dá)水平僅以濃度方式降低，該結(jié)果與前期研究是極其相似的。然而，暴露對線粒體解偶聯(lián)蛋白2基因(uncouplingprotein2，ucp2)的表達(dá)水平無顯著影響。見表4。

2.7 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因與馬錢子致肝毒性的關(guān)系

細(xì)胞凋亡是各種急、慢性肝損傷發(fā)生后期的共同特征。研究表明，線粒體凋亡途徑受BCL-2家族[17]的調(diào)控。bcl-2和骨髓細(xì)胞白血病-1B基因(myeloidcellleukemia-1b，mcl-1b)是抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞存活的兩個關(guān)鍵基因。BH3互動死亡激動劑基因(recombinantBH3interactingdomaindeathagonist，bid)和BCL 2關(guān)聯(lián)X蛋白基因(Bcl 2associatedX,apoptosisregulator，bax-2)對細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用。Q-RT-PCR結(jié)果表明，與空白對照組相比，馬錢子處理可使bid表達(dá)增加4至6倍，mcl-1b則可增加1至2倍，引起bid和mcl-1b基因表達(dá)水平的提高，bax-2表達(dá)水平下降，bcl-2表達(dá)水平無明顯變化(P>0.05)。見表5。

表3 馬錢子處理24小時后對斑馬魚幼魚肝臟功能和生理參數(shù)的影響

注： 與空白對照組比較，aP<0.01，bP<0.05。

注：(a)空白對照組油紅O染色；(b)30 μg/mL馬錢子提取物暴露組油紅O染色。脂肪變性(黑色箭頭，30×)；(c)空白對照組吖啶橙染色；(d)30 μg/mL馬錢子提取物暴露組吖啶橙染色。圖3 油紅O染色和吖啶橙染色(×50)

表4 空白對照組及不同濃度給藥組處理24小時后斑馬魚幼魚氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的變化

注： 與空白對照組比較，aP<0.01。

表5 空白對照組及不同濃度給藥組處理24小時后斑馬魚幼魚細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的變化

注：與空白對照組比較，aP<0.01，bP<0.05。

表6 空白對照組及不同濃度給藥組處理24小時后斑馬魚幼魚脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的變化

注：與空白對照組比較，aP<0.01，bP<0.05。

2.8 脂質(zhì)代謝相關(guān)基因與馬錢子致肝毒性的關(guān)系

為了從基因水平了解馬錢子的肝臟毒性機(jī)制，應(yīng)用Q-RT-PCR技術(shù)檢測肝組織脂肪代謝和纖維化相關(guān)基因的表達(dá)水平，包括肝纖維化相關(guān)基因成纖維細(xì)胞活化蛋白α基因(fibroblastactivationproteinalpha，fabp)、瘦素受體基因(leptinreceptor，lepr)、視黃醇結(jié)合蛋白4基因(retinolbindingprotein4，rbp4)、轉(zhuǎn)化生長因子基因(transforminggrowthfactorbeta1，tgf-β1)及其受體轉(zhuǎn)化生長因子β受體2基因(transforminggrowthfactorbetareceptor2，tgf-βr2)的表達(dá)，結(jié)果見表6。研究結(jié)果表明，與空白對照組相比，隨著馬錢子濃度的增加，tgf-β1表達(dá)水平呈上升趨勢，并且具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.0 5)。與tgf-β1類似，低、中劑量組中rbp4表達(dá)水平顯著升高(P<0.0 1)。 而馬錢子暴露導(dǎo)致3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coareductase，hmgcra)表達(dá)水平呈濃度依賴性降低，并具極顯著差異(P<0.0 1)。此外，高濃度處理可導(dǎo)致大多數(shù)基因表達(dá)水平下降。 結(jié)果提示肝脂肪變性和纖維化可能與調(diào)節(jié)tgf-β1、rbp4和hmgcra的表達(dá)有關(guān)。

3 結(jié)論

近年來，馬錢子的生物活性作用及活性成分的研究較多，對馬錢子毒性機(jī)制的研究較少。本研究首次報道了馬錢子的體內(nèi)肝臟毒性機(jī)制，結(jié)果表明，馬錢子誘導(dǎo)可破壞斑馬魚的抗氧化防御系統(tǒng)，擾亂脂肪代謝平衡，引起細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致肝臟損傷。本研究首次證實了斑馬魚肝臟毒性研究的有效性和可預(yù)測性，為馬錢子的肝毒性研究提供了補(bǔ)充資料。然而，心臟等其他重要器官對馬錢子肝臟毒性作用的影響，馬錢子肝毒性機(jī)制在斑馬魚與哺乳動物之間的物種保守性還有待進(jìn)一步研究。在未來，我們將采用一種基于組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)的方法來研究馬錢子的系統(tǒng)生物學(xué)特性、中草藥化學(xué)特性與生物學(xué)特性的關(guān)系。

最近，越來越多的報道表明，HILI評價的最佳策略是建立一個完整的評估體系和一個合適的動物模型來預(yù)測藥物潛在的肝毒性[18]，斑馬魚幼魚可為HILI[19-20]的篩選策略提供極大的附加值?？傊?，它可以作為體內(nèi)模型和體外模型之間的橋梁，將完整的生物復(fù)雜性和高通量篩選能力結(jié)合起來[21]。

本研究首次利用斑馬魚評估了馬錢子的急性毒性。在亞致死濃度(

最后，通過檢測相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平對馬錢子的肝毒性機(jī)制進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明抗氧化和解毒酶基因[26]，比如sod1、bcl-2、gstp2和nqo1基因的表達(dá)水平發(fā)生顯著下調(diào)，進(jìn)一步證實馬錢子的肝毒性部分是由于抗氧化活性紊亂所致。此外，bid基因的表達(dá)水平發(fā)生顯著上調(diào)。相反，mcl-1b基因的表達(dá)水平增加，這可能是自我保護(hù)表達(dá)的結(jié)果，但其表達(dá)增加水平遠(yuǎn)低于bid基因的表達(dá)量，說明斑馬魚的自我保護(hù)能力遠(yuǎn)不能阻止細(xì)胞的凋亡過程。此外，tgf-β1和rbp4基因的表達(dá)水平呈現(xiàn)出濃度依賴性增加的趨勢，而hmgcra基因表達(dá)水平下降。此外，高濃度處理使大多數(shù)基因表達(dá)水平下降。提示肝組織脂肪變性和纖維化可能與上調(diào)肝組織tgf-β1基因的表達(dá)有關(guān)，因此，馬錢子對斑馬魚幼魚的肝毒性可能是通過脂肪變性、纖維化-凋亡途徑介導(dǎo)的。